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1、活血健腦膠囊對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用核心提示:【摘要】【目的】研究活血健腦膠囊對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用?!痉椒ā窟x用SD大鼠, 【摘要】 【目的】研究活血健腦膠囊對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用?!痉椒ā窟x用SD大鼠,隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組(劑量為10.8mgkg-1d-1)、活血健腦膠囊組(劑量為1.8gkg-1d-1),后3組再分為缺血2h及再灌注6、12、24h組;采用線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血再灌注模型,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞色素C(Cyt C),原位雜交法檢測(cè)Caspase3mRNA、Caspase9mRNA的
2、表達(dá)?!窘Y(jié)果】活血健腦膠囊組腦缺血/再灌注6 h 細(xì)胞色素C陽(yáng)性弱表達(dá),與模型組比較有顯著性差異(P0.01),腦缺血/再灌注12h、24h 細(xì)胞色素C的陽(yáng)性表達(dá)與模型組及假手術(shù)組比較無(wú)顯著性差異(P0.05)。模型組腦缺血再灌注24h海馬Caspase3 mRNA、Caspase9mRNA的表達(dá)達(dá)高峰(P0.01);活血健腦膠囊組腦缺血/再灌注24hCaspase3 mRNA、Caspase9mRNA表達(dá)均減弱, 與模型組比較有顯著性差異(P0.01)?!窘Y(jié)論】活血健腦膠囊對(duì)局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用可能與其能影響神經(jīng)細(xì)胞Cyt C的釋放,降低腦缺血/再灌注后腦組織Caspase
3、3、Caspase9的活性,從而阻斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 活血健腦膠囊/藥理學(xué); 腦缺血/中藥療法; 腦組織/病理學(xué); 細(xì)胞凋亡; 疾病模型,動(dòng)物; 大鼠 1 材料與方法 1.1 動(dòng)物與藥物 SD大鼠78只,體質(zhì)量300350g,鼠齡56月齡,雌雄各半,由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào): 0001475)?;钛∧X膠囊由上海復(fù)星臨西制藥有限公司提供(批號(hào):200400306);尼達(dá)爾片(尼莫地平),20mg/片,由天津市中央藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(批號(hào):020602);9g/L的氯化鈉注射液由北京雙鶴藥業(yè)有限公司提供(批號(hào):030312312)。 1.2 試劑與儀器 PM10AD光學(xué)顯
4、微鏡 (Olympus optical Co.Ltd,JAPAN); HITACHI 7500型透射電子顯微鏡(JAPAN);LEICARM2145型自動(dòng)切片機(jī)(德國(guó));phorbol estersil ( at final concentration of 0.20 mol/L) + ionomycin (at final concentration of 1 mg/L) for another 48 hours. After marked by monoclonal antibody of CD3 and CD71, the expression of CD3+CD71+ lymphocy
5、tes was observed by flow cytometry. Results SINO inhibited the lymphocytes proliferation in a concentrationdependant manner, and particularly had an inhibition on Jurkats cells at G0/G1 phase; MTX had an inhibition on S phase. The stimulation of ConA and phorbol estersil+ionomycin obviously increase
6、d the expression of CD3+CD71+ lymphocytes (P0.01); SINO at the concentrations of 1 and 0.5 mmol/L inhibited the expression of CD3+CD71+ lymphocytes after ConA stimulation, and SINO at the concentration of 1 mmol/L inhibited the expression of CD3+CD71+ lymphocytes after stimulation of phorbol estersi
7、l+ ionomycin (P0.05). Conclusion SINO can inhibit the activation and proliferation of T lymphocytes, and block the cells at G0/G1 phase. Its mechanism may be related with the downregulation of transferring receptor of T lymphocytes and with the decrease of intake of iron ion by the cells. Key words:
8、SINOMENINE/pharmacology; ARTHRITIS,RHEUMATOID/TCD therapy; TLYMPHOCYTES; CELL CULTUREHPIAS1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司);Cyt C 、Caspase3mRNA、Caspase9mRNApon812Lysine液中浸5min,撈片后置5860烤箱中 45min以使切片緊密粘附,干燥備用;切片常規(guī)脫蠟至水;蒸餾水新鮮配置體積分?jǐn)?shù)為3%H2O2室溫處理10min,蒸餾水洗滌2min3次;切片浸入0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)微波修復(fù)10min,反復(fù)2次,自
