從線粒體DNA控制區(qū)基因比較石雞和大石雞的遺傳變異_圖文

1、第 28卷第 3期 江 西 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報 Vo. l 28, No . 3 2006年 6月 Acta Agr ic u lturae Un iversitatis Jiangx iensis June , 2006文章編號 :1000-2286(2006 03-0420-05從線粒體 DNA 控制區(qū)基因比較石雞和大石雞的遺傳變異黃族豪 1, 2, 劉 迺發(fā) 2*, 龍 進(jìn) 1, 肖宜安 1(1. 井岡山學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院 , 江西 吉安 343009; 2. 蘭州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 , 甘肅 蘭州 730000摘要 :采用聚合鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和直接 測序方法測定石雞和大石雞線粒體 DNA

2、(m t DNA 控制區(qū)全序列 , 分析 m t DNA 3個區(qū)的序列變異 , 比較兩種石雞的遺傳變異。石雞 m t DNA 控制區(qū)全序列長 1154bp , 大石雞是 1157bp 。與大 石雞相比 , 石雞 m t DNA 控制區(qū)在第 187位 , 第 1060位和第 1110位缺失。兩種石雞之間 , m t DNA 控制 區(qū) I 區(qū) 、 II 區(qū)和 III 區(qū)的序列變異率分 別為 5. 70%, 0. 64%和 3. 22%, I 區(qū)的變異 速率最快。石 雞 m t DNA 控制區(qū) 的堿基 含量是 :T 32. 13%, C27. 17%, A26. 43%和 G 14. 23%, 大石

3、雞 的分 別是 T32. 30%, C26. 79%, A 26. 10%和 G14. 81%。 t -檢驗(yàn)分析顯示 , 石雞和大石雞 m t DNA 控制區(qū)的 4種堿 基含量 差異都極 顯著。兩 種石雞間 的遺 傳距 離是 0. 0384。根據(jù)分子鐘計算 , 它們的分歧時間大約在 190萬年前。它們的物種形成主要受青藏高原 的隆升 和更新世第 2次寒冷期的影響。關(guān)鍵詞 :線粒體 DNA 控制區(qū) ; 石雞 ; 大石雞 ; 遺傳變異中圖分類號 :S966. 3+3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 :ACo mparis on ofGenetic Variation Bet ween Alectoris chukar

4、 and A. magna Based on M itochondri al DNA Control -regi on GeneHUANG Zu-hao 1, 2, L I U N a i -fa 2*, LONG Ji n 1, X I AO Y i-an 1(1. Schoo l o f L ife Sciences , Ji n ggang shan Un i v ersity , Jian 343009, Chi n a ; 2. School of Life Sciences , Lanzhou Un i v ersity , Lanzhou 730000, Ch i n aAbst

5、ract :M itochondria l DNA con tro l-reg ion (m t D NA D -loop can be d i v i d ed into t h ree do m a i n s , corresponding to the h i g hly variab le peri p heral do m a i n s I and III and to the central conserved do m a i n II of ver tebrates . Po l y m erase cha i n reaction and direct sequencin

6、g m ethods w ere used to ana l y ze the entire m t D NA D -loop i n Chukar partri d ge (A lectoris chukar and Przevalski partri d ge (A.m agna . The a i m s are to infer se quence variation of the three do m ains ofm t D NA D-loop gene and to co m pare the genetic variation bet w een Chukar partridg

7、e and Przevalsk i partri d ge . D-l o ops were 1154nucleotides (nt long i n Chukar partridge , 1157 nt i n Przevalsk i partridge (nt187, 1060and 1110w ere deleted in Chukar partr i d ge. The sequence variation rates of do m a i n s I , II and III w ere separately 5. 70%, 0. 64%and 3. 22%bet w een Ch

8、ukar partridge and Przevalski partridge , wh ich indicated the variation ra tes o f do m ains I w as the fastes. t The nucleotide co mposi ti o n of Chukar partri d ge m t D NA D-l o op w as :32. 13%T , 27. 17%C , 26. 43%A, 14. 23%G, and 32. 30% T 、 26. 79%C 、 26. 10%A, 14. 81%G of Przeva lski partr

9、idge . There w ere ver y sign ificant differences in the con tents o f the four nuc leotides bet w een Chukar partridge and Przevalsk i partri d ge . Genetic d istance w as 0. 0384 bet w een t h e t w o partridges . The ca li b rated rates ofm o lecular evoluti o n suggested that t h ey speciated ab

