八種常用化療藥物組合對人類宮頸癌細(xì)胞體外藥物敏感試驗(yàn)研究

1、八種常用化療藥物組合對人類宮頸癌細(xì)胞體外藥物敏感試驗(yàn)研究【摘要】目的：探討臨床宮頸癌原代腫瘤細(xì)胞對八種常用化療藥物組合方案的敏感性。方法 :采用ATP生物熒光法,對41例宮頸癌術(shù)中切下腫瘤組織標(biāo)本進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng),再將紫杉醇，紫杉醇+順鉑，紫杉醇+卡鉑，托泊替康+順鉑，吉西他濱+順鉑，多西他賽；吉西他濱以及順鉑+環(huán)磷酰胺+多柔比星分別設(shè)定不同藥物濃度梯度（200%，100%，50.0%，25.0%，12.5%PPC即血漿峰值濃度），進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果：8組化療藥物方案對宮頸癌的敏感性依次為：紫杉醇+順鉑>紫杉醇+卡鉑>紫杉醇>吉西他濱+順鉑>順鉑+環(huán)磷酰胺+多柔比星&g

2、t;托泊替康+順鉑>多西他賽>吉西他濱。結(jié)論：宮頸癌患者進(jìn)行化療藥物敏感試驗(yàn)具有可行性,對臨床個(gè)體化化療具有現(xiàn)實(shí)指導(dǎo)作用?！娟P(guān)鍵詞】宮頸癌；原代腫瘤細(xì)胞；化療藥物；敏感性；體外培養(yǎng)Eight Anticancer Drug Sensitivity Test of Cervical Carcinomasby ATP-bioluminesence method【Abstract】：Objective :To evaluate chemosensitivity of cervical carcinoma to 8 anticancer drugs were assayed in vitr

3、o using ATP- bioluminesence method. Methods: The chemosensitivity of 40 fresh specimens of human cervical tumors were tested with ATP-bioluminesence and eight anticancer drugs.Results: Chemosensitivities of cervical carcinoma to 8 anticancer drugs priority is :TAX+DDP>TAX+CBP>TAX>GEM+DDP>

4、;DDP+CTX+ADM> Topotecan+DDP>Docetaxel>GEM. Conclusion :The ATP-bioluminesence assay in vitro can predict chemotherapy for cervical carcinoma.Key words:cervical carcinoma; pro-generation tumor cells; chemotreatm-ent drug; susceptiveness; cultivation in vitro .宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居?jì)D科惡性腫瘤之首

5、。近年來發(fā)病率呈上升和年輕化趨勢。宮頸癌的治療模式為手術(shù)及放療，化療僅僅用于不能手術(shù)的晚期患者的姑息治療或手術(shù)前新輔助治療1。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，臨床治療的不斷深入，醫(yī)療工作者發(fā)現(xiàn)手術(shù)和放療不能控制和消除亞臨床病灶和微小轉(zhuǎn)移病灶。隨著化療藥物的不斷更新?lián)Q代、里程碑式的跨越，給藥方法和給藥途徑的不斷改善。選擇針對個(gè)體有效的藥物進(jìn)行化療是治療婦科惡性腫瘤的重要手段之一。本研究通過參考近年來國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)23選擇八種一線及二線的宮頸癌化療藥物方案，化療前對個(gè)體宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行藥物體外敏感試驗(yàn)，對其細(xì)胞毒性進(jìn)行比較,選擇出有效的單藥或有效（或敏感）聯(lián)合藥物組成的化療方案，為臨床個(gè)體化化療提供依據(jù)。1

