倍美力對(duì)去卵巢癡呆模型大鼠行為學(xué)及不同腦區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的干預(yù)作用

1、    倍美力對(duì)去卵巢癡呆模型大鼠行為學(xué)及不同腦區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶的干預(yù)作用作者：安蓮華 柏玉萍 李貞蘭 張昱 趙珩 作者單位：吉林大學(xué)第一醫(yī)院老年病科，吉林 長(zhǎng)春 130021【摘要】 目的 觀察去卵巢癡呆大鼠行為學(xué)及額葉皮質(zhì)、基底前腦、海馬CA1區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)的變化及倍美力對(duì)其影響，探討倍美力的腦保護(hù)機(jī)制。方法 采用穹窿海馬傘切除術(shù)及雙側(cè)卵巢切除制備癡呆及雌激素缺乏復(fù)合模型鼠，采用Morris水迷宮觀察其行為學(xué)變化，利用RTPCR法觀察大鼠額葉皮質(zhì)、基底前腦、海馬CA1區(qū)ChAT mRNA的變化。結(jié)果 倍美力干預(yù)組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力增強(qiáng)，

2、額葉皮質(zhì)、基底前腦、海馬CA1區(qū)ChAT mRNA表達(dá)增加(均P<0.01)。結(jié)論 倍美力可通過增加額葉皮質(zhì)、基底前腦、海馬CA1區(qū)ChAT mRNA表達(dá)，改善模型鼠學(xué)習(xí)及記憶能力。【關(guān)鍵詞】 倍美力 老年性癡呆 膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶Effect of Premarin on praxiology and choline acetyltransferase in different cerebral regions of ovariectomized rats with dementiaAN LianHua, BAI YuPing, LI ZhenLan, et al.Department o

3、f Geriatrics, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China【Abstract】 Objective To observe the changes of praxiology and choline acetyltransferase (ChAT) in cerebral cortex, basal forebrain and hippocampi CA1 of rats after ovariectomized and transected hippocampal fimbriafor

4、nix and protective effect of premarin on brain. Methods The model of AD and ovariectomized (OVX) rats was established by transecting hippocampal fimbriafornix and OVX. Morris Water maze was used to test the ability of learning and memory function in each group. The expression of ChAT mRNA was measur

5、ed by RTPCR separately in different cerebral regions of rats. Results Premarin group had the enhanced ability of learning and memory function, the increased expressions of ChAT mRNA in different regions.Conclusions Premarin could increase the expression of ChAT mRNA in different cerebral regions of

6、rats and improve the ability of learning and memory function.【Key words】 Premarin;Alzheimer's disease(AD);Choline acetyltransferase流行病學(xué)調(diào)查表明，絕經(jīng)后婦女阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病率較同年齡組的男性高出1.53倍1，故推測(cè)雌激素的缺乏可能是導(dǎo)致AD發(fā)病的因素之一。神經(jīng)生物化學(xué)研究顯示，AD患者基底前腦膽堿能神經(jīng)元約有90%喪失，海馬和皮層錐體細(xì)胞的突觸及突觸煙堿受體、突觸前M型受體亦減少。AD患者乙酰膽堿(ACh)合成減少，膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)活

7、性下降，且與癡呆嚴(yán)重程度密切相關(guān)。本研究利用穹隆海馬傘切斷及去除雙側(cè)卵巢(OVX)較成功地模擬AD膽堿能神經(jīng)元缺失及雌激素缺乏，建立雌激素缺乏及癡呆復(fù)合動(dòng)物模型2，觀察倍美力對(duì)該模型大鼠行為學(xué)及額葉皮質(zhì)、基底前腦、海馬CA1區(qū)ChAT的影響，為倍美力治療AD提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 動(dòng)物分組與模型制備健康雌性Wister大鼠30只，鼠齡4個(gè)月，體重250300 g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。隨機(jī)分成對(duì)照組模型組倍美力組，每組各10只。模型組倍美力組：參照大鼠腦立體定位圖譜取前囟后2.2 mm，中線左右各旁開1.0 mm處，牙鉆鉆開顱骨，切開骨膜，用雙刃刀片(寬3.0 mm

