卵巢癌患者exosomes來源初探

1、卵巢癌患者exosomes來源初探                                   作者：李奇靈 孫陽珍 于月成 方靜 張媛麗 辛?xí)匝唷娟P(guān)鍵詞】  exosomes；腹水；卵巢腫瘤；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)Comparison of extractio

2、n methods of exosomes from patients with ovarian cancer【Abstract】 AIM: To compare the extraction methods of exosomes from tissue or ascites of an advanced ovarian cancer patient, to detect the expression of exosomes of two source, and to explore the best pathway of acquiring exosomes.  METHODS:

3、 The tissue of ovarian cancer was taken and the cancer cells were separated and cultured. The cell culture supernatant was collected. The ascites was collected from the same patient. The exosomes were extracted by ultracentrifugation and ultrafiltration from the cell culture supernatant and the asci

4、tes and were examined under electron microscope.  HSP70, HSP90, MHC class molecule and MHC class molecule on exosomes were tested by Western blotting. The protein concentration of exosomes was tested by BCA method. RESULTS: The time for the centrifugation of ascites was longer than that of supe

5、rnatant. The exosomes could be obtained from all of the supernatants and the ascites with cancer cells, not from the ascites without cancer cells. The exosomes expressed MHC class molecule, HSP70 and HSP90 except MHC class molecule. The protein concentration of exosomes in the ascites was higher tha

6、n that of the supernantant of cell culture (P<0.05).  CONCLUSION: Ascites is a better source of exosomes for the ovarian cancer patient with malignant effusion with positive cancer cells. The exosomes can  be extracted from ovarian cancer tissue  for the patients without ascites or

7、 with  ascites in which cancer cells are negative. 【Keywords】exosomes; ascites; ovarian neoplasms; cell culture techniques【摘要】目的： 同一晚期卵巢癌患者，對組織來源和腹水來源的exosomes進(jìn)行方法和數(shù)量的比較，探討獲得卵巢癌患者exosomes的最佳途徑.  方法： 收集晚期卵巢癌患者卵巢癌組織，分離癌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，留上清液，取同一患者的腹水，通過超速離心和超濾等方法提取上清液及腹水中的exosomes,電鏡下檢測；Western Blot測定e

8、xosomes 上HSP70, HSP90, MHC類分子和MHC類分子的表達(dá)；用BCA蛋白測定法測定exosomes的蛋白濃度,計(jì)算蛋白總含量.  結(jié)果： 腹水離心時(shí)間比上清液離心時(shí)間長，所有細(xì)胞培養(yǎng)上清液和癌細(xì)胞陽性的腹水均能分離出exosomes，癌細(xì)胞陰性的腹水中未分離出exosomes；兩種來源的exosomes共同表達(dá)MHC類分子、HSP70和HSP90，均不表達(dá)MHC類分子，腹水中分離出來的exosomes蛋白含量比細(xì)胞培養(yǎng)上清液的含量高（P<0.05）. 結(jié)論： 腹水中癌細(xì)胞陽性的患者，腹水是exosomes的比較理想的來源；無腹水或腹水中癌細(xì)胞陰性的患者，ex

9、osomes可來源于卵巢癌組織. 【關(guān)鍵詞】 exosomes；腹水；卵巢腫瘤；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)0引言exosomes是許多種細(xì)胞都能分泌的直徑3090 nm的小囊泡，由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成的亞細(xì)胞器. 近年來，癌癥患者的腫瘤細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞（dendritic cell, DC）分泌的exosomes，由于它攜帶所分泌細(xì)胞的一些抗原信息，被作為腫瘤特異性抗原的來源，用于惡性腫瘤免疫治療1-2的研究. 由DC分泌的exosomes已經(jīng)在黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌進(jìn)入了臨床期試驗(yàn)3, 但exosomes在卵巢癌中的研究進(jìn)展較慢. 本研究我們對晚期卵巢癌患者組織來源和腹水來源的exosomes分離方法、獲得量

