轉(zhuǎn)化生長因子-β3在2,3,7,8-四氯二惡英誘導(dǎo)的胎鼠腭裂組織中

1、轉(zhuǎn)化生長因子-3在2,3,7,8-四氯二噁英誘導(dǎo)的胎鼠腭裂組織中的表達(dá)變化蒲亞蘭，劉麗玲，甘立強(qiáng)，傅躍先基金項(xiàng)目 重慶市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2009BA5085）通信作者 傅躍先，電話：（023）63632270，Email：yuexianfu (400014 重慶，重慶醫(yī)科大學(xué)兒童發(fā)育疾病研究省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)提要 目的 檢測腭發(fā)育關(guān)鍵時(shí)段腭突組織中轉(zhuǎn)化生長因子3（Transforming growth factor-3,TGF-3）的表達(dá)變化，探討TGF-3在2,3,7,8-四氯二噁英(2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p- dioxin, TCDD）誘導(dǎo)C5

2、7BL/6J胎鼠腭裂發(fā)生中的作用。方法 在小鼠懷孕第10天（Gestation day 10,GD 10），實(shí)驗(yàn)組以TCDD 64 µg/kg灌胃，對照組以玉米油16 ml/kg灌胃，于GD 18.5解剖顯微鏡下觀察胎鼠腭裂的發(fā)生率，并于GD 13.5、GD 14.5和GD 15.5剪取胎鼠腭突組織提取RNA及蛋白，采用RT-PCR和Western blot分別檢測腭突組織中TGF-3 mRNA和TGF-3蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 GD 18.5實(shí)驗(yàn)組腭裂的發(fā)生率為100%（39/39），對照組無腭裂發(fā)生(0/42)。GD 13.5、GD 14.5及GD 15.5實(shí)驗(yàn)組TGF-3 mRN

3、A和TGF-3蛋白的表達(dá)均較對照組顯著增高（P<0.05）。結(jié)論 TCDD可誘導(dǎo)C57BL/6J胎鼠形成穩(wěn)定的腭裂實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并顯著上調(diào)胎鼠腭突組織中TGF-3的表達(dá)，TGF-3的過高表達(dá)可能是TCDD誘發(fā)先天性腭裂的主干信號通路之一。關(guān)鍵詞腭裂；2,3,7,8-四氯二噁英；轉(zhuǎn)化生長因子3中圖法分類號 R726.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 AThe expression of TGF-3 in 2, 3, 7, 8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin induced palatal cleft in mice PU Yalan, LIU Liling, GAN Liqiang,

4、 FU Yuexian (Department of Key Laboratory of Developmental Diseases in Childhood，Ministry of Education，Chongqing Medical University, Chongqing, 400014，China)Abstract Objective To explore the effect of transforming growth factor-3 (TGF-3) on palatal cleft of C57BL/6J mice induced by 2,3,7,8-Tetrachlo

5、rodibenzo- p-dioxin(TCDD) . Methods On gestation day 10(GD 10), the pregnant mice were randomly divided into two groups: the treated group mice were dosed with 64 µg TCDD/kg body weight, while the control group mice received 16 ml corn oil/ kg body weight. The embryos were examined under stereo

6、microscope to detect the incidence of cleft palate on GD 18.5, and the palatal shelves were dissected from the embryos for RNA and protein extractions on GD 13.5, GD 14.5 and GD 15.5. At last，the expression of TGF-3 mRNA and protein were respectively investigated by RT-PCR and Western blot. Results

7、Total frequency of clefts was 100% in TCDD group (39/39), and there was no cleft in the control group (0/42). The expression of TGF-3 mRNA and protein were gradually up-regulated in TCDD group on different phases of the developing palatal shelves(P0.05). Conclusion TCDD can induce a stable formation

8、 of cleft palate and up-regulate the expression of TGF-3, and the over expression of TGF-3 might be a key signal pathway resulting in TCDD-induced cleft palate.Key words cleft palate； 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin； transforming growth factor-3Supported by the Key Program of National Science Fo

9、undation of Chongqing (2009BA5085). Corresponding author: FU Yuexian, Tel: 86-23-63632270, E-mail:yuexianfu4先天性腭裂是由遺傳和環(huán)境因素相互作用導(dǎo)致的多因素畸形。在眾多環(huán)境因素中，2,3,7,8-四氯二噁英(2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD）被引起了廣泛的重視。研究證實(shí)，TCDD是毒性最強(qiáng)的環(huán)境致畸物并可誘發(fā)小鼠腭裂1。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TCDD誘導(dǎo)的胎鼠腭裂其腭突組織中轉(zhuǎn)化生長因子-3（Transforming growth fact