6、.材料與方法1.1 一般資料 收集2013年-2014年在本院手術(shù)治療的宮頸癌（經(jīng)病理確診）患者41例標(biāo)本，最小年齡24歲，最大年齡68歲。其中鱗癌32例；腺癌8例；宮頸腺泡狀橫紋肌肉瘤1例。1.2 材料 ATP-TCA11試劑盒，由湖州海創(chuàng)生物科技有限公司提供。化療藥物：紫杉醇（TAX，百時(shí)美施貴寶公司），順鉑4(DDP，江蘇豪森藥業(yè))，卡鉑5(CBP, 齊魯制藥)，托泊替康6（Topotecan，葛蘭素史克），吉西他濱7（GEM,ELI LILLY AND COMPANY），多西他賽8（Docetaxel,江蘇恒瑞醫(yī)藥）；環(huán)磷酰胺（CTX，Toronto Research Chemical

7、s Inc.），多柔比星9（ADM，深圳萬樂藥業(yè)）。均為一般臨床制劑。其濃度依據(jù)臨床用藥的有效血藥濃度確定。具體試驗(yàn)濃度如表一。表一 八種化療藥物試驗(yàn)濃度藥物100%PPC（ug/ml） TAX DDP CBP Topotecan GEM Docetaxel CTX ADM 13.8 6.3 25 0.75 25 10 3 31.3 方法 ATP-TCA操作步驟：取手術(shù)切除的新鮮腫瘤組織標(biāo)本，去除其表面的凝血塊及壞死組織等，剪碎、離心，加入組織消化酶溶液，充分消化后離心，去上清，收集細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1030萬/ml,加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,置37、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后,加入化

8、療藥物,每個(gè)藥物設(shè)5個(gè)濃度(200%，100%，50.0%，25.0%，12.5%PPC),同時(shí)設(shè)空白對照(不含腫瘤細(xì)胞)及對照孔(含腫瘤細(xì)胞但不加化療藥物),于5%CO2、37、95%濕度下孵育57天。加入腫瘤細(xì)胞ATP提取液，混勻后室溫下15min，取0.05ml混合液置微板熒光分析儀檢測11。按下式計(jì)算各個(gè)化療藥物的抑制率： 抑制率= (1-試驗(yàn)孔ATP量/對照組ATP量)×100%抑制率70%為高度敏感；50%70%為敏感；30%50%為低度敏感；<30%為耐藥；當(dāng)抑制率50%時(shí)可以推薦臨床使用。2.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

9、采用GraphPad Prism 5.0軟件作圖。 3. 結(jié)果3.1 ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線10 用于質(zhì)控，用于每次使用系統(tǒng)時(shí)的發(fā)光測試及實(shí)驗(yàn)結(jié)果異常時(shí)的校驗(yàn)。取各濃度測得的發(fā)光均值，以稀釋濃度的LG對數(shù)值為自變量，以測定結(jié)果均值的LG對數(shù)值為因變量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線確定線性度，在ATP標(biāo)準(zhǔn)品濃度10-1110-6mol/ml范圍內(nèi),二者呈良好的直線相關(guān)關(guān)系。相關(guān)系數(shù)r 0.975,對r進(jìn)行t檢驗(yàn),P<0.001。 3.2 ATP生物發(fā)光法檢測結(jié)果在總共收集的41例病人中，41例均具有可評估性。總可評估率約為:100%。在血漿峰值濃度下藥物對宮頸鱗癌與腺癌的抑制率均值見表二。在血漿峰值濃度下藥物對宮頸

10、鱗癌與腺癌的抑制率對照見圖一。表二：血漿峰值濃度下藥物對鱗癌與腺癌的抑制率均值（%）病理 藥物TAX TC TPDocetaxelGEM+DDPDDP+CTX+ADMGEMTopotecan+DDP鱗癌 腺癌89.71 93.89 98.07 87.98 97.29 92.6265.17 65.5875.28 96.6070.62 89.7046.60 39.7071.56 70.13另外，宮頸腺泡狀橫紋肌肉瘤1例的癌細(xì)胞藥物的敏感性：TAX單藥為高度敏感，TAX+CBP方案為敏感，DDP+CTX+ADM方案為低度敏感，其余均為耐藥。以上試驗(yàn)結(jié)果顯示：在血漿峰值濃度下，對于宮頸鱗癌化療藥物的抑

