吉姆薩染色法對大腦組織凋亡細胞的染色

1、于4孵育過夜。然后分別用FITC標記的山羊抗小鼠Ig G及羅丹明標記的山羊抗小鼠Ig G抗體(北京中山生物技術有限公司孵育1h。隨機選取20個視野于熒光顯微鏡下觀察,免疫熒光染色陽性細胞為心肌細胞,計數(shù)并攝像。同一視野于普通光條件下計數(shù)細胞總數(shù),計算心肌細胞純度。2結果2.1細胞存活率測定臺盼藍染色觀察僅5%細胞著色,細胞存活率達95%以上。2.2心肌細胞形態(tài)學觀察剛接種的心肌細胞尚未貼壁,呈圓形,懸浮于培養(yǎng)液中。812h換培養(yǎng)液時,部分心肌細胞已貼壁生長,并出現(xiàn)自發(fā)性搏動,搏動頻率較慢,有的每分鐘僅數(shù)次。24h后觀察細胞已全部貼壁,貼壁后為梭形,菱形或多角形(圖1,90%開始搏動。繼而細胞逐

2、漸在皿底表面鋪展,并伸出偽足,形成不規(guī)則的星形并相互接觸交織成網,在培養(yǎng)第48h可形成呈放射狀排列的細胞簇(圖2,其搏動已同步化,每分鐘120次左右。培養(yǎng)90d仍可見到成團搏動的心肌細胞。2.3心肌細胞純度鑒定分別用心肌特異性M HC/、Tn I 抗體免疫熒光檢測均證明心肌細胞純度達95%以上,并可見明顯的心肌特異性橫紋結構(圖3,圖4。3討論3.1消化過程是影響心肌細胞存活率的重要因素胰蛋白酶可分解組織間質的蛋白成分,但對肌細胞膜蛋白亦起較強的破壞作用1,故對其作用時間和濃度的要求較為嚴格。而每次實驗都可能有細微差別,所以應結合肉眼觀察消化情況及時終止消化,不宜固定精確的消化時間。膠原酶可消

3、化細胞間質的膠原纖維以釋放細胞1,作用較緩和,對細胞損傷較小。本實驗室的多年經驗認為單一使用胰蛋白酶消化對細胞損傷大,聯(lián)合使用膠原酶將膠原纖維充分消化后利于離心時細胞沉淀,提高心肌細胞存活率,細胞貼壁早,搏動出現(xiàn)亦早。第一次消化時間以35min為宜,主要是去除一些血細胞、從組織邊緣消化下來的壞死心肌細胞及其細胞碎屑,時間不易太長,否則會丟棄一些已消化下來的心肌細胞。終止消化后的消化產物應立即離心后重懸于培養(yǎng)液以使受損的細胞盡早恢復。消化過程中我們強調反復吹打,因為吹打能使酶與組織充分均勻接觸,減少消化次數(shù)和時間,提高細胞存活率。每次消化產物并不徹底,需反復吹打使心肌細胞呈單個分散狀態(tài)再終止消化

4、。吹打不充分細胞團塊占5%以上會大大降低心肌細胞的收獲率,并且從團塊中爬出來的成纖維細胞影響心肌細胞的生長和純度。3.2盡可能多的去除成纖維細胞是提高心肌細胞純度的關鍵成纖維細胞較心肌細胞更容易貼壁,采用差速貼壁的方法可去除大部分成纖維細胞。差速貼壁時間以1h為最佳,與大部分文獻報道6090min2,3一致。另外,我們于培養(yǎng)8 12h后換液將培養(yǎng)液中的細胞團塊去掉并加入有絲分裂抑制劑絲裂霉素C(抑制成纖維細胞的DNA和蛋白合成以盡量減少自細胞團塊中爬出來的成纖維細胞并抑制其生長,但操作時需小心謹慎,避免剛剛貼壁的心肌細胞隨換液而被丟棄。加入溴脫氧尿苷4亦可達到抑制其增生的目的。3.3培養(yǎng)液是維

5、持細胞生存的基本條件心肌細胞在偏酸性環(huán)境中(p H值7.07.2更利于生長,培養(yǎng)液儲存后p H值逐漸升高,最好現(xiàn)配現(xiàn)用。如培養(yǎng)液儲存2周以上還應重新加入原量的谷氨酰胺,因為細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質,而谷氨酰胺在溶液中易分解?？股氐乃幮舛扰c毒效濃度接近,對細胞可造成損害,實驗中注意無菌操作可有效預防污染,故培養(yǎng)液中不加抗生素。如經費條件許可,前48h 可用胎牛血清培養(yǎng),因胎牛血清較新生牛血清含有更多的生長調節(jié)因子和營養(yǎng)成分,初次分離的心肌細胞在此環(huán)境中生長更好。圖版說明(圖見插4圖124h后,貼壁的心肌細胞呈梭形、菱形或多角形,×200.圖248h后,心肌細胞形成呈放射狀排

6、列的細胞簇,×200.圖3抗心肌特異性M HC抗體免疫熒光染色,二抗為FITC標記的山羊抗小鼠Ig G,×400.圖4抗心肌特異性Tn I抗體免疫熒光染色,二抗為羅丹明標記的山羊抗小鼠Ig G,×400.參考文獻6182636.2Suzuki T,Ohta M,Hoshi H.Serum2free chemically defined medi2 um to evaluate t he direct effect s of growt h factors and inhibitors on proliferation and function of neonata

