實驗生化試驗pcr

1、 實驗實驗16 16 PCRPCR與酶切與酶切 一、實驗?zāi)康囊?、實驗?zāi)康恼莆照莆誔CRPCR技術(shù)原理與技術(shù)技術(shù)原理與技術(shù) 掌握限制性內(nèi)切酶技術(shù)。掌握限制性內(nèi)切酶技術(shù)。二、二、 實驗原理實驗原理3 Concepts3 Concepts of of the the PCRPCR1. 1.DenaturationDenaturation : 變性變性2. 2.RenaturationRenaturation：復(fù)性復(fù)性3. Semiconservative replicationSemiconservative replication：半保留復(fù)制半保留復(fù)制the double strand DNA o

2、pen to single stranded DNAtwo single stranded DNA form double strand DNAreplication, one make twoPCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解鏈酶DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解

3、旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解鏈合成引物子鏈延長GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明n1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便

4、可克隆tRNA基因。n但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了PCR技術(shù)簡史DNA的復(fù)制核酸體外擴增的設(shè)想聚合酶鏈反應(yīng)的發(fā)明n1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）n基本原理是在試管中模擬細胞內(nèi)的DNA復(fù)制n最初采用E-coli DNA聚合酶進行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯n耐熱DNA聚合酶的應(yīng)用使得PCR能高效率的進行，隨后PE-Cetus公司推出了第一臺PCR自動化熱循環(huán)儀n1993年，Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎 “I do my b

5、est I do my best thinking while driving”thinking while driving”1993 Nobel prize 引物引物引物引物引物引物XX()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40 20PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點標(biāo)準的標(biāo)準的PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系4種dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/L1234522557294時間（min）溫度（）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR

6、過程PCR的特點適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理nPCR反應(yīng)條件nPCR過程nPCR的特點1234522557294時間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95PCR的基本原理nPCR反應(yīng)條件nPCR過程nPCR的特點50引物1引物2DNA引物PCR的基本原理nPCR反應(yīng)條件nPCR過程nPCR的特點引物1引物2D

7、NA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理nPCR反應(yīng)條件nPCR過程nPCR的特點72第1輪結(jié)束95第2輪開始PCR的基本原理nPCR反應(yīng)條件nPCR過程nPCR的特點955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理nPCR反應(yīng)條件nPCR過程nPCR的特點72第2輪結(jié)束PCR的基本原理nPCR反應(yīng)條件nPCR過程nPCR的特點模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點n靈敏度高1.皮克(pg=10-12)量級擴增到微克(ug=10-6)水平2.能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞3.病毒檢測的靈敏度可達3個

8、RFU4.細菌檢測的最小檢出率為3個細菌n簡便、快速1.一次性加好反應(yīng)液，24 小時完成擴增2.擴增產(chǎn)物一般用電泳分析n對標(biāo)本的純度要求低u血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等組織的粗提DNA3 PCR的類型和應(yīng)用 研究基因克隆，DNA測序，分析突變 診斷細菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷 人類基因組工程遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測序，表達圖譜 法醫(yī)犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析 腫瘤各種腫瘤檢測 其他 已知靶基因片段兩測的序列 人類染色體端粒人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片的熒光原位雜交照片 逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAmRNAcDNAcDNA雜化雙鏈雜化雙鏈PCR擴增55A正常人A病 人病原微生物基因正常人

9、 (-)病 人 (+)A探針雜交NC膜探針 HLA系統(tǒng)基因分型 現(xiàn) 嫌1 嫌2 嫌3 實時熒光定量實時熒光定量PCR儀儀梯度梯度PCR儀儀普通普通PCR儀儀 無擴增產(chǎn)物 非特異性擴增 拖尾 假陽性 無擴增產(chǎn)物1.1. 模板模板: :含有抑制物，含量低含有抑制物，含量低2.2. BufferBuffer對樣品不合適對樣品不合適3.3. 引物設(shè)計不當(dāng)或者發(fā)生降引物設(shè)計不當(dāng)或者發(fā)生降解解4.4. 反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：退火溫度太高，延退火溫度太高，延伸時間太短伸時間太短 原原因因?qū)Σ卟?.1. 純化模板或者使用試劑盒提取純化模板或者使用試劑盒提取模板模板DNADNA或加大模板的用量或加大模板的用量2

10、.2. 更換更換BufferBuffer或調(diào)整濃度或調(diào)整濃度3.3. 重新設(shè)計引物（避免鏈間二聚重新設(shè)計引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物管新引物4.4. 降低退火溫度、延長延伸時間降低退火溫度、延長延伸時間現(xiàn)象：正對照有條帶，而樣品則無正對照有條帶，而樣品則無； 非特異性擴增 現(xiàn)象：現(xiàn)象：PCRPCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶?；蛐?，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。1.1.引物特異性差引物特異性差2.2.模板或引物濃度過高模板或引物濃度過高

