微生物限度檢測方法驗證操作規(guī)程(2015年版)

1、微生物限度檢測方法驗證操作規(guī)程1 目的 確認所采用的方法適合于該產品的微生物限度檢測。2 依據 中國藥典 2015 版。3 范圍 所有需進行微生物限度檢測的產品。4 責任4.1 驗證小組負責檢驗方法驗證 /確認方案的起草、驗證 /確認方案的實施。4.2 驗證委員會負責驗證 /確認方案的審批，驗證 /確認結論的審核。5 程序5.1 由驗證小組提出驗證申請，驗證方案編制完成后，填寫確認和驗證方案審批表， 經驗證小組會簽，報驗證委員會審核，由生產負責人和質量負責人批準后，驗證方案編制 人對驗證小組其余人員進行培訓后，方可按驗證方案試驗。5.2試驗完成后及時編制驗證報告，并填寫驗證報告審批表，經驗證小

2、組會簽，報驗證 委員會審核，由生產負責人和質量負責人批準后，驗證報告結論才可實施。6 內容6.1 概述 通過驗證以確認所采用的方法適合于該產品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的測定 及控制菌的檢查。根據樣品特性制訂檢驗方法和檢驗條件，按制定的方案進行試驗，根據 驗證結果判斷是否符合驗證標準。若符合，按驗證的方法和條件進行產品的微生物限度檢 查；若不符合，重新建立制訂檢驗方法和檢驗條件，再進行驗證，直至驗證結果符合設立 的驗證標準。6.2 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)方法的驗證6.2.1 驗證用菌株銅綠假單胞菌 CMCC（B）10 104 金黃色葡萄球菌 CMCC （B）26003 枯草芽孢桿

3、菌 CMCC （B）63501 黑曲霉 CMCC （F）98003 白色念珠菌 CMCC （F）980016.2.2 驗證用菌液制備6.2.2.1 接種銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中， 于3035C培養(yǎng)1824小時。取上述培養(yǎng)物各1ml，用0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無 菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸液，備用。6.222接種白色念珠菌至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，于2025C培養(yǎng)23天。取上述培養(yǎng)物1ml,用0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的菌懸 液，備用。6.2.2.3接種黑曲霉至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，于20

4、25E培養(yǎng)57天，加入含0.05%(ml/ml)聚山梨脂80的0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液，將抱子 洗脫。然后，用適宜方法吸出抱子懸液至無菌試管內，用含0.05% ( ml/ml )聚山梨脂80的0.9%無菌氯化鈉溶液或pH7.0無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液制成適宜濃度的抱子懸液，備用。6.2.3 供試液的制備6.2.3.1 水溶性供試試品取供試品，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋 制成1: 10供試液。若需要，調節(jié)供試液pH值至6&必要時，用同一稀釋液將供試液進 一步10倍系列稀釋。水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試

5、液。6.2.3.2 水不溶性非油脂類供試品取供試品，用 pH7.0 無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基溶解或稀釋 制成1: 10供試液。分散力較差的供試品，可在稀釋液中加入表面活性劑如0.1%的聚山梨酯 80，使供試品分散均勻。若需要，調節(jié)供試液pH 值至 68。必要時，用一稀釋液將供試液進一步 10 倍系列稀釋。6.2.3.3油脂類供試品取供試品，加入無菌十四烷酸異丙酯使溶解，或與最少量并能使供試品乳化的無菌聚 山梨酯80或其他無抑菌性的無菌表面活性劑充分混勻。 表面活性劑的溫度一般不超過 40C (特殊情況下，最多不超過 45C),小心混合，若需要可在水浴中進行，然后加入預熱的

6、稀釋液使成 1: 10 供試液，保溫，混合，并在最短時間內形成乳狀液。必要時，用稀釋液 或含上述表面活性劑的稀釋液進一步 10 倍系列稀釋。6.2.3.4 腸溶制劑供試品取供試品10g，加入pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液，置45C水浴中，振搖，使溶解，制成1: 10的供試液。必要時，用一稀釋液將供試液進一步 10倍系列稀釋。6.2.4 接種和稀釋按下列要求進行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗用供試液。所加菌液的體 積應不超過供試液體積的1%。為確認供試品中的微生物能被充分檢出，首先應選擇最低 稀釋級的供試液進行計數(shù)方法適用性試驗。6.241試驗組取上述制備好的供試液，加入試驗菌液，混勻，使每