10、or-3, TGF-3）的表達(dá)在孕第14.5天（Gestation day 10,GD 14.5）明顯增高2，但對于整個(gè)腭突融合過程中TGF-3的表達(dá)變化情況，罕見國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，著重對腭發(fā)育的主要時(shí)點(diǎn)腭突組織中TGF-3的表達(dá)進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，以全面了解TGF-3在TCDD誘導(dǎo)胎鼠腭裂發(fā)生中所扮演的角色。1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物810周齡、體重2023 g清潔級C57BL/6J小鼠，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心許可證號：SCXK（渝）20050002。1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 玉米油（Sigma-Aldrich，USA），TCDD（Sigma-Aldrich，USA）

11、，RNApure高純總RNA快速抽提試劑盒（離心柱型）（百泰克，中國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（IBM，美國），2×Power Taq PCR MasterMix（百泰克，中國），瓊脂糖（TaKaRa, 日本），蛋白提取試劑盒（凱基，中國），蛋白定量試劑盒（百泰克，中國），SDS-PAGE凝膠試劑盒（凱基，中國），PVDF膜（millipore，美國），小鼠TGF-3單克隆抗體（abcam, USA）,抗GAPDH鼠單克隆抗體（康為世紀(jì)，中國），山羊抗小鼠IgG（H+L）-HRP二抗（康為世紀(jì)，中國），ECL檢測試劑盒（凱基，中國）。1.3 動(dòng)物模型的建立12只孕鼠于GD 10隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和

12、對照組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組予以TCDD 64 µg/kg（用玉米油配制成4 µg/ml)灌胃，對照組予以等量（16 ml/kg）玉米油灌胃。于GD 18.5頸椎脫臼法處死孕鼠，剖腹取出胎鼠，解剖顯微鏡下觀察腭突發(fā)育情況，并統(tǒng)計(jì)腭裂發(fā)生率。1.4 總RNA和總蛋白的提取及定量檢測 18只孕鼠于GD 10隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組9只，處理方法同上。由于分子表達(dá)的時(shí)空特異性，提取RNA和蛋白時(shí)，根據(jù)標(biāo)本的采集時(shí)間不同，每組又分為3個(gè)亞組：GD 13.5、GD 14.5、GD 15.5，每個(gè)亞組3只孕鼠，在解剖顯微鏡下剪取腭突組織，按試劑盒操作說明分別提取總RNA和總蛋白，然后用

13、ND100 0分光光度儀測定RNA濃度及OD260OD280值，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。1.5 RT-PCR檢測TGF-3 mRNA表達(dá)各取2 µg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，方法參照產(chǎn)品說明書。根據(jù)GenBank中公布小鼠TGF-3基因序列，按照引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物序列如下：TGF-3上游引物：5-GCC CTG GAC ACC AAT TAC TGC TT-3，下游引物：5 -GCA CTT ACA CGA CTT CAC CAC CAT-3，PCR擴(kuò)增片段長度為333 bp；內(nèi)參-actin上游引物：5-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GC-3，下游引

14、物：5 -CCA CAG GAT TCC ATA CCC AA-3，PCR擴(kuò)增片段長度為446 bp。所有引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 7.0 µl、2×Power Taq PCR MasterMix (含染料) 10.0 µl、上游引物0.5 µl、下游引物0.5 µl、cDNA 2.0 µl，總體系 20.0 µl。PCR反應(yīng)條件為：94預(yù)變性5 min，94變性30 s, 62退火30 s，72延伸50 s，共30個(gè)循環(huán)，最后72再次延伸5 min。各取5 µl

15、PCR產(chǎn)物在含EB的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，140 V，40 min；然后在紫外凝膠成像儀上成像分析，以特異性擴(kuò)增產(chǎn)物條帶與相應(yīng)內(nèi)參條帶吸光度比值表示TGF-3mRNA的表達(dá)水平。1.6 Western blot檢測TGF-3蛋白的表達(dá)各取50 µg總蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入TGF-3一抗（3 µg/ml）或GAPDH一抗（1:100 0）4孵育過夜，次日加入山羊抗小鼠二抗（1:300 0）室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，自動(dòng)凝膠成像分析儀上成像分析，以TGF-3蛋白條帶的積分灰度值與GAPDH的積分