11、3.3.酶量過多酶量過多4.4.MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高5.5.退火溫度偏低退火溫度偏低6.6.循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多 原原因因?qū)Σ卟?.1.重新設(shè)計引物或者使用巢重新設(shè)計引物或者使用巢式式PCRPCR2.2.適當(dāng)降低模板或引物濃度適當(dāng)降低模板或引物濃度3.3.適當(dāng)減少酶量適當(dāng)減少酶量4.4.降低鎂離子濃度降低鎂離子濃度5.5.適當(dāng)提高退火溫度或使用適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法二階段溫度法6.6.減少循環(huán)次數(shù)減少循環(huán)次數(shù) 非特異性擴增 拖尾 現(xiàn)象：現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài)狀態(tài)。 M 1 21.1.模板不純模板不純2.2.BufferBuffer不合適不

12、合適3.3.退火溫度偏低退火溫度偏低4.4.酶量過多酶量過多5.5.dNTPdNTP、MgMg2+2+濃度偏高濃度偏高6.6.循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多 原原因因?qū)Σ卟?.1.純化模板純化模板2.2.更換更換BufferBuffer3.3.適當(dāng)提高退火溫度適當(dāng)提高退火溫度4.4.適量用酶適量用酶5.5.適當(dāng)降低適當(dāng)降低dNTPdNTP和和鎂離子鎂離子的的濃度濃度6.6.減少循環(huán)次數(shù)減少循環(huán)次數(shù) 拖尾 假陽性（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達情況（篩選轉(zhuǎn)基因、檢測基因表達情況) ) 原因：靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染 現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物 對策：

13、1. 1.操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外；操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外；2.2.除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。3.3.各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。各種試劑最好先進行分裝，然后低溫貯存。 巢式巢式PCR（Nest-PCR） 遞減遞減PCR（TouchDown PCR） 熱啟動熱啟動PCR（HotStart PCR） 使用使用PCR增強劑增強劑巢式巢式PCR（Nest-PCR）P1P

14、2P3P4 巢式巢式PCR的使用降低了擴增多個靶位點的可能性，因為同多的使用降低了擴增多個靶位點的可能性，因為同多套引物都互補的靶序列很少。套引物都互補的靶序列很少。 巢式巢式PCR可以增加有限量靶序列可以增加有限量靶序列（如稀有如稀有mRNA）的靈敏度，的靈敏度，并且提高了困難并且提高了困難PCR（如如5 RACE）的特異性。）的特異性。 遞減遞減PCR（TouchDown PCR） 遞減遞減PCR通過在通過在PCR的前幾個循環(huán)使用嚴謹?shù)耐嘶饤l件提高的前幾個循環(huán)使用嚴謹?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的TmTm高大約高大約5的退火溫度下開始，的退火溫度下開始，然后

15、每個循環(huán)降低然后每個循環(huán)降低1 1-2 2, ,直到退火溫度低于直到退火溫度低于Tm Tm 5。 特異性最高的目的模板會被優(yōu)先擴增，這些產(chǎn)物在隨后的特異性最高的目的模板會被優(yōu)先擴增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴增占據(jù)優(yōu)勢。循環(huán)中繼續(xù)擴增占據(jù)優(yōu)勢。 遞減遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如法更為有用，如AFLP、DNA指紋分析等。指紋分析等。熱啟動熱啟動PCR （HotStart PCR） 熱啟動主要是通過抑制一種基本成分延遲熱啟動主要是通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，合成，直到直到PCR 儀達到變性溫度；儀達到變性溫度

16、； 現(xiàn)在有很多公司都有現(xiàn)在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，該酶具有熱酶出售，該酶具有熱啟動的性能，使用簡單方便，適合于高通量應(yīng)用啟動的性能，使用簡單方便，適合于高通量應(yīng)用； 熱啟動熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異特異性最重要的方法之一。性最重要的方法之一。使用使用PCR增強劑增強劑 甲酰胺，甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜堿等都可充當(dāng)，甘油，甜菜堿等都可充當(dāng)PCR的增強劑。的增強劑。 其可能的機理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔其可能的機理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助助DNA聚合酶延伸通過二級結(jié)構(gòu)區(qū)聚合酶延伸通過二級結(jié)構(gòu)

