檢驗方法驗證標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

1、標(biāo) 題 檢驗方法驗證標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程 共7頁第1頁制定人頒發(fā)部門GMP辦公室編 號： SOP-F004分發(fā)部門 質(zhì)量驗證小組、質(zhì)量保證部新訂 替代審核人批準(zhǔn)人 生效日期年 月 日標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程STANDARD OPERATING PROCEDURE目 的：建立檢驗方法驗證標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，規(guī)范驗證操作。適用范圍：所有檢驗方法的驗證。責(zé) 任 者：質(zhì)量保證部、質(zhì)量控制部程 序：1、檢驗方法驗證的基本內(nèi)容 檢驗方法驗證的基本內(nèi)容包括方案的起草及審批，檢測儀器的確認(rèn)適用性驗證(包括準(zhǔn)確度試驗、精密度測定線性范圍試驗、專屬性試驗等)和結(jié)果評價及批準(zhǔn)四個欠的方面。它的基本內(nèi)容可以用下圖表示。2、檢驗方法驗證的基本步

2、驟 首先是制定驗證方案，然后對大型精密儀器進(jìn)行確認(rèn)，最關(guān)鍵的一步是檢驗方法的適用性試驗，最后是檢驗方法評價及批準(zhǔn)。21驗證方案的制定 檢驗方法的驗證方案通常由質(zhì)量驗證小組提出。根據(jù)產(chǎn)品的工藝條件、原輔料化學(xué)結(jié)構(gòu)、中間體、分解產(chǎn)物查閱有關(guān)資料，提出規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)，確定檢查項目，規(guī)定雜質(zhì)限度，即為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案。根據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)草案確定檢查和試驗范圍，對檢驗方法擬定具體操作步驟，最后經(jīng)有關(guān)人員審批方可實施。22大型精密儀器的確認(rèn) 分析測試中所用的檢測儀器一般可分為三類(1)普通儀器：崩解儀，折光儀、分析天平、酸度計、溶點測定儀、電導(dǎo)儀等：(2)較精密儀器：旋光儀、永停滴定儀、費休氏水分測定儀、 自動滴定儀、藥

3、物溶出度儀、可共7頁第2頁見分光光度計、電泳儀等； (3)大型精密儀器：紫外分光光度計、紅外分光光度計、氣相色譜儀、高效液相色譜儀、薄層掃描儀等。 為了保證分析測試數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，每臺檢測儀器在投入正式使用之前都應(yīng)進(jìn)行確認(rèn)。檢測儀器的確認(rèn)是檢驗方法驗證的基礎(chǔ)，應(yīng)在其它驗證試驗開始之前首先完成。檢測儀器確認(rèn)工作內(nèi)容應(yīng)根據(jù)儀器類型。技術(shù)性能而定，通常包括：安裝確認(rèn)、校正、適用性預(yù)試驗和再確認(rèn)。 221安裝確認(rèn) 同工藝驗證中機(jī)械設(shè)備一樣，儀器安裝確認(rèn)的土要內(nèi)容包括如下各點：(1)要登記儀器名稱型號。生產(chǎn)廠商的編號、生產(chǎn)日期生產(chǎn)廠商名稱，企業(yè)內(nèi)部的固定資產(chǎn)設(shè)備登記號及安裝地點；(2)收集匯編和翻譯儀器使

4、用說明書和維修保養(yǎng)手冊；(3)檢查并記錄所驗收的儀器是否符合廠方規(guī)定的規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)：(4)檢查并確保有該儀器的使用說明書。維修保養(yǎng)手冊和備件清單：(5)檢查安裝是否恰當(dāng)，氣、電及管路連接是否符合要求；(6)制定儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)和維修保養(yǎng)制度，建立使用記錄和維修記錄；(7)制定清洗規(guī)程； (8)明確儀器設(shè)備技術(shù)資抖(圖紙，手冊，備件清單、各種指南及該機(jī)器設(shè)備有關(guān)的其它文件)的專管人員及存放地點。 除上面提到的內(nèi)容外，在安裝確認(rèn)方案中對儀器的性能用途應(yīng)有一概述并記錄維修服務(wù)單位名稱。聯(lián)系人、電話號碼、傳真號、銀行帳號等，以利于日后的維修保養(yǎng)活動，這對大型精密儀器尤為重要。對于儀器來說，安裝確