10、比較，探討卵巢癌患者最佳exosomes來源途徑. 1對象和方法1.1對象選擇200501/200512在西交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科住院的原發(fā)性卵巢癌患者15例，年齡（53±6）歲. 臨床分期期，均伴有腹水，腹水中查出癌細(xì)胞者10例(10/15)，腹水中癌細(xì)胞陰性者5例(5/15). 取標(biāo)本前未經(jīng)化療，均為第一次剖腹探查，術(shù)中無菌操作留取卵巢癌組織，術(shù)前或術(shù)中留取腹水. 術(shù)后病理診斷，漿液性囊腺癌9例，黏液性囊腺癌6例. 99.93%重水購自Sigm公司；RPMI1640培養(yǎng)液購自Gibco公司； Centriplus離心超濾管（100KDa）、Amicon Ultra高

11、回收率高流速切向流超濾離心管（100KDa）購自美國Millipore公司；兔抗人熱休克蛋白（HSP70）多克隆抗體、兔抗人HSP90多克隆抗體購自武漢博士德生工程公司；鼠抗人MHC類分子(HLAABC)mAb、鼠抗人MHC類分子（HLADR）mAb購自華美公司；Western Blot試劑盒（包括酶標(biāo)記二抗、A液和B液）購自Pierce公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)研究所.1.2方法     統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析,兩組之間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 2結(jié)果2.1離

12、心及超濾過程的比較腹水標(biāo)本與細(xì)胞培養(yǎng)上清液標(biāo)本離心次數(shù)相同，而超濾次數(shù)多于細(xì)胞培養(yǎng)上清液，腹水標(biāo)本超濾慢，時(shí)間長，100 mL標(biāo)本需要(70±9)min，易堵塞超濾管的超濾孔；而細(xì)胞培養(yǎng)上清液則需要(20±7)min，兩者相比有顯著性差異(P<0.05), 相對腹水標(biāo)本而言，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離exosomes可節(jié)省時(shí)間和超濾管. 2.2電鏡分別將兩種標(biāo)本置于透電子顯微鏡下觀察，可見具有明顯異質(zhì)性的圓形或橢圓形小囊泡，直徑約3090 nm，有完整的包膜，內(nèi)為低電子密度物質(zhì)（圖1）. 10例晚期卵巢癌患者癌細(xì)胞陽性腹水標(biāo)本和15例細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，均能分離出exoso

13、mes, 電鏡下形態(tài)無區(qū)別. 5例晚期卵巢癌患者癌細(xì)胞陰性腹水標(biāo)本中未分離出exosomes. 圖1電鏡下人晚期卵巢癌患者來源的exosomes略2.3免疫蛋白的表達(dá)在細(xì)胞培養(yǎng)上清e(cuò)xosomes陽性待測液、腹水中exosomes陽性的待測液、癌細(xì)胞裂解液標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)大約在Mr(×103)為90，35和73處有一明顯的特異蛋白帶，通過Western Bolt檢測后，該蛋白帶可被HSP90, MHC類分子抗體和HSP70抗體特異性識(shí)別（圖2），從而肯定其為HSP90, MHC類分子和HSP70基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物. 在Mr(×103)為40處無蛋白帶表達(dá)，故無MHC類分子表達(dá).

14、腹水中exosomes陰性的待測液中無蛋白表達(dá). 圖2HSP70, HSP90和MHC類分子的Western Blot表達(dá)情況略2.4腹水及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離exosomes的各種參數(shù)（表1和表2）蛋白總量(mg)=最終體積（mL）×BCA法測的蛋白濃度(g/L). 腹水來源標(biāo)本：平均每個(gè)患者的exosomes蛋白總量為（3.27±1.44）mg. 組織來源標(biāo)本的exosomes蛋白總量為（0.77±0.40）mg，與腹水來源標(biāo)本蛋白含量（3.27±1.44）mg相比，P=0.00, P<0.01，有顯著性差異. 表1晚期卵巢癌10例患者癌細(xì)胞陽

15、性的腹水中分離的exosomes參數(shù)略表2晚期卵巢癌15例患者組織來源的exosomes參數(shù)略3討論經(jīng)研究證實(shí)exosomes來源于細(xì)胞內(nèi)的多囊體, 多囊體內(nèi)的富含肽段MHC分子的小泡被釋放到細(xì)胞間隙中，形成所謂的exosomes. 在鼠實(shí)驗(yàn)中，DC來源的exosomes顯示了具有免疫原性的特征，可以消除腫瘤,表明exosomes是具有生物活性的囊泡，具有免疫調(diào)節(jié)作用和潛在的抗腫瘤作用4.  面向臨床應(yīng)用的GMP級外來體的制備和純化程序,即通過一系列標(biāo)準(zhǔn)離心和超濾的方法分離exosomes,用電鏡鑒定其形態(tài)和直徑，Western Blot或免疫電鏡方法證明其上表達(dá)細(xì)胞膜成分，目前已用