7、1ml供試液或每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu。6.2.4.2供試品對照組取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作。6.243菌液對照組取不含中和劑及滅活劑的相應稀釋液代替供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。若因供試品抗菌活性或溶解性較差的原因導致無法選擇最低稀釋級的供試液進行方 法適用性試驗時，應采用適宜的方法對供試液進行進一步的處理。如果供試品對微生物生 長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試 驗菌懸液進行方法適用性試驗。6.2.5抗菌活性的去除或滅活供試液接種后，按下列“微生物回收”規(guī)定的方法進行微生物計數(shù)。

8、若試驗組菌落數(shù) 減去供試品對照組菌落數(shù)的值小于菌液對照組菌落數(shù)值的50%，可采用下述方法消除供試品的抑菌活性。6.2.5.1增加稀釋液或培養(yǎng)基體積。6.2.5.2加入適宜的中和劑或滅活劑。中和劑或滅活劑（表1）可用于消除干擾物的抑菌活性，最好在稀釋液或培養(yǎng)基滅菌 前加入。若使用中和劑或滅活劑，試驗中應設中和劑或滅活劑對照組，即取相應量稀釋液 替代供試品同試驗組操作，以確認其有效性和對微生物無毒性。中和劑或滅活劑對照組的菌落數(shù)與菌液對照組的菌落數(shù)的比值應在0.52范圍內表1常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物可選用的中和劑或滅活方法戊二醛、汞制劑亞硫酸氫鈉酚類、乙醇、醛類、吸附物稀釋法醛類甘氨酸季

9、銨化合物、對羥基苯甲酸、雙胍類化合物卵磷脂季銨化合物、碘、對羥基苯甲酸聚山梨酯水銀巰基醋酸鹽水銀、汞化物、醛類硫代硫酸鹽EDTA、喹喏酮類抗生素鎂或鈣離子磺胺類對氨基苯甲酸P-內酰胺類抗生素P-內酰胺酶625.3采用薄膜過濾法。625.4上述幾種方法的聯(lián)合使用若沒有適宜消除供試品抑菌活性的方法，對特定試驗菌回收的失敗，表明供試品對該 試驗菌具有較強抗菌活性，同時也表明供試品不易被該類微生物污染。但是，供試品也可 能僅對特定試驗菌株具有抑制作用，而對其他菌株沒有抑制作用。因此，根據供試品須符 合的微生物限度標準和菌數(shù)報告規(guī)則，在不影響檢驗結果判斷的前提下，應采用能使微生 物生長的更高稀釋級的供試

10、液進行計數(shù)方法適用性試驗。若方法適用性試驗符合要求，應 以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢查。6.2.6供試品中微生物的回收計數(shù)方法適用性試驗用的各試驗菌應逐一進行微生物回收試驗。微生物的回收可采用 平皿法、薄膜過濾法或 MPN法。6.2.6.1平皿法平皿法包括傾注法和涂布法。每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備 2個平皿，從 算術平均值作為計數(shù)結果。6.2.6.1.1傾注法取照上述“供試液的制備” “接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活” 制備的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿可，注入1520ml溫度不超過45C熔化的 胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)

11、。若使用直徑較大的平 皿，培養(yǎng)基的用量應相應培養(yǎng)加。按表 1規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。同法測定供試品對照組及 菌液對照組菌數(shù)。計算各試驗組的平均菌落數(shù)。6.2.6.1.2涂布法取1520ml溫度不超過45C熔化的胰酪大豆胨瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂培 養(yǎng)基，注入直徑90mm的無菌平皿，凝固，制成平板，采用適宜的方法使培養(yǎng)基表面干燥。 若使用直徑較大的平皿，培養(yǎng)基用量也應相應增加。每一平板表面接種上述照“供試液的 制備”“接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液不少于 0.1ml。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)。計算各試驗組的平均菌 落數(shù)。6.2.6.2薄膜過濾法

12、薄膜過濾法所采用的濾膜孔徑應不大于0.45 m，直徑一般為50mm，若采用其他直徑的濾膜，沖洗量應進行相應的調整。供試品及其溶劑應不影響濾膜材質對 微生物的截留。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時，應保證濾膜在過濾前 后的完整性。水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品，其濾 膜和過濾器在使用前應充分干燥。為發(fā)揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及 沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾后，若需要用沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每 次沖洗量一般為100ml，總沖洗量不得超過1000ml，以避免薄膜上的微生物受損傷。取照上述“供試液的制備” “接種和稀釋”和“抗菌

