四環(huán)素的發(fā)酵參數(shù)及生產(chǎn)工藝研究

1、 科研訓練論文(文獻綜述)（題 目：四環(huán)素的發(fā)酵參數(shù)及生產(chǎn)工藝爭辯同學姓名：學 號：學 院：化工學院班 級：班2016 年 1月四環(huán)素的發(fā)酵參數(shù)及工藝爭辯 姓名： 指導老師：內蒙古工業(yè)高?；W院，呼和浩特，010051 摘要：四環(huán)素(Tetracycline),是一種對抗立克次體、多種革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌等病原體的“廣譜”抗生素，另外，四環(huán)素也是一種重要的飼料添加剤，擁有寬敞的市場前。四環(huán)素的工業(yè)生產(chǎn)通常接受發(fā)酵法，該方法以金色鏈霉菌為發(fā)酵菌株，從而生產(chǎn)合成四環(huán)素。隨著工業(yè)的快速進展傳統(tǒng)方法合成四環(huán)素已經(jīng)不足以滿足工業(yè)化生產(chǎn)，而本文通過把握發(fā)酵中的發(fā)酵參數(shù)，從而讓其發(fā)酵過程朝著產(chǎn)率高的

2、方向進行。同時也供應了向培育基中加溴化鈉水溶液和四環(huán)素通氨補料方法的發(fā)酵工藝。關鍵詞：四環(huán)素；金色鏈霉菌；發(fā)酵參數(shù)；發(fā)酵工藝引言 在發(fā)酵工藝過程中攪拌速度、通氣量、發(fā)酵液的粘度、溫度、發(fā)酵液pH、發(fā)酵罐的壓力、攪拌速度等因素，都會不同程度的影響四環(huán)素的產(chǎn)率，因此在生產(chǎn)工藝過程中對發(fā)酵參數(shù)的把握，將會朝著產(chǎn)率高的方向進行。不同的發(fā)酵工藝方法也會有不同的產(chǎn)率，好的發(fā)酵方法不僅生產(chǎn)工藝途徑短，還能經(jīng)濟實惠。一、發(fā)酵參數(shù)利用發(fā)酵法生產(chǎn)合成四環(huán)素主要把握參數(shù)一般分為物理參數(shù)、化學參數(shù)、生物參數(shù)三類。（一）物理參數(shù)1、溫度：微生物發(fā)酵所用的菌體絕大多數(shù)是中溫菌，如霉菌、放線菌和一般細菌。它們的最適生長溫度

3、一般在2040。在發(fā)酵過程中，需要維持適當?shù)臏囟?，才能使菌體生長和代謝產(chǎn)物的合成順當進行.如四環(huán)素生產(chǎn)菌在30時合成金霉素，35時，只產(chǎn)生四環(huán)素，合成方向會轉變,利用自動把握或手動調整的閥門，將冷卻水通入發(fā)酵罐的夾層或蛇行管中，通過熱交換來降溫，保持恒溫發(fā)酵1。2、壓力：發(fā)酵罐壓一般為 0.02-0.05Mpa2 3、攪拌轉速:隨著發(fā)酵過程的進行，發(fā)酵液中菌株濃度不斷増大，發(fā)酵液粘度也隨之不斷上升，從而導致傳質系數(shù)KLa下降，進而導致溶氧量下降，而溶氧量的過度降低會對菌株的生長代謝產(chǎn)生不利影響。為避開上述情況，向發(fā)酵培育基中添加溴化鈉水溶液，協(xié)作肯定的攪拌速度，能夠削減由于菌株濃度增大產(chǎn)生的泡

4、沫和滯留液膜，降低發(fā)酵培育基的粘度，從而提高其流變特性、KLa和溶氧水平，進而有利于菌株的發(fā)酵。攪拌轉速200-900r/Min為宜3。4、通氣量：加大通氣流量不僅會増加發(fā)酵液的蒸發(fā)損失，還會帶走一些揮發(fā)性的代謝中產(chǎn)物，從而導致能耗增加、產(chǎn)率降低。適宜的通氣量尤為重要，本創(chuàng)造的工藝參數(shù)通氣比為1:0.525。5、濁度：反映單細胞生長狀況的參數(shù)。如大腸桿菌，用光密度650nm上檢測或計數(shù)板計數(shù)。6、料液流量（L/min）:這是把握流體進料的參數(shù)。（二）化學參數(shù)1、PH ：四環(huán)素為兩性化合物，等電點為PH5.4,此時以游離形式存在，PH4-7.2范圍內難溶于水，低于pH4的酸或高于PH8的堿性溶液