8、，長(zhǎng)30.0 mm)在上述部位的腦表面行冠狀切口，然后降刀4.5 mm，上下提抽刀20次，確保雙側(cè)海馬傘外側(cè)緣完全切斷，制備AD模型鼠。1 w后將上述10只鼠麻醉后切除雙側(cè)卵巢制備雌激素缺乏復(fù)合AD模型鼠;對(duì)照組：僅做顱骨鉆孔，不切斷海馬傘，僅切開腹腔，切除少量卵巢周圍脂肪。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)后常規(guī)喂養(yǎng)。卵巢切除術(shù)后2 w，倍美力組大鼠灌胃(按每天倍美力0.065 mg/kg，溶于1.5 ml生理鹽水中)，每日1次;模型組和對(duì)照組給與1.5 ml生理鹽水灌胃作對(duì)照，共8 w。其后對(duì)所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物做如下處理：Morris水迷宮測(cè)試4 d;第5天將大鼠斷頭處死，在冰上迅速剝離出額葉皮質(zhì)基底前腦海馬，將分

9、離出的組織分別稱重后放入Epp管中，置入液氮中快速冷凍后放入-80冰箱中保存?zhèn)銹CR用。1.2 學(xué)習(xí)、記憶功能測(cè)定采用Morris水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)進(jìn)行測(cè)試，歷時(shí)4 d。將大鼠面向池壁，分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入池中，記錄大鼠尋找到平臺(tái)所需時(shí)間即為逃避潛伏期時(shí)間。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后撤掉平臺(tái)，將大鼠任選一入水點(diǎn)放入池中，測(cè)其2 min內(nèi)跨越平臺(tái)所在位置的次數(shù)，記錄平均次數(shù)。1.3 RTPCR反應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)Trizol法分別提取額葉皮質(zhì)、基底前腦、海馬CA1區(qū)腦組織細(xì)胞總RNA，采用TaKaRa的二步法試劑盒說明書操作逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR。ChA T引物：上游：5CGTGGGCATG

10、CACATACTGTC3，下游：5CCCGTAAACCAGAAAGTAGGA3，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度403 bp,反應(yīng)體系40 l，ChAT變性94 30 s,退火55 30 s,延伸72 10 min,共30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物以1.2%瓊脂糖電泳檢測(cè)，長(zhǎng)波紫外燈下觀測(cè)照像，電泳結(jié)果以圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行電泳條帶光密度分析，計(jì)算產(chǎn)物ChAT與actin產(chǎn)物光密度積分的比值，作為ChAT mRNA的表達(dá)水平。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。2 結(jié) 果2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)從表1中可見模型組大鼠逃避潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng);

11、跨越平臺(tái)次數(shù)顯著減少，較對(duì)照組和倍美力組有明顯差異(P<0.01)，而對(duì)照組和倍美力組之間無明顯差異。表1 各組大鼠水迷宮學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)比較(略)2.2 ChAT mRNA表達(dá)水平模型組大鼠大腦皮質(zhì)、基底前腦、海馬CA1區(qū)ChAT mRNA表達(dá)水平明顯降低，與對(duì)照組有顯著差異(P<0.01);倍美力組不同腦區(qū)ChAT mRNA表達(dá)水平明顯提高，與模型組有顯著差異(P<0.01)，與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表2、圖1)。表2 各組大鼠不同腦區(qū)ChAT mRNA表達(dá)水平(略)3 討 論AD是與年齡相關(guān)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性、進(jìn)行性變性疾病，以認(rèn)知障礙、老年斑(SP)、神經(jīng)原纖維

12、纏結(jié)(NFT)顆粒空泡變性為主要特征3。近年來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者為探討AD的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)有效的藥物，相繼探討了一些模擬AD的動(dòng)物模型及治療策略，但導(dǎo)致AD的關(guān)鍵機(jī)制尚不十分清楚，而建立與治療藥物存在因果關(guān)系的AD模型尤為重要。腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的損害是造成AD的重要原因之一4，膽堿能神經(jīng)元分泌的神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(ACh)是與認(rèn)知功能密切相關(guān)的中樞神經(jīng)遞質(zhì)，ACh水平下降可導(dǎo)致動(dòng)物的認(rèn)知障礙和學(xué)習(xí)、記憶能力減退5。而Ach的產(chǎn)生釋放與傳遞是通過腦內(nèi)中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的，該系統(tǒng)的膽堿能神經(jīng)元胞體主要位于內(nèi)側(cè)隔核(medial septum，MS)Broca斜角帶及Meynert基底核等，其投射纖維

