四環(huán)素的發(fā)酵參數(shù)及生產(chǎn)工藝研究

1、 科研訓(xùn)練論文(文獻(xiàn)綜述)（題 目：四環(huán)素的發(fā)酵參數(shù)及生產(chǎn)工藝爭(zhēng)辯同學(xué)姓名：學(xué) 號(hào)：學(xué) 院：化工學(xué)院班 級(jí)：班2016 年 1月四環(huán)素的發(fā)酵參數(shù)及工藝爭(zhēng)辯 姓名： 指導(dǎo)老師：內(nèi)蒙古工業(yè)高?；W(xué)院，呼和浩特，010051 摘要：四環(huán)素(Tetracycline),是一種對(duì)抗立克次體、多種革蘭氏陽(yáng)性和革蘭氏陰性細(xì)菌等病原體的“廣譜”抗生素，另外，四環(huán)素也是一種重要的飼料添加剤，擁有寬敞的市場(chǎng)前。四環(huán)素的工業(yè)生產(chǎn)通常接受發(fā)酵法，該方法以金色鏈霉菌為發(fā)酵菌株，從而生產(chǎn)合成四環(huán)素。隨著工業(yè)的快速進(jìn)展傳統(tǒng)方法合成四環(huán)素已經(jīng)不足以滿足工業(yè)化生產(chǎn)，而本文通過(guò)把握發(fā)酵中的發(fā)酵參數(shù)，從而讓其發(fā)酵過(guò)程朝著產(chǎn)率高的

2、方向進(jìn)行。同時(shí)也供應(yīng)了向培育基中加溴化鈉水溶液和四環(huán)素通氨補(bǔ)料方法的發(fā)酵工藝。關(guān)鍵詞：四環(huán)素；金色鏈霉菌；發(fā)酵參數(shù)；發(fā)酵工藝引言 在發(fā)酵工藝過(guò)程中攪拌速度、通氣量、發(fā)酵液的粘度、溫度、發(fā)酵液pH、發(fā)酵罐的壓力、攪拌速度等因素，都會(huì)不同程度的影響四環(huán)素的產(chǎn)率，因此在生產(chǎn)工藝過(guò)程中對(duì)發(fā)酵參數(shù)的把握，將會(huì)朝著產(chǎn)率高的方向進(jìn)行。不同的發(fā)酵工藝方法也會(huì)有不同的產(chǎn)率，好的發(fā)酵方法不僅生產(chǎn)工藝途徑短，還能經(jīng)濟(jì)實(shí)惠。一、發(fā)酵參數(shù)利用發(fā)酵法生產(chǎn)合成四環(huán)素主要把握參數(shù)一般分為物理參數(shù)、化學(xué)參數(shù)、生物參數(shù)三類。（一）物理參數(shù)1、溫度：微生物發(fā)酵所用的菌體絕大多數(shù)是中溫菌，如霉菌、放線菌和一般細(xì)菌。它們的最適生長(zhǎng)溫度

3、一般在2040。在發(fā)酵過(guò)程中，需要維持適當(dāng)?shù)臏囟?，才能使菌體生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物的合成順當(dāng)進(jìn)行.如四環(huán)素生產(chǎn)菌在30時(shí)合成金霉素，35時(shí)，只產(chǎn)生四環(huán)素，合成方向會(huì)轉(zhuǎn)變,利用自動(dòng)把握或手動(dòng)調(diào)整的閥門，將冷卻水通入發(fā)酵罐的夾層或蛇行管中，通過(guò)熱交換來(lái)降溫，保持恒溫發(fā)酵1。2、壓力：發(fā)酵罐壓一般為 0.02-0.05Mpa2 3、攪拌轉(zhuǎn)速:隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，發(fā)酵液中菌株濃度不斷増大，發(fā)酵液粘度也隨之不斷上升，從而導(dǎo)致傳質(zhì)系數(shù)KLa下降，進(jìn)而導(dǎo)致溶氧量下降，而溶氧量的過(guò)度降低會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生不利影響。為避開上述情況，向發(fā)酵培育基中添加溴化鈉水溶液，協(xié)作肯定的攪拌速度，能夠削減由于菌株濃度增大產(chǎn)生的泡

