植物遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌浸花法研究進(jìn)展

1、中國農(nóng)學(xué)通報2010,26(16:22-25Chinese Agricultural Science Bulletin 0引言遺傳轉(zhuǎn)化方法是進(jìn)行基因功能分析和改良作物性狀的必要手段,大多數(shù)的轉(zhuǎn)化方法都需要組織培養(yǎng)技術(shù),熟練的操作人員和特殊的設(shè)備。途經(jīng)愈傷組織培養(yǎng)階段的禾谷類轉(zhuǎn)化方法是非常成功的,但也存在許多的限制因素。通過組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行單細(xì)胞的選擇并再生出整個植株雖然減少了嵌合體的出現(xiàn),但是由于后生影響和染色體重排就會出現(xiàn)體細(xì)胞無性系變異。利用浸花的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因,其特點是避免了組織培養(yǎng)和再生過程1-6。前人的研究表明,浸花得到的T 0代種子是典型的雜合子,在同一插入位點只有2個等位基因中的

2、一個3,7。大量的結(jié)果表明轉(zhuǎn)化發(fā)生在花發(fā)育的后期3,8。盡管浸花的方法有較高的轉(zhuǎn)化率(T 0代種子約4%,但對于轉(zhuǎn)化的細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的時間仍然基金項目:國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項“抗逆轉(zhuǎn)基因玉米新品種培育”(2008ZX08003-004。第一作者簡介:高建強,男,1975年出生,博士研究生,生物化學(xué)與分子生物學(xué),從事玉米抗逆轉(zhuǎn)基因育種研究,通信地址:北京中關(guān)村南大街12號中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,Tel E-mail :gaojq123 。植物遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌浸花法研究進(jìn)展高建強,梁華,趙軍(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所,北京100081摘要:為了為玉米農(nóng)桿菌介導(dǎo)

3、浸染花序遺傳轉(zhuǎn)化方法找到理論依據(jù),論述了浸染花序的遺傳轉(zhuǎn)化方法在擬南芥中的研究進(jìn)展,說明農(nóng)桿菌浸染的目的受體是胚珠,證實轉(zhuǎn)化時間發(fā)生在授粉前。近年在黑麥和小麥的浸染花序遺傳轉(zhuǎn)化上的研究結(jié)果證實,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸染花序的遺傳轉(zhuǎn)化方法在禾本科麥類作物是可行的。遺傳轉(zhuǎn)化方法是進(jìn)行基因功能分析和改良作物性狀的必要手段,經(jīng)愈傷組織培養(yǎng)階段的禾谷類轉(zhuǎn)化方法存在許多的限制因素,農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸染花序遺傳轉(zhuǎn)化方法避免了愈傷組織培養(yǎng)過程,而且可節(jié)省大量的時間,為作物的遺傳改良提供有效的快速獲得轉(zhuǎn)基因植株的方法。關(guān)鍵詞:浸花法;植物遺傳轉(zhuǎn)化;擬南芥;生殖細(xì)胞;禾本科中圖分類號:Q812文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A論文編號:2010

4、-0931Progress on the Floral-dip Method of Agribacterium-mediated Plant TransformationGao Jianqiang,Liang Hua ,Zhao Jun(Biotechnology Research Institute ,Chinese Academy of Agricultural Sciences ,Beijing 100081Abstract:In order to find the theoretical basis for floral-dip genetic transformation metho

5、d in maize mediatedby Agrobacterium ,This article discusses the development of floral-dip genetic transformation method inArabidopsis .It shows that the purpose receptor of Agrobacterium infection is ovule,and the conversion timeoccurs before pollination.In recent years the study of floral-dip genet

6、ic transformation in rye and wheat suggested that Agrobacterium -mediated floral-dip genetic transformation methods in wheat grass is feasible.It is necessary means of genetic transformation method for gene function analysis and improvement of crop traits.There are many constraints for transformatio

7、n method of cereal by the callus culture phase.The floral-dip genetic transformation method mediated by Agrobacterium avoids the process of callus culture and save a lot of time,so it can be to provide fast and effective transgenic method of crops genetic improvement .Key words:floral-dip;plant gene