5、認(rèn)中的一項重要內(nèi)容是功能試驗。這項工作在安裝結(jié)束，檢查合格后即可著手進(jìn)行。儀器功能試驗足在不使用樣品的前提下，確認(rèn)儀器達(dá)到設(shè)計要求，也可認(rèn)為是空載試驗。例如氣相色譜儀的程序升溫設(shè)定后能否按設(shè)定程序執(zhí)行，溶出儀轉(zhuǎn)速能否達(dá)到規(guī)定的性能要求。紫外分光光度計的吸收度與透光率的轉(zhuǎn)換是否符合要求。高效液相色譜儀高壓泵過壓保護(hù)是否起作用等，這是檢查儀器安裝后能達(dá)到規(guī)定的性能指標(biāo)。對普通儀器進(jìn)行的功能試驗比較簡單，有的除儀器校正外，沒有其它特殊的功能試驗要做，如酸度計，電導(dǎo)儀，折光儀等。不同的儀器有不同的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)根據(jù)儀器使用說明書的要求進(jìn)行試驗。 222校正 校正是儀器確認(rèn)及檢驗方法驗證中的一個重要環(huán)節(jié)，

6、應(yīng)當(dāng)在驗證試驗以前進(jìn)行校正。紫外分光光度計校正包括波長校正、吸收度測試、準(zhǔn)確度測試、雜散光檢查。 氣相色譜儀與高效液相色譜儀均要求做系統(tǒng)適用性試驗。在規(guī)定的色譜條件下測定色譜柱的最小理論塔板數(shù)。分離度和拖尾因子，并規(guī)定變異系數(shù)應(yīng)不大于2。 對于化學(xué)檢驗中使用的計量儀器包括容量瓶、移液管、滴定管、分析天平亦均應(yīng)校正。共7頁第3頁223適用性預(yù)試驗儀器的安裝確認(rèn)完成以后，-在其功能試驗符合要求的情況下，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌穼ζ溥M(jìn)行適用性檢查，以確認(rèn)儀器是否符合使用要求。例如對熔點測定儀的適用性預(yù)試驗是采用已知溶點的甲硝唑做試驗，測試結(jié)果與已知熔點比較。紫外分光光度計可用已知含量的某標(biāo)準(zhǔn)品試驗，測得結(jié)

7、果與已知數(shù)值對比，確定儀器是否符合使用要求。 在完成上述各項試驗工作的同時，應(yīng)做好相應(yīng)的文件記錄等資料歸檔工作，每一臺儀器均應(yīng)有一套完整的檔案資料。224再確認(rèn) 為了確保儀器處于良好的使用狀態(tài)，對于一臺新購買的儀器在確認(rèn)工作結(jié)束以后，應(yīng)根據(jù)儀器的類別。確認(rèn)的經(jīng)驗制定再確認(rèn)的計劃。再確認(rèn)的時間間隔和內(nèi)容要根據(jù)儀器類別和使用情況決定，一般是3個月、6個月或1年。儀器再確認(rèn)的內(nèi)容通常包括線路連接、附件備品消耗晶檢查、清潔工作、功能試驗、工作日記等，其中重點足安裝確認(rèn)中的功能試驗。3、檢驗方法的適用性驗證 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗證的目的是證明采用的方法適合于相應(yīng)的檢測要求。在起草藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，分析方

8、法需經(jīng)驗證：在藥物生產(chǎn)方法變更、制劑的組分變更、原分析方法進(jìn)行修訂時，則質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法也需進(jìn)行驗證。方法驗證過程和結(jié)果均應(yīng)記載在藥品標(biāo)準(zhǔn)起草或修訂說明中。 根據(jù)中國藥典 (2000版)附錄XIXA的原則要求，檢驗方法的驗證可分為三種情況處理； (1)無需驗證的方法。如藥典(包括USP、EP、CP、JP等各國藥典)的方法，一般只做系統(tǒng)適用性試驗，以確認(rèn)系統(tǒng)是否符合要求(主要指儀器穩(wěn)定性及柱的分離度是否達(dá)標(biāo))。 (2)對比法。已在參比實驗室驗證過的分析方法，可用對比試驗的方法來確認(rèn)方法的可靠性，即將本實驗室與參比實驗室用同一方法對同批樣品所測數(shù)據(jù)進(jìn)行比較(如至少取五個批號，每批重復(fù)測定五次)，判