4、沫和滯留液膜，降低發(fā)酵培育基的粘度，從而提高其流變特性、KLa和溶氧水平，進(jìn)而有利于菌株的發(fā)酵。攪拌轉(zhuǎn)速200-900r/Min為宜3。4、通氣量：加大通氣流量不僅會(huì)増加發(fā)酵液的蒸發(fā)損失，還會(huì)帶走一些揮發(fā)性的代謝中產(chǎn)物，從而導(dǎo)致能耗增加、產(chǎn)率降低。適宜的通氣量尤為重要，本創(chuàng)造的工藝參數(shù)通氣比為1:0.525。5、濁度：反映單細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的參數(shù)。如大腸桿菌，用光密度650nm上檢測(cè)或計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。6、料液流量（L/min）:這是把握流體進(jìn)料的參數(shù)。（二）化學(xué)參數(shù)1、PH ：四環(huán)素為兩性化合物，等電點(diǎn)為PH5.4,此時(shí)以游離形式存在，PH4-7.2范圍內(nèi)難溶于水，低于pH4的酸或高于PH8的堿性溶液

5、中，溶解度很高。首先考慮和試驗(yàn)發(fā)酵培育基的基礎(chǔ)配方，使它們有個(gè)適當(dāng)?shù)呐浔?，使發(fā)酵過(guò)程中的pH值變化在合適的范圍內(nèi),而四環(huán)素合成適宜PH為5.8-6.02。2、溶解氧濃度 隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，發(fā)酵液中菌株濃度不斷増大，導(dǎo)致溶氧量下降，而溶氧量的過(guò)度降低會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生不利影響，而向發(fā)酵液加入溴化鈉水溶液，提高培育基的流變特性和溶氧水平10。3、溶解CO2濃度 四環(huán)素生物合成的適宜CO2濃度為2%-8%，濃度超過(guò)15%將抑制菌體生長(zhǎng)2。（三）生物參數(shù)1、菌絲形態(tài)：觀看菌絲形態(tài)是生產(chǎn)中最常用的方法。每隔8小時(shí)鏡檢，能準(zhǔn)時(shí)發(fā)覺特別染菌。四環(huán)素生產(chǎn)，生產(chǎn)菌生長(zhǎng)分為I.孢子發(fā)芽，II.次生菌絲增殖，

6、III.產(chǎn)物分泌，消滅空胞，IV.菌絲自溶，菌絲形態(tài)模糊4。2、菌體濃度：對(duì)初級(jí)產(chǎn)品來(lái)說(shuō)，菌濃愈大，產(chǎn)量愈高，但菌濃符合生長(zhǎng)曲線。次級(jí)產(chǎn)品如菌濃過(guò)大，由于代謝產(chǎn)物的積累，會(huì)影響產(chǎn)量。因其產(chǎn)品與原料并非對(duì)應(yīng)（或底物抑制，分介產(chǎn)物抑制等）7。2、 四環(huán)素的發(fā)酵工藝爭(zhēng)辯 四環(huán)素的工業(yè)生產(chǎn)通常接受發(fā)酵法，該方法以金色鏈霉菌為發(fā)酵菌株。發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵液的溶氧量對(duì)金色鏈霉菌菌株的生長(zhǎng)代謝有很大的影響。而該溶氧量與發(fā)酵液的傳質(zhì)系數(shù)(KLa)成正比9。影響KLa的主要因素包括攪拌速度、通氣量、發(fā)酵液的粘度、發(fā)酵液的表面張力、發(fā)酵液的離子強(qiáng)度等。隨著發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)行，發(fā)酵液中菌株濃度不斷増大，發(fā)酵液粘度也隨之不

7、斷上升，從而導(dǎo)致KLa下降，進(jìn)而導(dǎo)致溶氧量下降，而溶氧量的過(guò)度降低會(huì)對(duì)菌株的生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生不利影響5。目前大多接受以下方法提高發(fā)酵液的KLa ；1)加大攪拌速度；2)加大通氣流量；3)添加水分。上述方法雖然在肯定程度上緩解了KLa的下降趨勢(shì)，然而這些方法存在諸多不盡如人意的地方，例如加大攪拌速度會(huì)對(duì)菌株造成不同程度的損傷，這是由于金色鏈霉菌對(duì)剪切力格外敏感；而加大通氣流量不僅會(huì)増加發(fā)酵液的蒸發(fā)損失，還會(huì)帶走一些揮發(fā)性的代謝中產(chǎn)物，從而導(dǎo)致能耗增加、產(chǎn)率降低；添加水分雖然能降低發(fā)酵液的粘度，但會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液的滲透壓快速降低，從而干擾菌株正常的生長(zhǎng)代謝。（一）向發(fā)酵培育基加入溴化鈉水溶液法 在發(fā)酵過(guò)程