17、區(qū)。 增強劑濃度要適當(dāng)增強劑濃度要適當(dāng) Lambda DNA/EcoRI+HindIII MarkerLambda DNA/EcoRI+HindIII Marker實驗原理實驗原理n限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特序列之內(nèi)或其附近的特異位點上，并切割雙鏈異位點上，并切割雙鏈DNA。限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術(shù)刀”分布：分布：主要在原核生物中主要在原核生物中作用特點：作用特點： DNA重組技術(shù)的基本工具 限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI限限制酶制酶切點：切點：磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵 .切點：磷酸二磷酸二

18、酯鍵酯鍵3.結(jié)果： 黏性末端和平末端 命名是根據(jù)分離出此酶的微生物學(xué)名而定的。即取微生物屬名的第一個字母和種名的頭兩個字母組成三個斜體字母加以表示。 如：EcoRI中的E表示大腸桿菌屬名第一個字母，co表示種名頭兩個字母，R表示株名，I表示該菌中第一個被分離出的酶。命名和分類常用限制酶的種類及切割方式限制性內(nèi)切限制性內(nèi)切酶酶酶分子酶分子識別位點識別位點切割位點切割位點 限制作用是限制作用是否需用否需用 ATP類類 三 亞 基 雙三 亞 基 雙功能酶功能酶 二分非對稱二分非對稱至少在識別至少在識別位點外位點外 1000bpYes類類內(nèi)切酶與甲內(nèi)切酶與甲基化酶分子基化酶分子不在一起不在一起4-6b

19、p, 大多大多數(shù)為回文對數(shù)為回文對稱結(jié)構(gòu)稱結(jié)構(gòu) 在識別位點在識別位點中或靠近識中或靠近識別位點無特別位點無特異性異性No類類二亞基雙功二亞基雙功能酶能酶 5-7 bp 非對非對稱稱在識別位點在識別位點下 游下 游 2 4 -26bpYes限制性內(nèi)切酶可分為三類限制性內(nèi)切酶可分為三類類類限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 類酶切割位點在識別序列中類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切有的在對稱軸處切割割, 產(chǎn)生平末端的產(chǎn)生平末端的DNA片段片段(如如Sma: 5-CCCGGG-3)；有的切割位點在對稱軸一側(cè)有的切割位點在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的末端的DNA片段稱粘性末端片段稱

20、粘性末端，如如EcoR切割識別序列切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端。后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端。 5GAATTC3 5 G AATTC3 3CTTAAG 5 3 CTTAA G5 DNA連接酶“分子縫合針”DNA連接酶“分子縫合針”DNA 1g反應(yīng)反應(yīng) 10緩沖液緩沖液2L重蒸水重蒸水19L1L酶液酶液+用手指輕彈管壁使溶液混勻，使溶液集中在管底用手指輕彈管壁使溶液混勻，使溶液集中在管底混勻反應(yīng)體系后，混勻反應(yīng)體系后，37水浴保溫水浴保溫2-3h每管加入每管加入2L 0.1mol/L EDTA(pH8.0)，電泳檢測，電泳檢測EP管編號管編號, 加樣加樣實驗步驟實驗步驟對質(zhì)粒對質(zhì)粒DNA酶切

21、反應(yīng)酶切反應(yīng) 限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準體系限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準體系1g DNA加加1單位酶單位酶, 消化消化1-2h。但要完全酶解。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚倍，甚至更多，反應(yīng)時間也要適當(dāng)延長。至更多，反應(yīng)時間也要適當(dāng)延長。 電泳檢測示例電泳檢測示例實驗注意事項實驗注意事項1.限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準體系限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準體系1g DNA加加1單位酶，消化單位酶，消化1-2h。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，倍，甚至更多，反應(yīng)時間也要適當(dāng)延長。反應(yīng)時間也要適當(dāng)延長

22、。 2.酶切時所加的酶切時所加的DNA溶液體積不能太大，否則溶液體積不能太大，否則DNA溶液中其他成分溶液中其他成分會干擾酶反應(yīng)。會干擾酶反應(yīng)。 3.許多實驗制備的許多實驗制備的DNA不易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)不易于降解，需適當(dāng)增加酶的使用量。反應(yīng)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)液中加入過量的酶是不合適的，除考慮成本外，酶液中的微量雜質(zhì)可能干擾隨后的反應(yīng)?？赡芨蓴_隨后的反應(yīng)。 4.市場銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時可事先用酶反應(yīng)市場銷售的酶一般濃度很大，為節(jié)約起見，使用時可事先用酶反應(yīng)緩沖液（緩沖液（1）進行稀釋。另外，酶通常保存在）進行稀釋。另