7、l rat cardiac muscle in culture.In vit ro Cell Dev Biol,1989,25(7:6012606.3Bes S,Roussel P,Laubriet A,et al.Influence of deep hypot herm2 ia on t he tolerance of t he isolated cardiomyocyte to ischemia2reper2 fusion.J Mol Cell Cardiol,2001,33(11:197321988.4Simpson P,Savion S.Differentiation of rat m

8、yocytes in single cell cultures wit h and wit hout proliferating nonmyocardial cells.Circ Res,1982,50(1:1012116.吉姆薩染色法對大腦組織凋亡細胞的染色徐廣有1張翠香1馮化杰1孟慶輝2(齊齊哈爾醫(yī)學院,1微形態(tài)實驗室,22000級檢驗系本科生,齊齊哈爾161042根據(jù)資料記載凋亡細胞的染色可以用吉姆薩染色法1,但具體的操作方法卻未見報道。我們根據(jù)吉姆薩染料染血涂片的原理,將其用于大鼠大腦海馬區(qū)細胞的染色,探索出其染色程序,發(fā)現(xiàn)染色效果優(yōu)于常規(guī)H E染色,核仁和凋亡細胞著263色清晰,細胞

9、與背景對比明顯?，F(xiàn)介紹如下:1試劑配制2分別量取吉姆薩染料粉劑0.75g、甘油50ml、甲醇50ml。將粉劑放于甘油內攪勻,放入60溫箱24h,經常搖勻,取出待冷再加甲醇混勻,配成原液,封閉棕色瓶保存。使用時以原液10ml加入p H為6.46.8的磷酸鹽緩沖液100ml稀釋成工作液。磷酸鹽緩沖液的配制:A液Na2HPO40.946g,蒸餾水100ml;B液KH2PO40.907g,蒸餾水100ml。臨用時取A 液40ml,B液60ml混合,p H值約為6.64。2染色步驟所用材料為大鼠的大腦。具體操作步驟為:(1常規(guī)脫蠟至水;(2蒸餾水洗;(3在37溫箱中吉姆薩染色30min;(4蒸餾水洗2m

10、in;(5PBS分色適度;(6將切片從PBS中拿出,甩掉切片上的水分,放在空氣中略干燥,以肉眼觀察組織上的水分消失為度;(7入100%酒精中30s至1min;(8二甲苯透明5min;(9中性樹膠封片。3結果背景淡藍色,核為深藍色,凋亡細胞為深藍色(附圖。4體會這種染色方法是我們仔細研究了血涂片的染色方法和經過多次實驗總結出來的。在染色中第6步是關鍵,我們曾嘗試不經過此步驟直接入100%酒精脫水,但脫色嚴重,無法控制,使染色失敗;我們也曾嘗試在第6步后入95%的酒精中脫水,脫色也非?？?使染色未能成功;最后我們采取將切片從PBS中拿出,甩掉切片上的水分,放在空氣中略干燥,以肉眼觀察組織上的水分消

11、失后再入100%酒精脫水,效果良好。因此,用吉姆薩染料染大腦細胞以其操作簡便、色彩鮮艷、對比度好、細胞核和凋亡細胞著色清晰,能夠長期保存、不褪色,為一種值得推廣的方法 。附圖大鼠海馬細胞參考文獻1 王伯,李玉松, 兩種染色方法對腦垂體三種嗜色細胞顯示效果的比較柳潔馬曉健(懷化醫(yī)學高等?？茖W?；A醫(yī)學部,懷化418000腦垂體由腺垂體和神經垂體兩部分組成,其中腺垂體內有3種類型細胞:嗜酸性細胞、嗜堿性細胞和嫌色細胞。在常規(guī)的蘇木精伊紅染色切片中,腦垂體3種嗜色細胞顯示的效果一直不甚理想,學生在顯微鏡下進行觀察辨認比較困難,為了更清晰地顯示腦垂體3種嗜色細胞,我們采用不同的染色方法對腦垂體進行染色

12、,經過多次實驗顯示,采用Mallory 氏法染色,獲得了較滿意的染色效果,現(xiàn)介紹如下:1材料和方法1.1取材固定取成年雌狗腦垂體,Zenker液固定24h,自來水沖洗12h。1.2脫水、包埋與切片從體積分數(shù)為0.5的乙醇梯度上行至無水乙醇進行脫水,二甲苯透明,常規(guī)石蠟包埋切片,切片厚度為5m。1.3脫蠟、脫汞將組織切片浸入二甲苯中脫蠟,從無水乙醇下行至體積分數(shù)為0.7的乙醇,L ngol液脫汞,硫代硫酸鈉、蒸餾水洗。1.4Mallory氏染色切片入0.1%酸性復紅水溶液染5min。蒸餾水洗,入1%磷鉬酸水溶液媒染5min,蒸餾水洗。切片入混合液(苯胺藍0.5g,桔黃G2.0g,草酸2.0g,蒸餾水100ml染2min。蒸餾水洗,體積分數(shù)為0.95乙醇鑒別,上行至無水乙醇,二甲苯透明,中性樹膠封固1。2結果嗜酸性細胞呈圓形或橢圓形,數(shù)量