8、中，向發(fā)酵培育基中添加溴化鈉水溶液。接受這一方法，通過(guò)向發(fā)酵培育基中添加溴化鈉水溶液，一方面，能夠削減由于菌株濃度增大產(chǎn)生的泡沫和滯留液膜，降低發(fā)酵培育基的粘度，從而提高其流變特性、KLa和溶氧水平，進(jìn)而有利于菌株的發(fā)酵；另一方面，添加溴化鈉水溶液，還能增加發(fā)酵培育基中的電解質(zhì)濃度，進(jìn)步降低泡沫的產(chǎn)生，同時(shí)能夠使發(fā)酵培育基維持適宜菌株生長(zhǎng)的滲透壓。1、生產(chǎn)菌種 本課題接受四環(huán)素生產(chǎn)菌，即金色鏈霉菌，通過(guò)在培育基加入抑氯劑和氯的競(jìng)爭(zhēng)劑時(shí)，能合成高產(chǎn)量的四環(huán)素。其在固體培育基上分泌金黃色色素，氣生菌絲無(wú)色素。孢子在氣生菌絲上排列成鏈狀、圓形或橢圓形。初期是白色，后期變灰黑色，發(fā)酵中用亞甲藍(lán)染色，看

9、菌絲狀態(tài)6。變化特征為第一期：原生菌絲期，孢子發(fā)酵，成菌絲團(tuán)其次期：次生菌絲期，菌絲團(tuán)散開，生成大量次生菌絲第三期：產(chǎn)物分泌期，菌絲變短，消滅空胞第四期：菌絲自溶期，菌絲模糊，自溶降解2。2、 斜面培育 取金色鏈霉菌（Aareys)菌株在無(wú)菌條件下接種于預(yù)先制備好的固體斜面培育基上，在35°C下恒溫培育5天15。上述固體斜面培育基是依據(jù)常規(guī)方法制備的，其配方為3.2G/L麩皮，2.5G/L瓊月旨，0.16G/L磷酸銨，0.1G/L磷酸氫鉀，0.05G/L硫酸鎂3。3、種子制備 種子培育將斜面培育后的菌株在無(wú)菌條件下接種到預(yù)先制備好的種子培育基中，在33°C、300 R/Mi

10、n的條件下培育22-25H，得到種子液14。上述種子培育基是依據(jù)常規(guī)方法制備的，其配方為3.4 G/L葡萄糖，2.9 G/L黃豆餅粉，0.6 G/L玉米漿，0.5G/L硫酸銨，0.01G/L磷酸氫鉀，0.02 G/L硫酸鎂，0.15 G/L溴化鈉，0.4G/L碳酸鈣，0.6G/L酵母粉13。4、發(fā)酵培育 發(fā)酵培育將種子制備步驟所得種液在無(wú)菌條件下接種到預(yù)先制備好的發(fā)酵培育基中，在30°C，攪拌轉(zhuǎn)速200r/Min的條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程的通氣比為1:0.5212。發(fā)酵開頭后60h，向發(fā)酵培育基中添加溴化鈉水溶液。所述溴化鈉水溶液,其體積為發(fā)酵培育基體積的2%，其中溴化鈉的濃度為0.