10、out 1. 90 m illi o n years ago , affected by the up lift ofQ inghai-T i b et Plateau and the Ple istocene second fri g id stage . K ey w ords :m itochondrial DNA D-l o op ; A lectoris chukar ; Alectoris m agna; genetic variation收稿日期 :2006-02-10基金項(xiàng)目 :國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (30530130作者簡介 :黃族豪 (1975-, 男 , 副教授 ,

11、博士 , 主要從事動 物生態(tài)學(xué) 和保護(hù)生物 學(xué) , E-m a i :l hzhow163. co m; *通動物線粒體 DNA (mitochondria lDNA, m t D NA 是共價閉合的環(huán)狀雙鏈 DNA, 由 37個編碼基因和 2個非編碼區(qū) (控制區(qū)和 L-鏈復(fù)制起始區(qū) 組成。 m t D NA 控制區(qū) (contr o l reg i o n 也稱為 D 環(huán) (d isp l a ce m ent-loop reg i o n , D-loop, 大都位于 t R NA Pr o 和 t R NA Phe 基因之間 1。從總體上看 , m t D NA 控制區(qū)包含 3個區(qū) 1:

12、(1 高變 I 區(qū) (Hyper variab le do m a i n I 。 I 區(qū)的長度是 316bp(1316bp, 位于控制區(qū)左邊 (5 端 。 (2 中間保守 II 區(qū) (C entral conserved do m a i n II 。 II 區(qū)的長度是 468bp(317784bp, 位于終 止結(jié)合序列 (ter m i n ation assoc iated sequences , TAS 和重鏈復(fù)制起始區(qū) (orign i of H -strand replication , O H 之間 , 在進(jìn)化上高度保守 , 并且富含 G , 而 A 含量較低。 (3 保守 序列

13、 III 區(qū) (C onserved sequence blocks do m a i n III 。 III 區(qū)的長度是 373bp(7851157bp, 位于控制區(qū)右翼 (3 端 。 m t D NA 控制區(qū)基 因是不編碼基因 , 進(jìn)化速度在整個線粒體基因組中最快 , 其堿基替換率比其它區(qū)域高 510倍 2, 所以 m t D NA 控制區(qū)基因成為研究動物遺傳變異和系統(tǒng)進(jìn)化非常有效的遺傳標(biāo)記 , 并得到廣泛應(yīng)用。但對 m t D NA 控制區(qū)本身的遺傳變異研究較少 , 近緣種間 m t D NA 序列的比較分析可以用來研究這個問題 3。 石雞 (A lectoris chukar 和 大石

14、雞 (A.m agna 隸 屬雞形目 (Ga llifor m s 、 雉科 (Phasi a n i d ae 、 石 雞屬 (Alectoris 。石雞曾被 認(rèn)為是歐石雞 (A. gracea , 大石雞則 被認(rèn)為是它的 一個亞種 , A. g. m agan 4, 5。 W atson 6, 7和劉 迺發(fā) 8恢復(fù)了其種的地位。本文利用 PCR-直接測序的方法測定石雞和大石雞 m t D NA 控制區(qū)全序列 , 目的有二 :一是分析 m t D NA 控制區(qū) 3個區(qū)的變異規(guī)律 , 二是比較石雞和大石雞的遺傳變 異。1 材料與方法1. 1 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)用的大石雞采自甘肅省蘭州地區(qū) , 共 1

15、0個樣本 ; 石雞采自甘肅省慶陽地區(qū) , 共 18個樣本。以 肝臟和血液為實(shí)驗(yàn)材料 , 肝臟用 =95%乙醇保存 , 血液用 =5%肝素鈉抗凝。1. 2 DNA 提取 , PCR 反應(yīng)和 DNA 測序DNA 提取采用乙醇沉 淀法 , 參照 R and&i Lucch i n i 1。用特 異引物 P HDL(5-AGGACTACGGC TT GAAAAGC-3 、 P H 1H (5 -TTATGTGCTTGACCGAGGAA CCAG -3 、 L400(5 -ATTTATTGATCGTC C ACCTCACG -3 和 PHDH (5 -CATCTTGGC ATCTTC AGTGC