23、外，酶通常保存在50%的甘油中，實的甘油中，實驗中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在驗中，應(yīng)將反應(yīng)液中甘油濃度控制在1/10之下，否則酶活性將受影之下，否則酶活性將受影響。響。 1基因表達載體的組成基因表達載體的組成DUCK179制作a、目的基因、目的基因 b、啟動子、啟動子c、終止子、終止子d、標(biāo)記基因、標(biāo)記基因抗生素抗性基因方法方法導(dǎo)入植物細胞導(dǎo)入植物細胞導(dǎo)入動物細胞導(dǎo)入動物細胞導(dǎo)入微生物細胞導(dǎo)入微生物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法 感受態(tài)細胞吸收感受態(tài)細胞吸收DNADNA分子分子重組子篩選方法n遺傳檢測法n物理檢測法n菌落原位雜交法n免

24、疫化學(xué)檢測法n測序n菌落PCRn遺傳檢測法 （1）抗藥性記號插入失活選擇法 n（2） -半乳糖苷酶顯色法篩選重組子 菌落原位雜交n提取質(zhì)粒酶切法需要提取質(zhì)粒,當(dāng)篩選的樣品較多時,操作比較繁瑣； 藍白斑篩選法需要載體有特殊結(jié)構(gòu); 雜交篩選法除操作比較復(fù)雜外,尚需使用同位素;插入失活法僅適用于個別載體。 n菌落PCR ：是直接以轉(zhuǎn)化菌的單個克隆為模板,通過特異性引物或通用引物對插入載體中的目的基因快速擴增，用于鑒定和篩選陽性轉(zhuǎn)化菌的技術(shù)。n與傳統(tǒng)的鑒定方法相比,由于其具有快速、經(jīng)濟、簡便的特點而被廣泛用于轉(zhuǎn)化菌、特別是大量轉(zhuǎn)化子的鑒定和篩選 。lacZ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶分解分解乳糖乳糖iPO調(diào)

25、控蛋白調(diào)控蛋白P大腸桿菌的大腸桿菌的-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ系統(tǒng)系統(tǒng)a-互補顯色反應(yīng)（藍白斑篩選）互補顯色反應(yīng)（藍白斑篩選）lacZ -半乳糖苷酶半乳糖苷酶-分解乳糖分解乳糖iPO調(diào)控蛋白調(diào)控蛋白P-肽段肽段分解分解X-gal產(chǎn)物呈現(xiàn)藍色產(chǎn)物呈現(xiàn)藍色誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)劑IPTG-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ突變體突變體M15TH 基因的基因的PCR擴增擴增 在在0.5ml Eppendorf管中加入：管中加入：ddH2O 15l10PCR Buffer 2.0ldNTP （10 mM） 1lprimer 1(10pmol/l) 0.5lprimer 2 (10pmol/l) 0.

26、5l模板DNA 0.5lTaq酶（5U/l） 0.5l Total 20l酪氨酸羥化酶 英文名稱：英文名稱：tyrosine hydroxylase;TH 編號：EC 1.14.16.2。催化兒茶酚胺生物合成的第一步(為限速步)，即將L-酪氨酸轉(zhuǎn)變成3，4-二羥-L-苯丙氨酸(L-DOPA)的羥化酶。在帕金森病中起重要作用。循環(huán)參數(shù)循環(huán)參數(shù)n1、預(yù)變性（Initial denaturation） 模板DNA完全變性對PCR能否成功至關(guān)重要，一般95加熱3-5分 鐘。 n2、引物退火（Primer annealing） 退火溫度一般需要憑實驗（經(jīng)驗）決定。 退火溫度對PCR的特異性 有較大影響。

27、 n3、引物延伸 引物延伸一般在72進行（Taq酶最適溫度）。延伸時間隨擴增片段長短及所使用Taq酶的擴增效率而定。 n4、循環(huán)中的變性步驟 循環(huán)中一般95，30秒足以使各種靶DNA序列完全變性：變性時間過長損害酶活性，過短靶序列變性不徹底，易造成擴增失敗。 n5、循環(huán)數(shù) 大多數(shù)PCR含25-35循環(huán)，過多易產(chǎn)生非特異擴增。 n6、最后延伸 在最后一個循環(huán)后，反應(yīng)在72維持5-15分鐘使引物延伸完全，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。 25個循環(huán)反應(yīng)程序為：94 4min94 30s66 45s72 1min20s 72 10min4 30min注意事項注意事項n1. PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA和核

28、酸酶污染的干凈環(huán)境中進行。n2. PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。n3. 分裝試劑：PCR擴增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA。n4. PCR試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的高壓滅菌新鮮雙蒸水；試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。n5. 操作過程中均應(yīng)戴手套，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面。n6. 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染。n7. 操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTPs、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管。這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度。n8. 操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性。Ec