9、斷方法在本實驗室的可行性。如有差異需查明原因或設(shè)計方案，對方法進(jìn)行再驗證。 (3)需進(jìn)行系統(tǒng)驗證的方法。可按下表要求進(jìn)行驗證試驗：檢驗方法驗證要求 類 型 驗證項目 類 型I 類 型 類 型 類 型IV 定量測定 限度試驗 準(zhǔn)確度 要 求 要 求 * * 不要求 精密度 要 求 要 求 不要求 要 求 不要求 專屬性 要 求 要 求 要 求 * 要 求 檢測限 不要求 不要求 要 求 * 不要求 定量限 不要求 要 求 不要求 * 不要求 線 性 要 求 要 求 不要求* 不要求 范 圍 要 求 要 求* 不要求共7頁第4頁注：*表示需根據(jù)實驗特性決定是否作要求。其中：類型I：指用于測定原料藥

10、中主要成分或制劑中活性組份(包括防腐劑)的定量分析方法。類型：指用于測定原料藥中雜質(zhì)或制劑中降解產(chǎn)物的分析方法，包括定量分析和限度試驗。類型：用于測定性能特性(如溶解度、溶出度)的分析方法。類型：鑒別試驗。專屬性試驗如一種方法不夠?qū)伲捎闷渌治龇椒ㄓ枰匝a(bǔ)充。 在儀器確認(rèn)的基礎(chǔ)上，應(yīng)著手驗證檢驗方法的適用性。適用性驗證內(nèi)容包括準(zhǔn)確度試驗、精密度測定、線性范圍試驗、專屬性試驗四個方面。 31準(zhǔn)確度試驗 準(zhǔn)確度系指用該方法測定的結(jié)果與真實值或參考值接近的程度，一般以回收率()表示，也可用平均值與真值間的差異及其可信限表示。測量值與真值愈接近，測量值的誤差愈小，測量就愈準(zhǔn)確。 準(zhǔn)確度的測定至少要取

11、方法范圍內(nèi)的3個濃度級別。每個濃度級別至少要3個結(jié)果。9個結(jié)果的精密度應(yīng)符合要求，回收率均應(yīng)在限度內(nèi)。對于常量分析，回收率至少應(yīng)在95%105之間；對于微量或半微量分析，回收率可根據(jù)儀器本身條件適當(dāng)放寬。準(zhǔn)確度應(yīng)在規(guī)定的范圍內(nèi)建立。 在準(zhǔn)確度試驗中有三種試驗方法即對照試驗、回收試驗，空白試驗。 (1)對照試驗：把標(biāo)準(zhǔn)樣品或純凈物質(zhì)作樣品，以所用的方法對它進(jìn)行定量分析，從分析結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)樣品或純凈物的含量差值就可知道誤差，這種試驗叫對照試驗。 (2)回收試驗：在樣品中加入已知含量的被測組分，用同一方法進(jìn)行定量分析，由分析結(jié)果中被測組分的增大值與加入量之差就可知道誤差，這種試驗叫做回收試驗。 (3)

12、空白試驗：用空白代替樣品，以所用方法進(jìn)行定量分析，從分析結(jié)果減去空白值以提高其準(zhǔn)確度，這樣的試驗叫做空白試驗。 在檢驗方法驗證中，方法的準(zhǔn)確度通常用回收率()表示。原料藥用已知含量的對照品或標(biāo)準(zhǔn)品作樣品，以所用的方法進(jìn)行檢驗。而制劑是用已知含量的原料和處方中相應(yīng)的輔料按比例模擬配制成制劑后做試驗，取樣量應(yīng)在標(biāo)示量的9001100范圍內(nèi)。 原料藥的含量分析：通過分析已知含量的參比標(biāo)準(zhǔn)來確定此方法的準(zhǔn)確度?；蛘甙汛朔椒ǖ姆治鼋Y(jié)果與另一有確定準(zhǔn)確度的方法的分析結(jié)果進(jìn)行比較來確定準(zhǔn)確度。 制劑中各組份的含量分析：按制劑處方取適量各組份進(jìn)行有機(jī)混合得一混合物，在方法的范圍內(nèi)，往此混合物中加入己知量的被分

13、析物進(jìn)行分析，從而確定方法的準(zhǔn)確度。若不可能得到制劑中所有組份的樣品，可用以下方法確定準(zhǔn)確度： a往制劑中加入巳知量的被分析物； b.將此方法的分析結(jié)果與另一有確定準(zhǔn)確度的方法的分析結(jié)果進(jìn)行比較。 雜質(zhì)的定量分析：通過往樣品中加入已知量的雜質(zhì)來確定。 共7頁第5頁若不可能得到某種雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的參比標(biāo)準(zhǔn)品，可把此方法的分析結(jié)果與另一已驗證的方法的結(jié)果進(jìn)行比較來確定。 若雜質(zhì)為未知物，可通過計算雜質(zhì)與主藥響應(yīng)值的比值來確定：若響應(yīng)因子(等量的雜質(zhì)和主藥的響應(yīng)比值)是已知的，應(yīng)使用響應(yīng)因子進(jìn)行計算。32精密度測定 待驗證的檢驗方法還必須通過精密度測定試驗。精密度系指在規(guī)定的測試條件下，同一個均勻樣

