活血健腦膠囊對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用

1、活血健腦膠囊對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用核心提示：【摘要】【目的】研究活血健腦膠囊對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用?！痉椒ā窟x用SD大鼠， 【摘要】 【目的】研究活血健腦膠囊對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用?！痉椒ā窟x用SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組（劑量為10.8mgkg-1d-1）、活血健腦膠囊組（劑量為1.8gkg-1d-1），后3組再分為缺血2h及再灌注6、12、24h組；采用線栓法復(fù)制大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞色素C（Cyt C），原位雜交法檢測(cè)Caspase3mRNA、Caspase9mRNA的

2、表達(dá)?！窘Y(jié)果】活血健腦膠囊組腦缺血/再灌注6 h 細(xì)胞色素C陽(yáng)性弱表達(dá),與模型組比較有顯著性差異(P0.01)，腦缺血/再灌注12h、24h 細(xì)胞色素C的陽(yáng)性表達(dá)與模型組及假手術(shù)組比較無(wú)顯著性差異(P0.05)。模型組腦缺血再灌注24h海馬Caspase3 mRNA、Caspase9mRNA的表達(dá)達(dá)高峰(P0.01)；活血健腦膠囊組腦缺血/再灌注24hCaspase3 mRNA、Caspase9mRNA表達(dá)均減弱, 與模型組比較有顯著性差異(P0.01)?！窘Y(jié)論】活血健腦膠囊對(duì)局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用可能與其能影響神經(jīng)細(xì)胞Cyt C的釋放，降低腦缺血/再灌注后腦組織Caspase

3、3、Caspase9的活性，從而阻斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 活血健腦膠囊/藥理學(xué)； 腦缺血/中藥療法； 腦組織/病理學(xué)； 細(xì)胞凋亡； 疾病模型，動(dòng)物； 大鼠 1 材料與方法 1.1 動(dòng)物與藥物 SD大鼠78只，體質(zhì)量300350g，鼠齡56月齡，雌雄各半，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)： 0001475）?；钛∧X膠囊由上海復(fù)星臨西制藥有限公司提供（批號(hào)：200400306）；尼達(dá)爾片（尼莫地平），20mg/片，由天津市中央藥業(yè)有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：020602）；9g/L的氯化鈉注射液由北京雙鶴藥業(yè)有限公司提供(批號(hào):030312312)。 1.2 試劑與儀器 PM10AD光學(xué)顯

4、微鏡 （Olympus optical Co.Ltd，JAPAN）； HITACHI 7500型透射電子顯微鏡（JAPAN）；LEICARM2145型自動(dòng)切片機(jī)（德國(guó)）；phorbol estersil ( at final concentration of 0.20 mol/L) + ionomycin (at final concentration of 1 mg/L) for another 48 hours. After marked by monoclonal antibody of CD3 and CD71, the expression of CD3+CD71+ lymphocy

5、tes was observed by flow cytometry. Results SINO inhibited the lymphocytes proliferation in a concentrationdependant manner, and particularly had an inhibition on Jurkats cells at G0/G1 phase; MTX had an inhibition on S phase. The stimulation of ConA and phorbol estersil+ionomycin obviously increase

6、d the expression of CD3+CD71+ lymphocytes (P0.01); SINO at the concentrations of 1 and 0.5 mmol/L inhibited the expression of CD3+CD71+ lymphocytes after ConA stimulation, and SINO at the concentration of 1 mmol/L inhibited the expression of CD3+CD71+ lymphocytes after stimulation of phorbol estersi

7、l+ ionomycin (P0.05). Conclusion SINO can inhibit the activation and proliferation of T lymphocytes, and block the cells at G0/G1 phase. Its mechanism may be related with the downregulation of transferring receptor of T lymphocytes and with the decrease of intake of iron ion by the cells. Key words：

8、SINOMENINE/pharmacology; ARTHRITIS,RHEUMATOID/TCD therapy; TLYMPHOCYTES; CELL CULTUREHPIAS1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)（同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司）；Cyt C 、Caspase3mRNA、Caspase9mRNApon812Lysine液中浸5min，撈片后置5860烤箱中 45min以使切片緊密粘附，干燥備用；切片常規(guī)脫蠟至水；蒸餾水新鮮配置體積分?jǐn)?shù)為3%H2O2室溫處理10min，蒸餾水洗滌2min3次；切片浸入0.01mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）微波修復(fù)10min，反復(fù)2次，自

9、然冷卻后以0.1mol/LPBS洗滌2次；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20min；甩去多余液體，不洗；滴加50L抗Cyt C，4冰箱過(guò)夜，0.1mol/LPBS洗滌2min3次；加入濃度為10g/L的胎牛血清-緩沖液（BSAPBS3 mRNA、Caspase9 mRNA的表達(dá) 以40g/L多聚甲醛固定腦組織，石蠟包埋，常規(guī)切片（6m厚），脫蠟，水化，以體積分?jǐn)?shù)為30%H2O2 1份+蒸餾水10份混合，室溫510min以滅活內(nèi)源性酶；蒸餾水洗3次。暴露mRNA核酸片段:切片上滴加檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶（30g/L檸檬酸lmL加2滴濃縮型胃蛋白酶，混勻)，室溫消化15min；42預(yù)雜交2h，雜交