16、C -3 1進(jìn)行 PCR 反應(yīng) , 體積為 35 L , 反應(yīng)液中含 10mm ol/LTris-H C l(pH 8. 3, 50mmo l/LKC , l 1. 5mm o l/LM gC l 2, Taq 酶 1U, 4種 dNTP 各 150 m o l/L, 2個引物各 10pm ol/L, DNA 模板約 100ng 。反應(yīng)在 PE2400儀上進(jìn)行。循環(huán)參數(shù)為 95預(yù)變性 4m i n , 然后 95變性 40s , 5558復(fù)性 40s , 72延伸 60s , 共 32個循環(huán) , 最后 72 10m in 延伸補(bǔ)齊。提取和擴(kuò)增都設(shè)空白對照 , 并用 1%的瓊脂糖電泳檢測。擴(kuò)增產(chǎn)

17、物用 W izar d TM PCR Preps DNA 純化試劑盒 (Pro m ega 公司 純化 , 然后在 AB I 377基因分析儀上進(jìn)行雙向測序。1. 3 序列分析用 C lustaW l 程序 9對 DNA 序列進(jìn)行對位排列 , 并經(jīng)人工仔細(xì)核查。用 MEGA 10中的 K i m ura 11的 雙參數(shù)模型計算序列變異和遺傳距離。2 結(jié) 果2. 1 大石雞和石雞線粒體 DNA 控制區(qū)序列及序列變異一般雞形目 (Ga llfor m es 鳥類控制區(qū)長度約 1. 1kb 12, 石雞屬鳥類控制區(qū)的長度比較保守 (1155 ! 2 bp 1。用 C lusta lW 軟件進(jìn)行對位排

18、列 , 測得石雞線粒體 DNA 控制區(qū)全序列長 1154bp, 大石雞是 1157bp 。與大石雞相比 , 石雞 m t D NA 控制區(qū)在第 187位、 第 1060位和第 1110位缺失 (圖 1 。 在所測的 18個石雞和 10個大石雞全序列中 , 兩者之間共發(fā)現(xiàn) 33個變異位點(diǎn) (不包括種內(nèi)變異位 點(diǎn) , 占序列長度的 2. 85%, 其中 20個轉(zhuǎn)換、 10個顛換和 3個缺失。 20個轉(zhuǎn)換中 , T-C 間的轉(zhuǎn)換 (11次 和 A -G 間 (9次 的接近 ; 10個顛換中 , A -T 間 4次 , A -C 間 3次 , G-C 間 2次 , G-T 間 1次。 兩種石雞之間 ,

19、 線粒體 DNA 控制區(qū) I 區(qū) (1316 有 18變異位點(diǎn) , 序列變異率為 5. 70%, II 區(qū) (317 784 僅 3個變異位點(diǎn) , 序列變異率為 0. 64%, III 區(qū) (7851157 有 12個變異位點(diǎn) , 序列變異率為 3. 22%。 控制區(qū)全序列的平均變異率為 2. 85%。圖 1 石雞和大石雞 m t DNA 控制區(qū)全序列F i g . 1 T he entire m t DNA D -l oop o f A lectoris chukar and A. magna2. 2 堿基含量石雞 m t D NA 控制區(qū)的堿基含量是 :T32. 13%, C27. 17%

20、, A26. 43%和 G14. 23%, 大石雞的分別是 T32. 30%, C26. 79%, A26. 10%和 G14. 81%。 t -檢驗(yàn)分析顯示 , 石雞和大石雞 m t D NA 控制區(qū)的 4種堿 基含量差異都極顯著 T(t =4. 28, p <0. 001, n =28 、 C (t =5. 56, p <0. 001, n =28 、 A (t =4. 65, p < 0. 001, n =28 、 G (t =9. 68, p <0. 001, n =28 。石雞 m t D NA 控制區(qū) 3個區(qū)的 A +T 含量分別是 57. 52%, 49.