11、 005g/L和加入微量硫氫化芐（0.0001%-0.0002%）。發(fā)酵開頭后180h，停止發(fā)酵，測(cè)定所得發(fā)酵液中四環(huán)素的效價(jià)，結(jié)果為30000U/mL。上述發(fā)酵培育基是依據(jù)常規(guī)方法制備的，其配方為8 G/L淀粉，2.5G/L黃豆餅粉，2g/L玉米漿，5G/L硫酸銨，0.015 G/L磷酸氫鉀，0.008G/L硫酸錳，0.15G/L溴化鈉，0.002G/L M-促進(jìn)劑，0.6 G/L碳酸鈣，0.008 G/L淀粉酶3。得出的結(jié)論是比傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的效價(jià)高。5、此方法的進(jìn)展前景 簡(jiǎn)便易行的方式增大發(fā)酵培育基的KLa值，效果良好。試驗(yàn)表明，接受所述方法，四環(huán)素的產(chǎn)率提高16%以上3。通過(guò)與傳統(tǒng)方法相

12、比，過(guò)程與方法相差無(wú)幾，但是大大提高了四環(huán)素的產(chǎn)率，進(jìn)展前景寬敞。（二）四環(huán)素通氨補(bǔ)料法四環(huán)素通氨補(bǔ)料是四環(huán)素發(fā)酵工藝的一種新方法。四環(huán)素發(fā)酵原工藝的缺點(diǎn)是點(diǎn)是發(fā)酵單位低。通氨補(bǔ)料是用通氨的方法制造菌種生長(zhǎng)適應(yīng)的 p H 值,強(qiáng)化菌種代謝，補(bǔ)充養(yǎng)分,以達(dá)到提高發(fā)酵單位的的。東北制藥總廠 、沈陽(yáng)市其次制藥廠都接受了通氨補(bǔ)料工藝,取得了顯著效果。四環(huán)素產(chǎn)品的發(fā)酵單位、收率、全耗、主耗等各項(xiàng)技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo),都刷新了歷史最好水平。東北制藥總廠在學(xué)習(xí)華北藥廠先進(jìn)經(jīng) 驗(yàn)的基礎(chǔ)上,結(jié)合該廠在原料、設(shè)備、空氣動(dòng)力等方面的實(shí)際條件， 選 擇了通氨補(bǔ)料菌種、培育基配方和工藝把握條件,經(jīng)半年多的生產(chǎn)試 驗(yàn)證明,它有如

13、下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):1、平均發(fā)酵單位由18208)/ml提高到215497/ml;2、總收率提高18.6%;3、罐批產(chǎn)量提高94公斤;4、主要原材料總耗下降6.6公斤/十億 ;5、年節(jié)省化工原料250噸,年節(jié)省價(jià)值26萬(wàn)元8。結(jié)論 通過(guò)對(duì)本課題的爭(zhēng)辯探討以及對(duì)相關(guān)文件的查找與整理，在發(fā)酵法合成四環(huán)素的工藝過(guò)程中，向發(fā)酵培育液加入溴化鈉水溶液，一方面，能夠削減由于菌株濃度增大產(chǎn)生的泡沫和滯留液膜，降低發(fā)酵培育基的粘度，從而提高其流變特性、KLa和溶氧水平，進(jìn)而有利于菌株的發(fā)酵；另一方面，添加溴化鈉水溶液，還能增加發(fā)酵培育基中的電解質(zhì)濃度，進(jìn)步降低泡沫的產(chǎn)生，同時(shí)能夠使發(fā)酵培育基維持適宜菌株生長(zhǎng)的滲透壓。

14、而培育基一和傳統(tǒng)工藝四環(huán)素效價(jià)對(duì)比中，能得出，此方法能夠增大發(fā)酵培育基的KLa值，效果明顯提高了四環(huán)素的產(chǎn)率。 四環(huán)素通氨補(bǔ)料法，從上所述，經(jīng)濟(jì)方面經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，原材料的利用率得到提高。效益方面，產(chǎn)率提高，效率提升。參考文獻(xiàn)1邢杰, 湯長(zhǎng)林.錐形發(fā)酵罐(C.C.T)發(fā)酵溫度把握與發(fā)酵質(zhì)量的幾點(diǎn)生疏.生物科技.2005，12：2-5.2 元英進(jìn).制藥工藝學(xué).北京.化學(xué)工業(yè)出版社.20073張寶榮, 吳飛, 魏偉.一種發(fā)酵生產(chǎn)四環(huán)素的方法.生物技術(shù).2012,14,33-344王清海.鏈霉菌R15作用機(jī)制及-葡萄糖苷酶的純化與特性爭(zhēng)辯.山東高校.20065B.V.R.Bornot.al.Handboo

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