14、品，經(jīng)多次取樣測定所得結(jié)果之間的接近程度，即一組測量值彼此符合的程度。測量值彼此愈接近，測量值的偏差愈小，測量就愈精密。所以也稱為重現(xiàn)性，亦稱為變異系數(shù)，一般可用偏差、標(biāo)準(zhǔn)偏差或相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。但是測量的精密度不能說明測量值與真值的關(guān)系，亦即精密度高并不等于準(zhǔn)確度就一定高。精密的測量值不一定是準(zhǔn)確的，因為引起測量值遠(yuǎn)離真值的誤差會對一系列的測量發(fā)生相同的影響，因而不影響精密度。 對常用的檢驗方法來說，至少應(yīng)使用樣品(每個樣品均應(yīng)經(jīng)過從樣品制備到最終測定的過程)測定6次。一般地，對于化學(xué)分析方法，相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)應(yīng)不大于10；對于儀器分析方法，RSD應(yīng)不大于20或根據(jù)儀器自身參數(shù)確定。不僅

15、要測定一天內(nèi)的相對標(biāo)準(zhǔn)差，而且還應(yīng)測定不同測定日之間的相對標(biāo)準(zhǔn)差，一般要求做平行試驗4次以上，進(jìn)行計算。 日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)差應(yīng)接近。在不同實驗室，用不同廠商牌號的儀器(儀器性能試驗均達(dá)到某一規(guī)定指標(biāo))，以同一檢驗方法分析同一樣品，從分析結(jié)果采比較它們相互一致的程度稱之為再現(xiàn)性試驗(協(xié)作分析測試)，這是以往法定檢驗方法常用的復(fù)核檢驗方法。例如紫外分光光度法中吸收系數(shù)E1cm1%的確定，通過5個以上實驗室分析，測定結(jié)果符合數(shù)理統(tǒng)計要求，才能采納使用。33線性范圍試驗 線性是指所用分析方法在給定范圍內(nèi)獲取與樣品中供試物濃度成正比的試驗結(jié)果的能力。所謂范圍是指利用給定分析方法取得精密度、準(zhǔn)確度、線性

16、均符合要求的供試物濃度的變化范圍(最大值與最小值間的間隔)，通常用百分?jǐn)?shù)或mgml表示。 在檢驗過程中取樣量或樣品濃度是允許在一定范圍內(nèi)變化的，測定的結(jié)果也應(yīng)隨著取樣量或樣品濃度成正比的變化，這樣的檢驗方法才能達(dá)到準(zhǔn)確度和精密度的要求。取樣量在一定范圍內(nèi)變化時，測定含量的結(jié)果也成正比的變化，這樣的取樣范圍稱之為線性范圍。在紫外分光光度法中樣品濃度與吸收度成正比關(guān)系，線性范圍寬，用重鉻酸鉀溶液作儀器吸收度的準(zhǔn)確度檢查中采用與規(guī)定吸收系數(shù)比較。絕大多數(shù)的品種含量測定中也采用吸收系數(shù)法計算含量。氣相色譜和高效液相色譜分析中進(jìn)樣量與峰面積的線性范圍視檢測器的種類和具體品種而異。 檢驗方法的準(zhǔn)確度是隨著

17、所測定的含量范圍而發(fā)生變化的。超過一定的范圍，準(zhǔn)確度就受影響。線性的確定要在標(biāo)準(zhǔn)的0150范圍內(nèi)至少使用5個濃度。濃度與其對應(yīng)的測定值經(jīng)二次回歸得到相關(guān)系數(shù)r，對于化學(xué)分析，相關(guān)系數(shù)r應(yīng)不小于09990；對于儀器分析，相關(guān)系數(shù)值不小于0990對此的任何偏離都將說明這一檢驗方法在這一濃度范圍是不適用的，在這種情況下，應(yīng)該修改檢驗方法。線性范圍是用實驗證實樣品中含有此范圍內(nèi)濃度的樣品時，共7頁第6頁能符合規(guī)定的準(zhǔn)確度、精密度和線性的要求。具體要求如下： 項 目 含量測定 雜質(zhì)測定含量均勻度 溶出度范圍(相對于樣品標(biāo)準(zhǔn))801205012070130 20%34專屬性試驗 專屬性是指在樣品介質(zhì)中有其