9、然冷卻后以0.1mol/LPBS洗滌2次;滴加正常山羊血清封閉液,室溫20min;甩去多余液體,不洗;滴加50L抗Cyt C,4冰箱過(guò)夜,0.1mol/LPBS洗滌2min3次;加入濃度為10g/L的胎牛血清-緩沖液(BSAPBS3 mRNA、Caspase9 mRNA的表達(dá) 以40g/L多聚甲醛固定腦組織,石蠟包埋,常規(guī)切片(6m厚),脫蠟,水化,以體積分?jǐn)?shù)為30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合,室溫510min以滅活內(nèi)源性酶;蒸餾水洗3次。暴露mRNA核酸片段:切片上滴加檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶(30g/L檸檬酸lmL加2滴濃縮型胃蛋白酶,混勻),室溫消化15min;42預(yù)雜交2h,雜交
10、液中含探針2g /mL,42 雜交過(guò)夜,加入抗地高辛抗體(1800),37孵育1h,DAB顯色37、30min左右,典型切片加上不含探針的雜交液做陰性對(duì)照。參考Kitazawa等5報(bào)道的方法計(jì)算Caspase3表達(dá)程度:計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野,將平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為5類(lèi),(1)0:陽(yáng)性細(xì)胞少于1,(2)1:陽(yáng)性細(xì)胞介于125;(3)2:陽(yáng)性細(xì)胞介于2550;(4)3:陽(yáng)性細(xì)胞介于5075;(5)4:陽(yáng)性細(xì)胞大于75。根據(jù)染色程度將陽(yáng)性信號(hào)分為3類(lèi):(1)染色強(qiáng)度弱:+;(2)中等染色強(qiáng)度:+;(3)染色強(qiáng)度強(qiáng):+。染色強(qiáng)度陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為每個(gè)標(biāo)本染色的綜合記分。綜合記分1為表達(dá)陰性,否則,則判為陽(yáng)性。
11、Caspase9的測(cè)定同Caspase3稍作改動(dòng)。 1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.0 For Windows軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 2 結(jié)果 2.1 病理形態(tài) 假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)正常,無(wú)明顯水腫;模型組HE染色缺血損傷累及廣泛皮層及紋狀體外側(cè),缺血中心區(qū)與周?chē)鷧^(qū)界限不易區(qū)分,神經(jīng)元壞死、變性,胞漿嗜酸,胞核溶解,細(xì)胞周邊呈扇形空泡改變,梗塞中心區(qū)可見(jiàn)細(xì)胞壞死,部分細(xì)胞消失,可見(jiàn)微血管、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。尼莫地平組及活血健腦膠囊組腦組織病理改變較輕,可見(jiàn)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞呈輕度的腫脹,個(gè)別神經(jīng)元呈變性改變(圖1)。 電鏡下見(jiàn)假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞體積大,細(xì)胞質(zhì)豐富,可見(jiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微絲、細(xì)
12、胞核大,呈圓形或橢圓形,有13個(gè);常染色質(zhì)豐富,異染色質(zhì)較少,可見(jiàn)線粒體輕微腫脹現(xiàn)象。模型組神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞體固縮或腫脹;細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)凝集成塊或溶解,異染色質(zhì)邊集,核膜連續(xù)性破壞或凹陷,核固縮或溶解壞死;許多線粒體腫脹成空泡狀,嵴模糊、斷裂、消失,線粒體內(nèi)基質(zhì)電子密度降低,整個(gè)細(xì)胞漿呈空化狀態(tài)。尼莫地平組可見(jiàn)核輕度不規(guī)則,核膜完整,異染色質(zhì)邊集現(xiàn)象少見(jiàn);異形線粒體較少,多數(shù)線粒體嵴清楚、連續(xù)?;钛∧X膠囊組神經(jīng)元線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹,線粒體嵴幾乎正常,有34個(gè)初級(jí)溶酶體,1個(gè)次級(jí)溶酶體,細(xì)胞核基本正常,可見(jiàn)大而明顯的核仁,細(xì)胞質(zhì)豐富,細(xì)胞器量較大,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及游離的核糖體量較多,可見(jiàn)
13、較多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(圖2)。 2.2 Cyt C蛋白表達(dá) 假手術(shù)組僅見(jiàn)Cyt C蛋白弱陽(yáng)性表達(dá);模型組大鼠腦缺血再灌注2h后Cyt C蛋白開(kāi)始表達(dá),再灌注6h表達(dá)量達(dá)高峰,再灌注12h表達(dá)量下降,再灌注24h降至最低點(diǎn)。再灌注24h內(nèi)Cyt C的表達(dá)區(qū)域主要集中在海馬錐體細(xì)胞和齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞?;钛∧X膠囊治療組腦缺血/再灌注6hCyt C陽(yáng)性表達(dá)較弱,與模型組比較有顯著性差異(P0.01) ,尼莫地平組腦缺血/再灌注12、24hCyt C陽(yáng)性表達(dá)與模型組及假手術(shù)組比較均無(wú)顯著性差異(P0.05)。尼莫地平組腦缺血/再灌注6、12、24hCyt C陽(yáng)性表達(dá)與模型組比較均無(wú)顯著性差異(P0.05