5、中，溶解度很高。首先考慮和試驗發(fā)酵培育基的基礎配方，使它們有個適當?shù)呐浔龋拱l(fā)酵過程中的pH值變化在合適的范圍內,而四環(huán)素合成適宜PH為5.8-6.02。2、溶解氧濃度 隨著發(fā)酵過程的進行，發(fā)酵液中菌株濃度不斷増大，導致溶氧量下降，而溶氧量的過度降低會對菌株的生長代謝產(chǎn)生不利影響，而向發(fā)酵液加入溴化鈉水溶液，提高培育基的流變特性和溶氧水平10。3、溶解CO2濃度 四環(huán)素生物合成的適宜CO2濃度為2%-8%，濃度超過15%將抑制菌體生長2。（三）生物參數(shù)1、菌絲形態(tài)：觀看菌絲形態(tài)是生產(chǎn)中最常用的方法。每隔8小時鏡檢，能準時發(fā)覺特別染菌。四環(huán)素生產(chǎn)，生產(chǎn)菌生長分為I.孢子發(fā)芽，II.次生菌絲增殖，

6、III.產(chǎn)物分泌，消滅空胞，IV.菌絲自溶，菌絲形態(tài)模糊4。2、菌體濃度：對初級產(chǎn)品來說，菌濃愈大，產(chǎn)量愈高，但菌濃符合生長曲線。次級產(chǎn)品如菌濃過大，由于代謝產(chǎn)物的積累，會影響產(chǎn)量。因其產(chǎn)品與原料并非對應（或底物抑制，分介產(chǎn)物抑制等）7。2、 四環(huán)素的發(fā)酵工藝爭辯 四環(huán)素的工業(yè)生產(chǎn)通常接受發(fā)酵法，該方法以金色鏈霉菌為發(fā)酵菌株。發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的溶氧量對金色鏈霉菌菌株的生長代謝有很大的影響。而該溶氧量與發(fā)酵液的傳質系數(shù)(KLa)成正比9。影響KLa的主要因素包括攪拌速度、通氣量、發(fā)酵液的粘度、發(fā)酵液的表面張力、發(fā)酵液的離子強度等。隨著發(fā)酵過程的進行，發(fā)酵液中菌株濃度不斷増大，發(fā)酵液粘度也隨之不

7、斷上升，從而導致KLa下降，進而導致溶氧量下降，而溶氧量的過度降低會對菌株的生長代謝產(chǎn)生不利影響5。目前大多接受以下方法提高發(fā)酵液的KLa ；1)加大攪拌速度；2)加大通氣流量；3)添加水分。上述方法雖然在肯定程度上緩解了KLa的下降趨勢，然而這些方法存在諸多不盡如人意的地方，例如加大攪拌速度會對菌株造成不同程度的損傷，這是由于金色鏈霉菌對剪切力格外敏感；而加大通氣流量不僅會増加發(fā)酵液的蒸發(fā)損失，還會帶走一些揮發(fā)性的代謝中產(chǎn)物，從而導致能耗增加、產(chǎn)率降低；添加水分雖然能降低發(fā)酵液的粘度，但會導致發(fā)酵液的滲透壓快速降低，從而干擾菌株正常的生長代謝。（一）向發(fā)酵培育基加入溴化鈉水溶液法 在發(fā)酵過程

8、中，向發(fā)酵培育基中添加溴化鈉水溶液。接受這一方法，通過向發(fā)酵培育基中添加溴化鈉水溶液，一方面，能夠削減由于菌株濃度增大產(chǎn)生的泡沫和滯留液膜，降低發(fā)酵培育基的粘度，從而提高其流變特性、KLa和溶氧水平，進而有利于菌株的發(fā)酵；另一方面，添加溴化鈉水溶液，還能增加發(fā)酵培育基中的電解質濃度，進步降低泡沫的產(chǎn)生，同時能夠使發(fā)酵培育基維持適宜菌株生長的滲透壓。1、生產(chǎn)菌種 本課題接受四環(huán)素生產(chǎn)菌，即金色鏈霉菌，通過在培育基加入抑氯劑和氯的競爭劑時，能合成高產(chǎn)量的四環(huán)素。其在固體培育基上分泌金黃色色素，氣生菌絲無色素。孢子在氣生菌絲上排列成鏈狀、圓形或橢圓形。初期是白色，后期變灰黑色，發(fā)酵中用亞甲藍染色，看

9、菌絲狀態(tài)6。變化特征為第一期：原生菌絲期，孢子發(fā)酵，成菌絲團其次期：次生菌絲期，菌絲團散開，生成大量次生菌絲第三期：產(chǎn)物分泌期，菌絲變短，消滅空胞第四期：菌絲自溶期，菌絲模糊，自溶降解2。2、 斜面培育 取金色鏈霉菌（Aareys)菌株在無菌條件下接種于預先制備好的固體斜面培育基上，在35°C下恒溫培育5天15。上述固體斜面培育基是依據(jù)常規(guī)方法制備的，其配方為3.2G/L麩皮，2.5G/L瓊月旨，0.16G/L磷酸銨，0.1G/L磷酸氫鉀，0.05G/L硫酸鎂3。3、種子制備 種子培育將斜面培育后的菌株在無菌條件下接種到預先制備好的種子培育基中，在33°C、300 R/Mi