11、制率依次為：TAX+DDP>TAX+CBP>TAX>GEM+DDP>Topotecan+DDP>DDP+CTX+ADM>Docetaxel>GEM。在血漿峰值濃度下，對于宮頸腺癌化療藥物的抑制率依次為：TAX+CBP>GEM+DDP>TAX+DDP>DDP+CTX+ADM>TAX>Topotecan+DDP>Docetaxel>GEM。然而，宮頸癌不同組織病理學(xué)藥物敏感性的差異根據(jù)SPSS軟件統(tǒng)計(jì)P=0.3360（P>0.05），差異尚不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。資料收集的41例宮頸癌細(xì)胞在不同濃度梯度下八組藥物的

12、腫瘤生長抑制率均值（%）見表三，八組化療藥物對宮頸癌細(xì)胞體外敏感試驗(yàn)結(jié)果對照見圖二。表三：不同濃度梯度下八組藥物的腫瘤生長抑制率均值濃度 藥物TAX TC TPGEM+DocetaxelDDPDDP+CTX+ADMGEMTopotecan+DDP200%PPC 100%PPC 50%PPC 25%PPC 12.5PPC96.98 97.95 99.31 89.31 94.49 96.71 71.44 79.05 86.14 54.43 59.07 68.37 42.12 46.35 48.9381.94 65.30 49.74 40.19 34.2481.57 77.94 69.76 58.0

13、2 44.6280.64 75.11 66.72 48.37 32.0950.57 26.61 26.51 26.54 24.4276.08 71.41 59.70 45.52 36.42試驗(yàn)結(jié)果顯示：本試驗(yàn)的八組化療藥物的敏感性與藥物的濃度呈正相關(guān)。隨著化療藥物的濃度增加，對腫瘤細(xì)胞敏感率也逐漸增加。當(dāng)濃度為200%PPC時(shí)，化療藥物的抑制率依次為：TAX+DDP>TAX+CBP>TAX>Docetaxel>GEM+DDP>DDP+CTX+ADM>Topotecan+DDP>GEM；當(dāng)濃度為100%PPC時(shí)，化療藥物的抑制率依次為：TAX+DDP&g

14、t;TAX+CBP>TAX>GEM+DDP>DDP+CTX+ADM>Topotecan+DDP>Docetaxel>GEM；當(dāng)濃度為50%PPC時(shí)，化療藥物的抑制率依次為：TAX+DDP>TAX+CBP>TAX>GEM+DDP>DDP+CTX+ADM>Topotecan+DDP>Docetaxel>GEM；當(dāng)濃度為25%PPC時(shí)，化療藥物的抑制率依次為：TAX+DDP>TAX+CBP>GEM+DDP>TAX>DDP+CTX+ADM>Topotecan+DDP>Docetaxel&g

15、t;GEM；當(dāng)濃度為12.5%PPC時(shí)，化療藥物的抑制率依次為：TAX+DDP>TAX+CBP>GEM+DDP>TAX>Topotecan+DDP>Docetaxel>DDP+CTX+ADM >GEM。從總體的腫瘤抑制率的變化趨勢來看，八組化療藥物對個(gè)體宮頸癌細(xì)胞的抑制作用具有顯著性差異（P0.001），抑制率依次為：紫杉醇+順鉑>紫杉醇+卡鉑>紫杉醇>吉西他濱+順鉑>順鉑+環(huán)磷酰胺+多柔比星>托泊替康+順鉑>多西他賽>吉西他濱。4.討論經(jīng)典的的宮頸癌化療方案一般選擇：BVP（博來霉素、長春新堿與順鉑）、BP（