10、液中含探針2g /mL，42 雜交過(guò)夜，加入抗地高辛抗體(1800)，37孵育1h，DAB顯色37、30min左右，典型切片加上不含探針的雜交液做陰性對(duì)照。參考Kitazawa等5報(bào)道的方法計(jì)算Caspase3表達(dá)程度：計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野，將平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分為5類(lèi)，(1)0：陽(yáng)性細(xì)胞少于1，(2)1：陽(yáng)性細(xì)胞介于125；(3)2：陽(yáng)性細(xì)胞介于2550；(4)3：陽(yáng)性細(xì)胞介于5075；(5)4：陽(yáng)性細(xì)胞大于75。根據(jù)染色程度將陽(yáng)性信號(hào)分為3類(lèi)：(1)染色強(qiáng)度弱：+；(2)中等染色強(qiáng)度：+；(3)染色強(qiáng)度強(qiáng)：+。染色強(qiáng)度陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)為每個(gè)標(biāo)本染色的綜合記分。綜合記分1為表達(dá)陰性，否則，則判為陽(yáng)性。

11、Caspase9的測(cè)定同Caspase3稍作改動(dòng)。 1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.0 For Windows軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 2 結(jié)果 2.1 病理形態(tài) 假手術(shù)組腦組織結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯水腫；模型組HE染色缺血損傷累及廣泛皮層及紋狀體外側(cè)，缺血中心區(qū)與周?chē)鷧^(qū)界限不易區(qū)分，神經(jīng)元壞死、變性，胞漿嗜酸，胞核溶解，細(xì)胞周邊呈扇形空泡改變，梗塞中心區(qū)可見(jiàn)細(xì)胞壞死，部分細(xì)胞消失，可見(jiàn)微血管、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。尼莫地平組及活血健腦膠囊組腦組織病理改變較輕，可見(jiàn)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞呈輕度的腫脹，個(gè)別神經(jīng)元呈變性改變（圖1）。 電鏡下見(jiàn)假手術(shù)組神經(jīng)元細(xì)胞體積大，細(xì)胞質(zhì)豐富，可見(jiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微絲、細(xì)

12、胞核大，呈圓形或橢圓形，有13個(gè)；常染色質(zhì)豐富，異染色質(zhì)較少，可見(jiàn)線粒體輕微腫脹現(xiàn)象。模型組神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞體固縮或腫脹；細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)凝集成塊或溶解，異染色質(zhì)邊集，核膜連續(xù)性破壞或凹陷，核固縮或溶解壞死；許多線粒體腫脹成空泡狀，嵴模糊、斷裂、消失，線粒體內(nèi)基質(zhì)電子密度降低，整個(gè)細(xì)胞漿呈空化狀態(tài)。尼莫地平組可見(jiàn)核輕度不規(guī)則，核膜完整，異染色質(zhì)邊集現(xiàn)象少見(jiàn)；異形線粒體較少，多數(shù)線粒體嵴清楚、連續(xù)?；钛∧X膠囊組神經(jīng)元線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹,線粒體嵴幾乎正常，有34個(gè)初級(jí)溶酶體，1個(gè)次級(jí)溶酶體，細(xì)胞核基本正常，可見(jiàn)大而明顯的核仁，細(xì)胞質(zhì)豐富，細(xì)胞器量較大，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及游離的核糖體量較多，可見(jiàn)

13、較多的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（圖2）。 2.2 Cyt C蛋白表達(dá) 假手術(shù)組僅見(jiàn)Cyt C蛋白弱陽(yáng)性表達(dá)；模型組大鼠腦缺血再灌注2h后Cyt C蛋白開(kāi)始表達(dá)，再灌注6h表達(dá)量達(dá)高峰，再灌注12h表達(dá)量下降，再灌注24h降至最低點(diǎn)。再灌注24h內(nèi)Cyt C的表達(dá)區(qū)域主要集中在海馬錐體細(xì)胞和齒狀回區(qū)顆粒細(xì)胞?；钛∧X膠囊治療組腦缺血/再灌注6hCyt C陽(yáng)性表達(dá)較弱,與模型組比較有顯著性差異(P0.01) ,尼莫地平組腦缺血/再灌注12、24hCyt C陽(yáng)性表達(dá)與模型組及假手術(shù)組比較均無(wú)顯著性差異(P0.05)。尼莫地平組腦缺血/再灌注6、12、24hCyt C陽(yáng)性表達(dá)與模型組比較均無(wú)顯著性差異(P0.05