10、n的條件下培育22-25H，得到種子液14。上述種子培育基是依據(jù)常規(guī)方法制備的，其配方為3.4 G/L葡萄糖，2.9 G/L黃豆餅粉，0.6 G/L玉米漿，0.5G/L硫酸銨，0.01G/L磷酸氫鉀，0.02 G/L硫酸鎂，0.15 G/L溴化鈉，0.4G/L碳酸鈣，0.6G/L酵母粉13。4、發(fā)酵培育 發(fā)酵培育將種子制備步驟所得種液在無菌條件下接種到預先制備好的發(fā)酵培育基中，在30°C，攪拌轉速200r/Min的條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵過程的通氣比為1:0.5212。發(fā)酵開頭后60h，向發(fā)酵培育基中添加溴化鈉水溶液。所述溴化鈉水溶液,其體積為發(fā)酵培育基體積的2%，其中溴化鈉的濃度為0.

11、 005g/L和加入微量硫氫化芐（0.0001%-0.0002%）。發(fā)酵開頭后180h，停止發(fā)酵，測定所得發(fā)酵液中四環(huán)素的效價，結果為30000U/mL。上述發(fā)酵培育基是依據(jù)常規(guī)方法制備的，其配方為8 G/L淀粉，2.5G/L黃豆餅粉，2g/L玉米漿，5G/L硫酸銨，0.015 G/L磷酸氫鉀，0.008G/L硫酸錳，0.15G/L溴化鈉，0.002G/L M-促進劑，0.6 G/L碳酸鈣，0.008 G/L淀粉酶3。得出的結論是比傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的效價高。5、此方法的進展前景 簡便易行的方式增大發(fā)酵培育基的KLa值，效果良好。試驗表明，接受所述方法，四環(huán)素的產(chǎn)率提高16%以上3。通過與傳統(tǒng)方法相

12、比，過程與方法相差無幾，但是大大提高了四環(huán)素的產(chǎn)率，進展前景寬敞。（二）四環(huán)素通氨補料法四環(huán)素通氨補料是四環(huán)素發(fā)酵工藝的一種新方法。四環(huán)素發(fā)酵原工藝的缺點是點是發(fā)酵單位低。通氨補料是用通氨的方法制造菌種生長適應的 p H 值,強化菌種代謝，補充養(yǎng)分,以達到提高發(fā)酵單位的的。東北制藥總廠 、沈陽市其次制藥廠都接受了通氨補料工藝,取得了顯著效果。四環(huán)素產(chǎn)品的發(fā)酵單位、收率、全耗、主耗等各項技術經(jīng)濟指標,都刷新了歷史最好水平。東北制藥總廠在學習華北藥廠先進經(jīng) 驗的基礎上,結合該廠在原料、設備、空氣動力等方面的實際條件， 選 擇了通氨補料菌種、培育基配方和工藝把握條件,經(jīng)半年多的生產(chǎn)試 驗證明,它有如

13、下幾個優(yōu)點:1、平均發(fā)酵單位由18208)/ml提高到215497/ml;2、總收率提高18.6%;3、罐批產(chǎn)量提高94公斤;4、主要原材料總耗下降6.6公斤/十億 ;5、年節(jié)省化工原料250噸,年節(jié)省價值26萬元8。結論 通過對本課題的爭辯探討以及對相關文件的查找與整理，在發(fā)酵法合成四環(huán)素的工藝過程中，向發(fā)酵培育液加入溴化鈉水溶液，一方面，能夠削減由于菌株濃度增大產(chǎn)生的泡沫和滯留液膜，降低發(fā)酵培育基的粘度，從而提高其流變特性、KLa和溶氧水平，進而有利于菌株的發(fā)酵；另一方面，添加溴化鈉水溶液，還能增加發(fā)酵培育基中的電解質濃度，進步降低泡沫的產(chǎn)生，同時能夠使發(fā)酵培育基維持適宜菌株生長的滲透壓。

14、而培育基一和傳統(tǒng)工藝四環(huán)素效價對比中，能得出，此方法能夠增大發(fā)酵培育基的KLa值，效果明顯提高了四環(huán)素的產(chǎn)率。 四環(huán)素通氨補料法，從上所述，經(jīng)濟方面經(jīng)濟實惠，原材料的利用率得到提高。效益方面，產(chǎn)率提高，效率提升。參考文獻1邢杰, 湯長林.錐形發(fā)酵罐(C.C.T)發(fā)酵溫度把握與發(fā)酵質量的幾點生疏.生物科技.2005，12：2-5.2 元英進.制藥工藝學.北京.化學工業(yè)出版社.20073張寶榮, 吳飛, 魏偉.一種發(fā)酵生產(chǎn)四環(huán)素的方法.生物技術.2012,14,33-344王清海.鏈霉菌R15作用機制及-葡萄糖苷酶的純化與特性爭辯.山東高校.20065B.V.R.Bornot.al.Handboo

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