16、博來霉素與順鉑）、FP（氟尿嘧啶與順鉑）或者TP（紫杉醇與順鉑）。經(jīng)驗(yàn)性選擇化療方案對宮頸癌細(xì)胞幾乎沒有選擇特異性，因而療效低，同時(shí)易產(chǎn)生嚴(yán)重不良反應(yīng)12；但是臨床上大多憑經(jīng)驗(yàn)用藥，同一化療方案固定不變應(yīng)用于許多患者而忽視了個(gè)體差異，總體療效不佳。本研究采用ATP生物熒光法6對41例宮頸癌患者的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示隨著藥物濃度的增大，腫瘤細(xì)胞對各抗癌藥物的敏感性增加，呈劑量依賴性。在患者可耐受的前提下可優(yōu)先選擇TAX+DDP方案，其次為TAX+CBP和單藥TAX方案。有些患者的腫瘤細(xì)胞對某些藥物非常敏感，在濃度為50%PPC 時(shí)就表現(xiàn)為高度敏感；而有些細(xì)胞則表現(xiàn)出耐藥，但隨著檢測藥物

17、濃度的增加，當(dāng)在濃度達(dá)200%PPC甚至更高時(shí)，細(xì)胞則表現(xiàn)出敏感。表明增加藥物劑量可以提高療效，這對于能夠耐受大劑量化療的患者有較好的指導(dǎo)意義。本試驗(yàn)八組化療藥物對41例宮頸癌細(xì)胞的抑制作用具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.01），顯示同種腫瘤不同患者間存在個(gè)體差異，應(yīng)針對不同患者個(gè)體化給藥。Ling ZQ等13報(bào)道對食管癌患者進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)為臨床治療提供合理的抗癌方案。OToole SA等14采用MTS法檢測子宮內(nèi)膜癌以及宮頸癌患者對化療藥物的敏感性，并對比藥敏試驗(yàn)結(jié)果與臨床療效，發(fā)現(xiàn)兩者具有較好的相關(guān)性。因此，在臨床選擇化療方案前進(jìn)行體外藥物敏感試驗(yàn)，檢測患者腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，根據(jù)藥

18、敏試驗(yàn)結(jié)果選擇合適化療方案，可以顯著提高治療療效，減少不良反應(yīng)及預(yù)防多藥耐藥發(fā)生，從而延長患者生存期。本研究也存在一些不足之處，抗癌藥物的療效是許多作用的綜合結(jié)果，受體內(nèi)諸因素的調(diào)控和制約，體外細(xì)胞生長環(huán)境無法完全模擬腫瘤體內(nèi)環(huán)境，藥敏試驗(yàn)只是藥物和細(xì)胞的直接作用，只是反應(yīng)了腫瘤一個(gè)階段，一部分細(xì)胞的情況，無法完全體現(xiàn)腫瘤的異質(zhì)性；臨床效果受用藥方法、劑量影響很大，體內(nèi)的藥物濃度及持續(xù)時(shí)間受給藥途徑、肝腎功能等各種因素影響,而試驗(yàn)條件則無法選擇合適的濃度和作用時(shí)間與臨床完全一致；某些藥物需經(jīng)代謝轉(zhuǎn)化或免疫系統(tǒng)介導(dǎo)發(fā)揮作用, 如環(huán)磷酰胺 15需經(jīng)過肝臟代謝轉(zhuǎn)化為有效物質(zhì)發(fā)揮作用,而體外藥敏試驗(yàn)無

19、法很好體現(xiàn)這些藥物功效。另外，據(jù)本研究結(jié)果顯示宮頸癌不同組織病理學(xué)間的藥物敏感性差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與宮頸腺癌的樣本量少有關(guān)，有待后期繼續(xù)收集樣本資料，完善實(shí)驗(yàn)結(jié)果。參考文獻(xiàn)1、王平, 彭芝蘭, 張家文, 等. 子宮頸癌新輔助化療中不同化療途徑的療效比較J. 中華婦產(chǎn)科雜志, 2005, 40(4): 227-230.2、王立峰，劉寶瑞.鉑類、紫杉類藥物個(gè)體化治療研究進(jìn)展J.癌癥進(jìn)展，2011，9（5）：533.3、沈曉燕, 崔恒. 復(fù)發(fā)性和轉(zhuǎn)移性子宮頸癌化療的研究進(jìn)展J. 中華婦產(chǎn)科雜志, 2013, 48(010): 788-791.4、1.Leath III C A, Straug

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