14、)。結(jié)果見(jiàn)表1、圖3。 2.3 Caspase3mRNA、Caspase9mRNA的表達(dá) 假手術(shù)組基底節(jié)、皮層、海馬Caspase3mRNA、Caspase9mRNA陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)元數(shù)較少。 模型組缺血再灌注后不同時(shí)間對(duì)缺血側(cè)腦組織中Caspase3mRNA、Caspase9mRNA3mRNA、Caspase9mRNA的表達(dá)無(wú)明顯增強(qiáng),再灌注6h缺血側(cè)海馬Caspase3mRNA、Caspase9mRNA的表達(dá)較假手術(shù)組及缺血對(duì)側(cè)增強(qiáng), 再灌注12hCaspase3mRNA、Caspase9mRNA的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng),于再灌注24達(dá)高峰,與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P0.05或P0.01)?;钛?/p>
15、健腦膠囊組腦缺血/再灌注24hCaspase9 mRNA、Caspase3mRNA表達(dá)均減弱, 與模型組比較有顯著性差異(P0.01),與尼莫地平組比較差異無(wú)顯著性意義(P0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2、表3、圖4、圖5。 3 討論 研究認(rèn)為各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,在細(xì)胞凋亡之前出現(xiàn)線粒體膜電位低下,引起膜的通透性增加,膜中存在的50kD的蛋白質(zhì)AIF(apoptosis inducing factor)向細(xì)胞質(zhì)中漏出,激活非活性的Caspase3使之活化5。電子傳遞體系中的細(xì)胞色素C也從線粒體中向細(xì)胞質(zhì)中漏出,在細(xì)胞質(zhì)中存在的脫氧腺苷三鱗酸(dATP)和凋亡酶激活表1 各組大鼠腦缺血/再灌注后海馬C
16、yt C表達(dá)比較 統(tǒng)計(jì)方法:t檢驗(yàn);.1,與假手術(shù)組比較;P0.01,與模型組比較表2 各組大鼠腦缺血再灌注后大鼠海馬Caspase3mRNA表達(dá)比較統(tǒng)計(jì)方法:Ridit 檢驗(yàn);.5,P0.01,與假手術(shù)組比較;P0.01,與模型組比較表3 各組大鼠腦缺血再灌注后大鼠海馬Caspase9mRNA3 mRNA表達(dá)比較(原位雜交,200) Figure 4 Comparison of Caspase3 mRNA expression in different groups (by insitu hybridization,200) a.9 mRNA表達(dá)比較(原位雜交,200) Figure 5 C
17、omparison of Caspase9 mRNA expression in different groups (by insitu hybridization,200) 因子1(Apaf1)的作用下,激活非活性的Caspase3使之活化,從而將細(xì)胞凋亡的信息傳遞下去6。另外,氧自由基產(chǎn)生、興奮性氨基酸的毒性作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥介質(zhì)的釋放皆直接或間接引發(fā)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變及細(xì)胞色素C的釋放,而這些改變又加重了自由基產(chǎn)生、興奮毒作用及鈣超載7-8。 本實(shí)驗(yàn)?zāi)X缺血再灌注24h組海馬神經(jīng)元損傷較重,從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核均發(fā)生了嚴(yán)重變化,甚至壞死。隨著缺血再灌注時(shí)程的增加,線粒體數(shù)目減少且明顯
18、腫脹,同時(shí),嵴膜表面密度明顯減少。應(yīng)用活血健腦膠囊治療后,海馬神經(jīng)元的損傷較輕,細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)基本正常。而腦缺血2h后再灌注6h至12h未用活血健腦膠囊治療者則神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)有一定程度的損傷,可見(jiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張并脫顆粒,核糖體和脂褐素顆粒增多,線粒體腫脹,細(xì)胞核周間隙稍增寬,異染色質(zhì)稍增多,異染色質(zhì)邊聚,說(shuō)明活血健腦膠囊對(duì)腦缺血后神經(jīng)元損傷具有一定修復(fù)作用,特別是對(duì)線粒體的保護(hù)作用較明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素C蛋白在缺血2h后再灌注6h的表達(dá)主要在海馬CA2區(qū)和齒狀回區(qū)。這一結(jié)果驗(yàn)證了腦缺血再灌注后的海馬神經(jīng)元凋亡中線粒體依賴(lài)凋亡途徑的存在。活血健腦膠囊能明顯減輕海馬神經(jīng)元的損傷,細(xì)
19、胞的超微結(jié)構(gòu)基本正常,細(xì)胞色素C蛋白未見(jiàn)增減變化,這可能是因?yàn)榛钛∧X膠囊能夠抑制細(xì)胞色素C蛋白從線粒體的漏出,阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳遞,從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 有報(bào)道4-5認(rèn)為在動(dòng)物腦缺血模型中,應(yīng)用Caspase3抑制劑治療可以縮小梗塞體積,延長(zhǎng)治療時(shí)間窗。本實(shí)驗(yàn)顯示應(yīng)用活血健腦膠囊可降低腦缺血/再灌注后腦組織Caspase3、Caspase9的活性,說(shuō)明本方可能作用于Caspase3前酶,抑制其激活;或直接作用于Caspase3,從而阻斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生。其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 【參考文獻(xiàn)】 1Shigeno T, Yamaski Y,Kato G, et al. Reduction
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