8、tic transformation;Arabidopsis thaliana ;germ cell;gramineae高建強等:植物遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌浸花法研究進(jìn)展不太清楚。1浸花轉(zhuǎn)基因法在擬南芥上的研究進(jìn)展1998年,Clough 等6改進(jìn)了擬南芥浸染方法,用5%蔗糖,500L/L 的silwet L-77,OD 600=0.8的浸染液浸醮替代真空滲入,得到了0.5%3%的轉(zhuǎn)化率。并總結(jié)了轉(zhuǎn)化成功的3個條件:合適的發(fā)育時期、蔗糖濃度和表面活性劑。1999年Ye 等9用GUS 作為標(biāo)記基因通過真空滲入法證實,GUS 基因是通過胚珠傳遞的。GUS 在轉(zhuǎn)化植株的胚珠中是始終表達(dá)的;在成熟的花粉和花粉

9、囊中,只是在轉(zhuǎn)化后012天表達(dá),在轉(zhuǎn)化35天后花粉的表達(dá)頻率只達(dá)到1%,而在511天未開花的胚珠中表達(dá)率則高達(dá)6%。尤其是轉(zhuǎn)基因種子只能在導(dǎo)入基因的花粉受體植株上得到,而不是花粉供體植株上得到。這說明農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化是通過胚珠進(jìn)行的。2000年,Desfeux 等10為證實轉(zhuǎn)基因的受體是雌配子而不是雄配子,用被注射農(nóng)桿菌的擬南芥作為母本或者父本進(jìn)行大量的雜交實驗,結(jié)果表明,只有被注射農(nóng)桿菌的擬南芥作為母本供體才能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代。實驗還監(jiān)測到T-DNA 攜帶的GUS 報告基因的在各胚珠上的染色,卻沒有在花粉中觀測到染色(圖1,T-DNA 的插入事件在來自同一角果的各轉(zhuǎn)基因籽苗之間是相互獨立的。綜合以

10、上內(nèi)容可以認(rèn)為,轉(zhuǎn)基因的主要靶目標(biāo)是胚珠。進(jìn)一步觀察表明,在有些情況下所有胚珠都被染色,而有些情況下只在胚囊靠近珠孔的部位的胚珠內(nèi)部才被染色。這可能是不同的發(fā)育階段即從胚珠原基到胚珠的各個發(fā)育階段甚至新授粉的胚充當(dāng)了效果不同的轉(zhuǎn)化目標(biāo)所致,但是花粉從萌發(fā)到授粉都沒有觀察到染色。Bechtold 等11確定了擬南芥轉(zhuǎn)化的基因組是母體的基因組。綜上所述,在擬南芥中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法,不論是浸花法還是真空滲入法,T-DNA 片段只能通過胚珠傳遞而不能通過花粉傳遞。Labra 等12在擬南芥上用浸花的方法獲得了穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株。2浸花轉(zhuǎn)基因法在禾本科作物上的研究進(jìn)展 Pe a 等13將外源DN

11、A 注射到黑麥的幼穗上得到了轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)化時期是根據(jù)小穗發(fā)育的形態(tài)來確定:當(dāng)植株長到5片葉,旗葉達(dá)到終長度的1/31/2時,大約在植株第3片葉的地方,具有一個大約2cm 的花序,這個時候的花序最適合注射。結(jié)核菌素試驗證明此時距離減數(shù)分裂還有14天。注射后的花序逐漸發(fā)育成熟,并授粉結(jié)實(圖2。結(jié)果表明,可能將新的遺傳信息導(dǎo)入谷物類的生殖細(xì)胞,收獲的種子能夠長成正常的植株,外源基因已經(jīng)存在于植株基因組中并表達(dá)。重復(fù)試驗也驗證了上述結(jié)果,其平均轉(zhuǎn)化率大約為0.3%。Pe a 假定DNA 是通過植物的維管系統(tǒng)進(jìn)入生殖細(xì)胞的,而生殖細(xì)胞只在一個合適的時期能夠吸收外來的DNA 。這個時期在黑麥栽培種中大

12、約是減數(shù)分裂前2個星期,相當(dāng)于雄性組織的減數(shù)分裂前,倒數(shù)第二次有絲分裂期14。因為雄性生殖細(xì)胞沒有被胼胝質(zhì)壁所包圍,所以不能被轉(zhuǎn)化。為了進(jìn)行減數(shù)分裂,細(xì)胞經(jīng)歷了許多的改變,其中與攝取DNA 相關(guān)的最重要的改變,是建立了聯(lián)系孢原細(xì)胞的染色質(zhì)通道,DNA 分子可以通過這些結(jié)構(gòu)進(jìn)入細(xì)胞15。Janice 等16用浸花的方法成功轉(zhuǎn)化了六倍體小麥并能穩(wěn)定表達(dá)外源基因。用處于開花前,單核小孢子的前、中、后期的小穗做實驗。小穗的長度由于培養(yǎng)條件的不同而有所不同,最合適的小穗長度大約在67cm ,此時小穗還未露出葉鞘。用剪刀輕輕去除葉鞘并剪去正在發(fā)育的小花,去除頂端和未端發(fā)育不良的小花而保留中部的小花,保留的