16、灰度值的比值表示TGF-3蛋白的表達(dá)水平。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±)表示，兩樣本間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)(方差不齊者采用t檢驗(yàn))。 P<0.05，視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 TCDD誘導(dǎo)胎鼠腭裂模型的建立GD 18.5，兩組胎鼠均為活胎，無死胎及胎吸收。實(shí)驗(yàn)組6只小鼠孕有39只胎鼠，全部為腭裂。對照組6只小鼠孕有42只胎鼠，無腭裂發(fā)生。實(shí)驗(yàn)組、對照組胎鼠腭部大體解剖學(xué)表現(xiàn)見圖1。A為對照組（×20）；B為實(shí)驗(yàn)組（×20）圖1 GD18.5胎鼠腭部大體解剖學(xué)表現(xiàn)（黑色箭頭所指為小鼠腭部

17、）2.2 TGF-3 mRNA的表達(dá)情況RT-PCR顯示，實(shí)驗(yàn)組腭突內(nèi) TGF-3 mRNA的表達(dá)在GD 13.5, GD 14.5和GD 15.5均明顯增高，與對照組比較具有顯著差異（P<0.05）（圖2，表1）。M600bp100bp 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12M：DNA標(biāo)準(zhǔn)（DL600）；16為對照組；712為實(shí)驗(yàn)組；13和1012為-actin（446 bp）；49為TGF3（333 bp）；1、4、7、10為GD13.5；2、5、8、11為GD14.5；3、6、9、12為GD15.5圖2 RT-PCR檢測TGF-3 mRNA在胎鼠腭突中表達(dá)表1 實(shí)

18、驗(yàn)組和對照組不同時(shí)間點(diǎn)TGF-3 mRNA相對內(nèi)參表達(dá)值(n=3，±) GD13.514.515.5對照組0.081±0.0200.178±0.0110.113±0.016實(shí)驗(yàn)組0.392±0.056a0.467±0.064b0.192±0.032ca： P<0.05（t=-12.732），b：P<0.05（t=10.854），c：P<0.05（t=5.406），與對照組比較2.3 TGF-3蛋白的表達(dá)情況與TGF-3 mRNA表達(dá)情況一致，Western blot顯示實(shí)驗(yàn)組腭突內(nèi) TGF-3 蛋白的表達(dá)在

19、GD 13.5,GD 14.5和GD 15.5均明顯增高，與對照組比較具有顯著差異（P<0.05）（圖3，表2）。TGF-3（47×103） 1 2 3 4 5 6GAPDH（36×103）13為實(shí)驗(yàn)組；46為對照組；1、4為GD13.5；2、5為GD14.5；3、6為GD15.5圖3 Western blot 檢測TGF-3 蛋白在胎鼠腭突中表達(dá)表2 實(shí)驗(yàn)組和對照組不同時(shí)間點(diǎn)TGF-3蛋白相對內(nèi)參表達(dá)值(n=3，±) GD13.514.515.5對照組0.017±0.0010.039±0.0030.005±0.001實(shí)驗(yàn)組0.

20、046±0.009a0.089±0.015b0.028±0.003ca：P<0.05（t=5.678），b：P<0.05（t=5.615），c： P<0.05（t=13.715），與對照組比較3 討論腭的發(fā)育是一個(gè)多因素綜合作用的過程，包括腭突生長、上抬及融合等步驟。胎鼠GD 10.5左右，球狀突和上頜突形成上唇和原腭；GD 12.5GD 13.5，腭板在舌體兩側(cè)垂直生長；GD 14.5，腭板上抬至舌體上方水平位置；然后，兩側(cè)腭板水平方向繼續(xù)生長于中線處接觸，使腭中嵴上皮細(xì)胞（Medial edge epithelial, MEE）暫時(shí)呈復(fù)層上皮

21、細(xì)胞形成腭中線（Midline epithelial seam, MES）3。隨后MEE經(jīng)細(xì)胞凋亡、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial mesenchymal transformation, EMT）及MEE向口腔/鼻腔樣上皮轉(zhuǎn)化4-6而消失。GD 15.5，腭板進(jìn)一步間充質(zhì)化融合。這一進(jìn)程中的任何環(huán)節(jié)發(fā)生異常都會(huì)導(dǎo)致腭裂的產(chǎn)生。TCDD是毒性最強(qiáng)的環(huán)境污染物之一，廣泛來源于汽車尾氣、化工冶金工業(yè)、垃圾焚燒等7。TCDD分布廣泛、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易于經(jīng)環(huán)境復(fù)合物及食物鏈在生物體內(nèi)積聚8。尤其是對兒童，TCDD可導(dǎo)致廣泛的生理和毒理反應(yīng)，包括生殖和發(fā)育缺陷1，如先天性腭裂和腎積水等。早期研究發(fā)現(xiàn)，