14、)。結(jié)果見(jiàn)表1、圖3。 2.3 Caspase3mRNA、Caspase9mRNA的表達(dá) 假手術(shù)組基底節(jié)、皮層、海馬Caspase3mRNA、Caspase9mRNA陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)元數(shù)較少。 模型組缺血再灌注后不同時(shí)間對(duì)缺血側(cè)腦組織中Caspase3mRNA、Caspase9mRNA3mRNA、Caspase9mRNA的表達(dá)無(wú)明顯增強(qiáng),再灌注6h缺血側(cè)海馬Caspase3mRNA、Caspase9mRNA的表達(dá)較假手術(shù)組及缺血對(duì)側(cè)增強(qiáng), 再灌注12hCaspase3mRNA、Caspase9mRNA的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)，于再灌注24達(dá)高峰,與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P0.05或P0.01)?；钛?/p>

15、健腦膠囊組腦缺血/再灌注24hCaspase9 mRNA、Caspase3mRNA表達(dá)均減弱, 與模型組比較有顯著性差異(P0.01)，與尼莫地平組比較差異無(wú)顯著性意義(P0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2、表3、圖4、圖5。 3 討論 研究認(rèn)為各種刺激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞凋亡之前出現(xiàn)線粒體膜電位低下，引起膜的通透性增加，膜中存在的50kD的蛋白質(zhì)AIF（apoptosis inducing factor）向細(xì)胞質(zhì)中漏出，激活非活性的Caspase3使之活化5。電子傳遞體系中的細(xì)胞色素C也從線粒體中向細(xì)胞質(zhì)中漏出，在細(xì)胞質(zhì)中存在的脫氧腺苷三鱗酸（dATP）和凋亡酶激活表1 各組大鼠腦缺血/再灌注后海馬C

16、yt C表達(dá)比較 統(tǒng)計(jì)方法：t檢驗(yàn)；.1，與假手術(shù)組比較；P0.01，與模型組比較表2 各組大鼠腦缺血再灌注后大鼠海馬Caspase3mRNA表達(dá)比較統(tǒng)計(jì)方法：Ridit 檢驗(yàn)；.5，P0.01，與假手術(shù)組比較；P0.01,與模型組比較表3 各組大鼠腦缺血再灌注后大鼠海馬Caspase9mRNA3 mRNA表達(dá)比較（原位雜交，200） Figure 4 Comparison of Caspase3 mRNA expression in different groups (by insitu hybridization,200) a.9 mRNA表達(dá)比較（原位雜交，200） Figure 5 C

17、omparison of Caspase9 mRNA expression in different groups (by insitu hybridization,200) 因子1（Apaf1）的作用下，激活非活性的Caspase3使之活化，從而將細(xì)胞凋亡的信息傳遞下去6。另外，氧自由基產(chǎn)生、興奮性氨基酸的毒性作用、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥介質(zhì)的釋放皆直接或間接引發(fā)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變及細(xì)胞色素C的釋放，而這些改變又加重了自由基產(chǎn)生、興奮毒作用及鈣超載7-8。 本實(shí)驗(yàn)?zāi)X缺血再灌注24h組海馬神經(jīng)元損傷較重,從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核均發(fā)生了嚴(yán)重變化,甚至壞死。隨著缺血再灌注時(shí)程的增加，線粒體數(shù)目減少且明顯

18、腫脹,同時(shí),嵴膜表面密度明顯減少。應(yīng)用活血健腦膠囊治療后，海馬神經(jīng)元的損傷較輕,細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)基本正常。而腦缺血2h后再灌注6h至12h未用活血健腦膠囊治療者則神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)有一定程度的損傷,可見(jiàn)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張并脫顆粒，核糖體和脂褐素顆粒增多，線粒體腫脹,細(xì)胞核周間隙稍增寬，異染色質(zhì)稍增多，異染色質(zhì)邊聚,說(shuō)明活血健腦膠囊對(duì)腦缺血后神經(jīng)元損傷具有一定修復(fù)作用,特別是對(duì)線粒體的保護(hù)作用較明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素C蛋白在缺血2h后再灌注6h的表達(dá)主要在海馬CA2區(qū)和齒狀回區(qū)。這一結(jié)果驗(yàn)證了腦缺血再灌注后的海馬神經(jīng)元凋亡中線粒體依賴(lài)凋亡途徑的存在。活血健腦膠囊能明顯減輕海馬神經(jīng)元的損傷,細(xì)

19、胞的超微結(jié)構(gòu)基本正常,細(xì)胞色素C蛋白未見(jiàn)增減變化，這可能是因?yàn)榛钛∧X膠囊能夠抑制細(xì)胞色素C蛋白從線粒體的漏出，阻斷細(xì)胞凋亡信號(hào)的傳遞，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 有報(bào)道4-5認(rèn)為在動(dòng)物腦缺血模型中，應(yīng)用Caspase3抑制劑治療可以縮小梗塞體積，延長(zhǎng)治療時(shí)間窗。本實(shí)驗(yàn)顯示應(yīng)用活血健腦膠囊可降低腦缺血/再灌注后腦組織Caspase3、Caspase9的活性，說(shuō)明本方可能作用于Caspase3前酶，抑制其激活；或直接作用于Caspase3，從而阻斷細(xì)胞凋亡的發(fā)生。其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 【參考文獻(xiàn)】 1Shigeno T, Yamaski Y，Kato G, et al. Reduction

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