13、小花剪到穎殼的未端,處理過的小穗浸在農(nóng)桿菌浸染液中1.52min ,并套塑料袋2天以保持較高的濕度(圖3,浸花轉(zhuǎn)化在孕穗早期,A ,B ,C 和D :ACT11-gusA (無內(nèi)含子。C 和E :ACT11-gusA-intron 。圖1GUS 在胚珠或花中發(fā)育種子通過帶有ACT11-gusA農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)23小麥小穗還未抽出葉鞘時進(jìn)行。然后,去除塑料袋使小穗在空氣中晾干。當(dāng)小穗發(fā)育到開花期時,套上羊皮紙袋以阻止異花授粉,盡管這會降低結(jié)實率。成熟的種子記為T 0,收獲并進(jìn)行篩選。在T 0代植株上檢測到了轉(zhuǎn)基因信號,并觀察到相關(guān)基因的表型。試驗結(jié)果表明,不使用組織培養(yǎng)技術(shù)的浸花轉(zhuǎn)基

14、因方法,可以獲得穩(wěn)定遺傳低拷貝數(shù)的轉(zhuǎn)化株,在T 5和T 6代都觀察到了基因的表達(dá)。3浸花轉(zhuǎn)基因方法在其他物種上的研究進(jìn)展Bartholmes 等17以兩年生草本植物薺菜(Capsellabursa-pastoris 為材料,用2種農(nóng)桿菌LBA4404和圖2轉(zhuǎn)化計劃與篩選策略示意圖 圖3小麥浸花轉(zhuǎn)化的時期GV3101為載體,以GFP 和BAR 為標(biāo)記基因,通過浸花的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。圖4中可以清楚的看到,GFP 和BAR 基因在轉(zhuǎn)化后代中表達(dá)。證明此方法在薺菜(Capsella bursa-pastoris 中的轉(zhuǎn)化是成功的。收獲的種子播種,發(fā)芽率最低1%,大多數(shù)30%50%,最高可達(dá)80%。結(jié)果顯

15、示,MS 培養(yǎng)基改變成份并不影響轉(zhuǎn)化效率,0.02%0.05%Silwet L-77對轉(zhuǎn)化效率的影響也不大,10%的蔗糖和GV3101菌株下轉(zhuǎn)化效率最高。4前景當(dāng)前,人們也在嘗試采用不通過組織培養(yǎng)的技術(shù)來取得轉(zhuǎn)基因的成功。如花粉管通道法、子房注射法,莖尖浸染法等,到目前為止,還沒有一個方法稱得上非注射DNA2cm 花序卡那霉素抗性株處理植株的防雜交卡那霉素篩選比例尺2cmabcd1mm1mm1cm24高建強等:植物遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌浸花法研究進(jìn)展常適用。而從擬南芥上發(fā)展過來的浸染花序的方法,在許多作物的轉(zhuǎn)化中非常有效。浸染花序的轉(zhuǎn)基因方法簡單易行,也不需要經(jīng)過組織培養(yǎng)過程,為玉米及其他作物中轉(zhuǎn)化方

16、法的研究提供了一個新的思路,即不使用組織培養(yǎng)技術(shù)的情況下,高效率獲得轉(zhuǎn)基因植株。在禾本科的黑麥和小麥上已經(jīng)獲得了成功,同樣作為禾本科作物的玉米也應(yīng)該適合該方法,主要在于如何實施設(shè)計試驗方案。 我們采用適用于玉米的類似擬南芥浸染花序的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因方法的研究,試圖找出用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的禾本科作物基因遺傳轉(zhuǎn)化的最簡便、有效的方法,建立不依賴于植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)的高效、規(guī)?；霓D(zhuǎn)化體系,使基因工程技術(shù)能與常規(guī)育種有效結(jié)合,成為大多數(shù)育種工作者手中的有力工具,促進(jìn)更多的基因工程品種用于生產(chǎn)。進(jìn)而推動當(dāng)前農(nóng)作物生物工程的發(fā)展。參考文獻(xiàn)1FeldmannKA,MarksMD.Agrobacterium -me

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