22、GD 9.0GD 12.0是二噁英誘導(dǎo)胎鼠腭裂的敏感窗口期9。故，本實(shí)驗(yàn)選擇在GD 10.0 給藥，劑量參照國外文獻(xiàn)報(bào)道的64 µg/kg10，遂成功誘導(dǎo)出胎鼠腭裂模型，腭裂發(fā)生率為100%，無死胎及胎吸收等現(xiàn)象，較李承浩等11用24 µg/kg TCDD誘導(dǎo)胎鼠腭裂55.56%的發(fā)生率顯著增高。TGF-3為TGF-超家族成員，有廣泛的生物學(xué)作用，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、EMT及細(xì)胞凋亡等12。TGF-3為腭突發(fā)育過程中的關(guān)鍵因子，特異性地表達(dá)于胎鼠腭突形成關(guān)鍵時(shí)期的MEE中13，促進(jìn)MEE細(xì)胞凋亡、EMT及MEE向口腔/鼻腔樣上皮轉(zhuǎn)化4-6，進(jìn)而促進(jìn)腭突融合；TGF3-/-胎鼠

23、MEE細(xì)胞凋亡減少、EMT減弱，導(dǎo)致細(xì)胞附著受損、腭板融合不能6，最終形成腭裂。以上研究說明，TGF-3缺乏可導(dǎo)致先天性腭裂的發(fā)生。然而，環(huán)境污染物TCDD誘導(dǎo)的腭裂組織中TGF-3的表達(dá)情況是怎么樣的呢？課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，TCDD顯著上調(diào)腭突融合關(guān)鍵點(diǎn)GD 14.5胎鼠腭突組織中TGF-3的表達(dá)2。本研究在此基礎(chǔ)上更為系統(tǒng)、全面地研究了腭突融合前（GD 13.5）、融合時(shí)（GD 14.5）及融合后（GD 15.5）TGF-3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組TGF-3 mRNA和TGF-3蛋白的表達(dá)水平在GD 13.5、GD 14.5和GD 15.5均較對照組顯著增高，進(jìn)一步證實(shí)了TCDD在腭

24、突融合的各個(gè)主要時(shí)段顯著上調(diào)胎鼠腭突組織中TGF-3的表達(dá)。并進(jìn)一步確認(rèn)，TGF-3過高表達(dá)亦可引起腭裂的發(fā)生。在本研究中，腭裂組織中TGF-3表達(dá)較正常腭突組織明顯升高，與課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)2及臨床檢測14結(jié)果一致；但與柴茂洲等18研究結(jié)果差異較大。其研究結(jié)果是：TGF-3 mRNA的表達(dá)在GD 13.5無明顯變化，在GD 14.5和GD 15.5明顯降低。分析這種差異的可能原因有:所用誘導(dǎo)劑不完全相同。柴等18應(yīng)用的誘導(dǎo)劑是TCDD和地塞米松聯(lián)合誘導(dǎo)，而本研究僅用TCDD一種誘導(dǎo)劑。推測，TCDD和地塞米松對TGF-3信號通路的聯(lián)合作用機(jī)制與TCDD單獨(dú)對TGF-3信號通路的作用機(jī)制可能有

25、所不同。所用TCDD劑量不同。柴等15應(yīng)用TCDD的劑量為3 µg/kg，從GD 10開始連續(xù)3天灌胃；而本研究參照國外文獻(xiàn)報(bào)道方法予TCDD 64 µg/kg于GD 10一次灌胃10。故推測，TGF-3或其信號通路對不同劑量TCDD的反應(yīng)亦可能不同。本研究進(jìn)一步證實(shí)，TCDD可導(dǎo)致胎鼠腭裂的發(fā)生，并可顯著上調(diào)整個(gè)腭突融合過程中腭突組織中TGF-3的表達(dá)。TGF-3過高表達(dá)可能是TCDD誘發(fā)先天性腭裂的主干信號通路之一。但其具體的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn):1 Vorderstrasse BA, Fenton SE, Bohn AA, et al. A novel eff

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28、vitroJ. Differentiation, 2009, 77(2):209-220.5 Choi KY, Kim HJ, Cho BC, et al. A TGF-beta-induced gene, betaig-h3, is crucial for the apoptotic disappearance of the medial edge epithelium in palate fusion J. J Cell Biochem, 2009, 107(4): 818-825.6 Martínez-Alvarez C, Blanco MJ, Pérez R, et

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