16、于腫瘤免疫治療，其來源包括腫瘤細(xì)胞來源，DC來源以及惡性漿液5-7. 本研究我們利用標(biāo)準(zhǔn)方法制備exosomes，從10例癌細(xì)胞陽性的卵巢癌患者腹水和15例組織來源的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中分離出了exosoems，用電鏡證實(shí)了其形態(tài). 我們發(fā)現(xiàn)對同一卵巢癌患者腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液和腹水來源的exosomes進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)從細(xì)胞培養(yǎng)上清液和腹水中分離的exosomes與腹水中的癌細(xì)胞裂解液表達(dá)相同的免疫原性蛋白分子HSP70、HSP90和MHC類分子，這些與腫瘤密切相關(guān)的分子表明腹水和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中exosomes均來源于卵巢癌細(xì)胞. 有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的exosomes除了含有攜帶

17、高濃度的腫瘤抗原候選分子、抗原提呈分子及其伴侶分子外，還含有四次跨膜蛋白，GPI錨定蛋白等8. Bard等9從4例間皮瘤、2例肺癌、2例乳腺癌和1例卵巢癌的胸水中分離出外來體，其上包含有特異性抗原：SNX25, BTG, PEDF, thrombospondin2. 卵巢癌患者的腹水來源的exosomes所攜帶的抗原信息可能也是很豐富的，需要進(jìn)一步證實(shí). 每次抽腹水可獲得9302100 mL，其內(nèi)含有exosomes蛋白總量為（3.27±1.44）mg，而經(jīng)過10余次的細(xì)胞培養(yǎng)傳代，可獲得細(xì)胞培養(yǎng)上清液100 mL,獲得exosomes的蛋白總量為（0.77±0.40）mg

18、，明顯少于腹水來源的exosomes. 所以對于腹水中癌細(xì)胞陽性的患者而言,腹水是exosomes的理想來源，不但量豐富，而且采集方法簡單、痛苦小，可直接分離. 相對于體外培養(yǎng)細(xì)胞上清而言，腹水來源的exosomes具有幾個(gè)優(yōu)勢： 可以大量制備，免除了繁瑣的細(xì)胞培養(yǎng). 電鏡結(jié)果證實(shí)腹水中含有大量的大小不一的exosomes. exosomes上的HSP70, HSP90和MHC類分子為相關(guān)性最密切的腫瘤抗原，這些是被自身抗原呈遞細(xì)胞攝取和呈遞的關(guān)鍵分子. exosomes表達(dá)HSP70, HSP90和MHC類分子，這些本源性腫瘤抗原表明這些exosomes是來自于腫瘤細(xì)胞. Andre等用抗M

19、HC類分子ABC mAb進(jìn)行的免疫吸附試驗(yàn)證實(shí)每毫升惡性積液中平均含有8×1010個(gè)exosomes性MHC分子，而體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞上清約為每毫升7×109個(gè)exosomes性MHC分子. 所有這些數(shù)據(jù)說明惡性積液是腫瘤細(xì)胞源性exosomes的豐富來源，而且其上的腫瘤抗原/MHC復(fù)合物非常適合臨床應(yīng)用. 本研究雖然發(fā)現(xiàn)對于同一卵巢癌患者來說，在分離方法和獲得量上比較，從癌細(xì)胞陽性的腹水中獲得exosomes比細(xì)胞培養(yǎng)理想，但哪一種來源的exosomes在免疫治療中會(huì)發(fā)揮更大的作用需進(jìn)一步研究. 參考文獻(xiàn)】1Delcayre A, Estelles A, Sperinde

20、 J, et al. Exosome display technology: Applications to the development of new diagnostics and therapeutics J. Blood Cells Mol Dis, 2005,35(2):158-168. 2牟丹蕾，賈戰(zhàn)生，白雪帆. 胞體外免疫治療中的“特洛伊木馬”J. 生理科學(xué)進(jìn)展, 2005,36(2):113-118.3Delcayre A, Le Pecq JB. Exosomes as novel therapeutic nanodevicesJ. Curr Opin Mol Ther, 2006,8(1):31-38.4Chaput N, Taieb J, Andre F, et al. The potential of exosomes in immunotherapy