18、它組份共存時，檢驗方法對供試物準(zhǔn)確而專屬的測定能力。 定吐分析(鑒別試驗)：需證明(可與一已知參比物進(jìn)行對照)當(dāng)樣品中含有被分析物時呈陽性反應(yīng)，不含被分析物時呈陰性反應(yīng)。必要時，要證明與被分析物結(jié)構(gòu)相似或相近的物質(zhì)不呈陽性反應(yīng)。 雜質(zhì)：取含一定雜質(zhì)量的樣品進(jìn)行分析，證明其具有適宜的準(zhǔn)確度和精密度。 含量分析：加入一定量的雜質(zhì)或賦形劑至產(chǎn)品中，通過分析證明結(jié)果不受影響。若雜質(zhì)或降解產(chǎn)物為未知物，可將樣品在一定的光、熱、濕度、酸堿度或氧化劑等條件下存放，而后將此分析方法與藥典方法或經(jīng)驗證的方法的結(jié)果進(jìn)行比較。含量分析可比較結(jié)果數(shù)據(jù)，譜圖可比較圖譜的形狀及結(jié)構(gòu)。 檢驗方法的專屬性試驗應(yīng)根據(jù)被測樣品中

19、主藥的中間體或可能的分解產(chǎn)物以及所用的輔料對檢驗方法驗證的影響進(jìn)行試驗。為排除主藥的中間體或可能的分解產(chǎn)物、輔料對主藥測定的干擾，定量測定分解產(chǎn)物或雜質(zhì)時用氣相色譜法或高效液相色譜法已成為常用的測定方法。這足因為氣相色譜、高效液相色譜可利用不同填料，選擇不同的流動相，采用程序升溫或梯度淋洗，把分解產(chǎn)物或雜質(zhì)分離出來，氣相色譜和高效液相色譜對分解產(chǎn)物或雜質(zhì)有很好的選擇性，其原因也在于此。35檢測限 檢測限用以表示測量方法在所達(dá)條件下對樣品中供試物的最低檢出濃度，無需定量測定只需指出高于或低于該規(guī)定濃度即可，常用百分?jǐn)?shù)，mgml或mgL表示。非儀器分析方法：通過已知濃度的樣品分析來確定可檢出的最低

20、水平作為檢測限。儀器分析方法：可用已知濃度的樣品與空白試驗對照，以信噪比為2：l或3：l來確定檢測限的最低水平；也可通過多次空白試驗，求得其背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差，乘以2或3，作為檢測限的估計值。不論用哪種方法，均需制備相應(yīng)檢測限濃度的樣品，反復(fù)測試來進(jìn)行確定。36定量限 定量限是指在樣品介質(zhì)中可定量測得的某一物質(zhì)的最低水平的參數(shù)，例如原料藥中的雜質(zhì)或制劑中的降解產(chǎn)物等。定量限規(guī)定的最低測得濃度應(yīng)符合一定的精密度和準(zhǔn)確度的要求。定量限用百分?jǐn)?shù)、mgm1或gm1表示。 對于非儀器分析方法，與檢測限的非儀器分析方法所用方法相同，只足所得結(jié)果需符合一定的準(zhǔn)確度和精密度；對于儀器分析方法，將多次空白試驗測得

21、的背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差，乘以共7頁第7頁10，作為定量限的估計值，然后配制相應(yīng)定量限濃度的樣品，反復(fù)測試來進(jìn)行確定。37應(yīng)注意的幾個問題 在檢驗方法的適用性驗證中，最重要的是準(zhǔn)確度、精密度。為了順利完成驗證試驗，還應(yīng)注意以下幾點： (1)取樣和稱量。分析檢驗所使用的部分樣品應(yīng)該代表整個抽取樣品，理想的樣品能代表整個批，即樣品的這一部分和其它部分應(yīng)具有同一性，樣品和相應(yīng)的批也應(yīng)該具有同一性，這就是我們常說的樣品的代表性。 可以用這樣的方法來檢查樣品的代表性。將某一樣品測定得到的精密度與同一批號其它樣品測得的精密度數(shù)據(jù)加以對比，不相符合表示樣品的代表性存在問題，需進(jìn)一步調(diào)查原因。稱量的準(zhǔn)確與否對分析檢