13、到大腦新皮質(zhì)海馬的廣泛區(qū)域6，這一投射系統(tǒng)與認(rèn)知功能，學(xué)習(xí)、記憶能力密切相關(guān)，其任何一個(gè)環(huán)節(jié)被阻斷或損壞都可導(dǎo)致動(dòng)物的認(rèn)知障礙和學(xué)習(xí)記憶能力減退7，8。依據(jù)損壞方式的不同，可分為化學(xué)毀損、物理毀損、外科毀損等類型，其中雙側(cè)穹窿海馬傘切斷(hippocampal fimbriafornix，F(xiàn)F)因其方法簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)有效，較廣泛地應(yīng)用在藥物治療AD的研究中。Blusztajn等9研究證實(shí)：?jiǎn)蝹?cè)穹窿海馬傘切斷的動(dòng)物存活12 w后，損傷同側(cè)MS膽堿能神經(jīng)元較對(duì)側(cè)減少50%60%，斜角帶垂直支約減少40%。水迷宮測(cè)試該模型鼠的獲取能力和記憶能力明顯減低，表明該模型是一種較為理想的膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)損害模型。采

14、用雌激素替代治療(ERT)可以降低或延緩AD的發(fā)生10，11,提示認(rèn)知水平的下降與雌激素水平降低有關(guān)，且雌激素可以改善認(rèn)知水平。乙酰膽堿(Ach)是與認(rèn)知功能密切相關(guān)的重要神經(jīng)遞質(zhì)之一12，腦脊液中Ach水平與癡呆程度呈負(fù)相關(guān)13,Ach代謝降低與動(dòng)物認(rèn)知障礙有關(guān)。Ach由ChAT催化合成，由AchE催化分解，通過Ach受體發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。ChAT主要分布在突觸前神經(jīng)末梢內(nèi)，基底前腦的一些區(qū)域如MS和斜角帶垂直支、Meynert基底核的膽堿能系統(tǒng)能夠向大腦和海馬投射纖維，與學(xué)習(xí)、記憶有重要關(guān)系，故切斷FF后，可引起海馬膽堿能纖維缺失，動(dòng)物則表現(xiàn)出認(rèn)知功能減退，學(xué)習(xí)、記憶能力下降。ChAT是膽

15、堿能神經(jīng)的標(biāo)志酶，故常作為研究膽堿能神經(jīng)的間接生物指標(biāo)14。動(dòng)物研究證實(shí)ERT可以逆轉(zhuǎn)癡呆模型鼠攝取膽堿量的減少，以及神經(jīng)細(xì)胞中AchE數(shù)量的下降，阻止神經(jīng)生長(zhǎng)因子和腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子的mRNA量的降低，提高大鼠大學(xué)習(xí)、記憶能力。雌激素在AD發(fā)病機(jī)制可能在于對(duì)膽堿能的調(diào)節(jié)15，其含量下降將導(dǎo)致膽固醇和磷脂轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，造成Ach合成不足，同時(shí)雌激素可促進(jìn)基底前腦ChAT活性，通過上調(diào)膽堿能系統(tǒng)而減緩AD發(fā)展16。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，切斷雙側(cè)FF及OVX后，大鼠額葉皮質(zhì)、基底前腦、海馬CA1區(qū)ChAT mRNA表達(dá)降低，學(xué)習(xí)、記憶能力下降，而補(bǔ)充倍美力后促進(jìn)額葉、基底前腦、海馬CA1區(qū)ChAT mR

16、NA表達(dá),從而改善了大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了基底前腦膽堿能神經(jīng)元投射到海馬的纖維通路及中樞膽堿能系統(tǒng)在AD病理機(jī)制中的重要地位，亦證實(shí)倍美力具有腦保護(hù)作用?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Halpern DF.Sex diferentes in cognitive abilitiesM.3rd ed.Hillsdale,NJ:Law rence Erlbaum Associates,2000:177.2 Singh M,Meyer EM,Millard WY,et al.Ovarian steroid deprivqtion results in a reversible learning

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