13、活性的去除或滅活”制備的供試液適量（一般取相當于1g、1ml或10 cm2的供試品，若供試品中所含的菌數(shù)較多時，供試 液可酌情減量），加至適量的稀釋液中，混勻，過濾。用適量的沖洗液沖洗濾膜。若測定需氧菌總數(shù)，轉移濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上；若測定霉 菌和酵母總數(shù)，轉移濾膜菌面朝上貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上。按表1規(guī)定條件培養(yǎng)、計數(shù)。每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。同法測定供試品對照組及菌液對照 組菌數(shù)。6.263 MPN法MPN法的精密度和準確度不及薄膜過濾法和平皿法，僅在供試品需氧菌總 數(shù)沒有適宜計數(shù)方法的情況下使用，本法不適用霉菌計數(shù)。若使用MPN法，按下列步驟進

14、行。取照上述“供試液的制備” “接種和稀釋”和“抗菌活性的去除或滅活”制備的供試液至少3個連續(xù)稀級，每一稀釋級取3份1ml分別接種至3管裝有910ml胰酪大豆胨 液體培養(yǎng)基中，同法測定菌液對照組菌數(shù)。必要時可在培養(yǎng)基中加入表面活性劑、中和劑 或滅活劑。接種管置3035C培養(yǎng)3天，逐日觀察各管微生物生長情況。 如果由于供試品的原因 使得結果難以判斷，可將該管培養(yǎng)物轉種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng) 基，在相同條件下培養(yǎng)12天，觀察是否有微生物生長。根據微生物生長的管數(shù)從表2查被測供試品每1g或1ml中需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)。表2微生物最可能數(shù)檢索表生長管數(shù)需氧菌總數(shù)最可能數(shù)95%置信限

15、每管含樣品的g或ml數(shù)MPN/g 或 ml下限上限0.10.010.001000< 309.400130.19.501030.1100116.11.2170206.21.2170309.43.5351003.60.2171017.21.217102114351107.41.320111114351201143512115538130165382009.21.535201144352022053821015438211205382122799422021540221289942223599423029994231369943002359430138910430264161813104391

16、8131175171993121203036031316030380320931836032115030380322210304003232909099033024040990331460901980332110020040003331100注：表內所列檢驗量如改用1g（或ml）, 0.1g （或ml）和O.OIg （或ml）時，表內數(shù)字應相應降低10倍；如改用0.01g（或ml）、0.001 g（或ml）和0.0001 g （或ml ）時，表內數(shù)字應相應增加 10倍，其余類推。627結果判斷計數(shù)方法適用性試驗中，采用平皿法或薄膜過濾法時，試驗組菌落數(shù)減去 供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌

17、落數(shù)的比值在0.52范圍內；采用MPN法時，試驗組菌數(shù)應在菌液對照組菌數(shù)的 95 %置信限內。若各試驗菌的回收試驗均符合要求，照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進行該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)。方法適用性確認時，若采用上述方法還存在一株或多株試驗菌的回收達不到要求，那 么選擇回收最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢查。6.3控制菌檢驗方法驗證6.3.1驗證用菌株大腸埃希菌CMCC （ B） 44102金黃色葡萄球菌CMCC （B） 26003沙門菌CMCC（B） 50094銅綠假單胞菌CMCC （B） 10104白色念珠菌CMCC （ F） 980016.3.2菌液制備將金黃色

18、葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、沙門菌分別接種于胰酪大豆胨液體 培養(yǎng)基中或在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上，30°C35°C培養(yǎng)1824小時；將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上或沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20C25C培養(yǎng)23天，上述培養(yǎng)物用 pH7.0 無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液或 0.9無菌氯化鈉溶液制成適宜濃度的菌 懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在2C8C,可在24小時內使用。6.3.3 供試液的制備（同 6.2.3）6.3.4 驗證方法6.3.4.1 試驗組6.3.4.1.1 試驗菌根據各品種項下微生物限度標準中規(guī)定檢查的控制菌選擇相應試驗菌株， 確認耐膽鹽革蘭陰性菌檢查方法時，采用大腸埃希菌和銅綠假單胞菌為試驗菌。6.341.2常規(guī)法取規(guī)定量的供試液和不大于100cfu的試驗菌接入規(guī)定的培養(yǎng)基中，按微生物限度檢驗標準操作規(guī)程中控制菌的檢查法進行檢查。6.3.4.1.3培養(yǎng)基稀釋法 供試品有抑菌作用，放大培養(yǎng)基量，由于容器體積限制，一般不超 過 1000ml。6.3.4.1.4薄膜過濾法 采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，