21、 93%和 70. 41%(圖 2, 大石雞的分別 是 57. 16%, 49. 84%和 70. 53%(圖 3 。石雞和大石雞 m t D NA 控制區(qū) III 區(qū) G 的含量非常低 , 分別只有 7. 85%和 8. 03%, 而 A 的含量非常高 , 分別達(dá)到 37. 57%和 37. 82%。2. 3 遺傳距離根據(jù)全序列計算 , 石雞和大石雞間的遺傳距離為 0. 0384; 根據(jù) I 區(qū)序列計算 , 兩種石雞間的遺傳距 0. 1, 0. 圖 2 石雞 m t DNA 控制區(qū) 3個區(qū)的堿基含量 F i g . 2 N uc leo ti de compositi ons o fm t

22、DNA contro l -reg i on t hree dom ai ns i n Chukar partr i dge 圖 3 大石雞 m t DNA 控制區(qū) 3個區(qū)的堿基含量 F i g . 3 N uc leo ti de compositi ons o fm t DNA contro l -reg i on three dom ains i n P rzew laksi pa rtridge 3 討 論石雞和大石 雞 m t D NA 控 制區(qū)全序列的 A +T 含量都超過了一半 , 特別是 III 區(qū) , 都高達(dá) 70%多 , 這與 m t D NA 控制區(qū)是 #A 和T 豐富區(qū)

23、 一致。兩種石雞之間 , 線粒體 DNA控制區(qū) I 區(qū)、 II 區(qū)和 III 區(qū)的序列變異率分別為 5. 70%, 0. 64%和3. 22%。 I 區(qū)的序列變異率是 控制區(qū)全序列平均變異率的 2倍。線粒體 DNA 控制區(qū) I 區(qū)只有 316bp , 占全序列的 27. 31%, 其變異位點(diǎn) (18個 占全序列變異位 點(diǎn)(33個 的 54. 54%。可見 線 粒體 DNA 控 制區(qū) I 區(qū)的序列變 異率最高 , II 區(qū)的最低 , I 區(qū)是 II 區(qū)的 8. 9倍。鳥類 m t D NA 控 制區(qū)的進(jìn) 化速度是 2%/1Ma 13, 根據(jù)兩種石雞全序列計算的遺傳距離 (0. 0384, 它們分

24、歧進(jìn)化的時間約為 190萬年。以此計算 , m t D NA 控制區(qū) 3個區(qū)的進(jìn)化速率分別為 :3. 7%/Ma , 0. 6%/M a 和 1. 5%/Ma 。可見石雞屬線粒體 DNA 控制區(qū) 3個區(qū)的 進(jìn)化速率不一樣 , I 區(qū)最快 , II 區(qū)最慢。石雞 m t D NA 控制區(qū)全序列長 1154bp , 大石雞的是 1157bp ; 兩種石雞間的 4種堿基含量差異都 極顯著 ; 兩者之間的遺傳距離達(dá)到 0. 0384; 這些結(jié)果支持石雞和大石雞是兩個獨(dú)立的種。根據(jù)分子 鐘 , 它們的分歧時間大約在 190萬年前 , 屬于更新世早期。兩種石雞分歧進(jìn)化的年代與更新世第二次寒 冷期 (128

25、205萬年 14發(fā)生的時間吻合。更新世時期世界氣候劇烈變動 , 歐亞大陸冰期間冰期交替 發(fā)生 , 幾乎每 10萬年就有一次較大的冰期 15。更新世地理環(huán)境和氣候的演變對物種的形成、 演化產(chǎn)生 重大影響 16, 17。晚上新世到早更新世 , 喜馬拉雅山已抬升至 3000m 左右 18, 阻擋了西南季風(fēng)向北侵 入 , 中亞成為干旱中心。兩種石雞屬都是適應(yīng)干旱環(huán)境的鳥類 , 其祖先可能起源于中亞的干旱地區(qū)。更 新世第二次寒冷期持續(xù)的時間達(dá) 77萬年 , 是更新世幾次寒冷期持續(xù)時間最長的 , 對我國兩種石雞的物 種形成可能起決定性作用。由于這次寒冷期的影響 , 石雞和大石雞的祖先種群被隔離在中亞不同的

26、低 山盆地 , 分別獨(dú)立進(jìn)化 , 形成兩個物種。致謝 :意大利 E ttore R andi 博士提供引物 ; 周天林教授幫助采集了樣品 , 謹(jǐn)致謝忱 !參考文獻(xiàn) :1R and i E , Lucch i n iV. O rgan i za ti on and evo l ution o f the m itochondria lDNA contro l reg i on i n t he av ian genus A lector is J.Journa l ofM o lecu l ar Evo l ution , 1998, 47(4:449-62.2M ac K ay S L D ,

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