楓香槲寄生抗腫瘤有效部位總皂苷的提取及含量測(cè)定研究

1、楓香槲寄生抗腫瘤有效部位總皂苷的提取及含量測(cè)定研究                               作者：楊燕軍，沙聰威，安潔，鄧永燕  【摘要】  目的探討楓香槲寄生抗腫瘤有效部位總皂苷的提取工藝條件及含量測(cè)定方法。方法采用正交實(shí)驗(yàn)法設(shè)計(jì)提取條件，以齊墩果

2、酸為對(duì)照品，用紫外分光光度法測(cè)定總皂苷的含量，優(yōu)化提取方案。結(jié)果回收率為 100.3% ，RSD1.54% 。各因素對(duì)總皂苷提取的影響程度依次為：乙醇濃度>提取次數(shù)>提取時(shí)間>乙醇倍量。結(jié)論提取的最佳工藝條件為5倍量60乙醇回流提取兩次，1.5 h/次 ，該方法穩(wěn)定，準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好。 【關(guān)鍵詞】  楓香槲寄生 紫外可見(jiàn)分光光度法 正交實(shí)驗(yàn) 總皂苷Abstract:ObjectiveTo establish the methods to extract and determine the antitumor saponins from Viscum liquidamb

3、aricolum Hayata.MethodsThe optimized condition for extraction was determined by orthogonal design. UV-Spectrophotometry was used for the determination. ResultsThe recovery ratio was 100.3%, RSD=1.54%. The order of factors to affect the total saponins extraction was ethanol concentration > solvent

4、 quality > extraction time > extraction times.ConclusionThe optimum extraction conditions are 5 times 60% ethanol reflux 2 times,1.5 hour per time. The methods are stable ,accurate and reliable.Key words:Viscum liquidambaricolum Hayata；  Ultraviolet-visible spectrophotometry；  Orthog

5、onal test;  Total saponins楓香槲寄生Viscum liquidambaricolum Hayata.系桑寄生科槲寄生屬植物，該屬植物主要分布于及南方的一些省區(qū)，寄生于楓香、油桐、柿樹(shù)或殼斗科等多種植物上。本植物草藥名“楓樹(shù)寄生”，有祛風(fēng)除濕、舒筋活絡(luò)之功效1。全株入藥，治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)疼痛、腰肌勞損,民間以寄生于楓香樹(shù)上為佳2。據(jù)報(bào)道楓香槲寄生中含有三萜3，黃酮苷4。我們的前期研究從楓香槲寄生中獲得2個(gè)色原酮化合物5、反式桂皮酸、齊墩果酸、白楊素、圣草酚以及新化合物楓香槲寄生苷 6、芫花素、-香樹(shù)脂醇乙酸酯、古柯二醇等7。其中三萜及三萜皂苷類化合物是抗腫瘤的有效

6、成分7，主要集中于正丁醇部位。目前萜類化合物研究為天然產(chǎn)物化學(xué)中最活躍的部分，從中發(fā)現(xiàn)了許多結(jié)構(gòu)復(fù)雜的新化合物，其中不少顯示多種生物活性 8?；诖?，為進(jìn)一步深入研究該植物的化學(xué)成分及生物活性，本研究采用正交實(shí)驗(yàn)法，對(duì)影響楓香槲寄生醇提正丁醇萃取部位總皂苷提取效果的諸因素進(jìn)行考察,選擇最佳提取條件，運(yùn)用比色法以齊墩果酸為對(duì)照品，對(duì)楓香槲寄生中正丁醇萃取部位總皂苷的含量進(jìn)行了測(cè)定。1  儀器與材料1.1  儀器日本島津UV-2201型紫外光譜儀測(cè)定；德國(guó)sartorius天平；恒溫水浴鍋(型號(hào)：HHS11-4S)。1.2  材料齊墩果酸對(duì)照品（由藥品生物制品檢定所提

7、供，批號(hào)709-200105，供含量測(cè)定用）；楓香槲寄生植物購(gòu)于廣州清平藥材市場(chǎng)并經(jīng)廣東藥學(xué)院羅集鵬教授鑒定為楓香槲寄生Viscum liquidambaricolum Hayata；乙醇，正丁醇，甲醇，香蘭素，濃硫酸均為分析純，水為去離子水。2  方法與結(jié)果2.1  對(duì)照品溶液的制備將齊墩果酸對(duì)照品干燥至恒重，精密稱取對(duì)照品15.0 mg，置10 ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，吸取1 ml置10 ml容量瓶中，加甲醇至刻度，配成濃度為1.5 mg/ml的對(duì)照品溶液，搖勻備用。2.2  齊墩果酸對(duì)照品的顯色方法精密吸取1 ml 濃度1.5 mg/ml 的對(duì)照品溶

8、液于小試管中，水浴揮干溶劑，依次加入新配制的8%香蘭素乙醇溶液0.5 ml，72%硫酸5 ml，搖勻，置90 水浴加熱10 min，立即取出，置冰水浴中冷卻15 min。顯色劑同法操作作為空白對(duì)照9。2.3  測(cè)定波長(zhǎng)的選擇取齊墩果酸供試品溶液于400700 nm內(nèi)掃描，在540 nm 處有最大吸收，確定540 nm為測(cè)定波長(zhǎng)，測(cè)得的結(jié)果以齊墩果酸為基準(zhǔn)總皂苷的含量。2.4  標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密吸取0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9,1.0 ml齊墩果酸對(duì)照品溶液于具塞試管中，水浴中揮干溶劑。按“2.2”顯色條件顯色。于540 nm測(cè)定吸光度值。得回歸方程：結(jié)果

9、表明，在60150 g 范圍內(nèi), 齊墩果酸顯色后的吸光度值（A）與加樣量（C）的線性關(guān)系良好?；貧w方程為A=5.859 9C+0.029 9，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3(N=6)。見(jiàn)圖1。2.5  穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密吸取齊墩果酸對(duì)照品溶液0.5 ml于具塞試管中，沸水浴上揮干溶劑。按顯色條件顯色。記時(shí)測(cè)定，每隔20 min 測(cè)定吸光度值，共測(cè)120 min。RSD=0.67%。結(jié)果表明齊墩果酸在120 min內(nèi)顯色穩(wěn)定。結(jié)果見(jiàn)表1。表1  穩(wěn)定性考察結(jié)果（略）2.6  精密度實(shí)驗(yàn)精密吸取齊墩果酸對(duì)照品溶液0.0，0.5，0.5，0.5，0.5，0.5，0.5 ml,于

10、具塞試管中，于沸水浴上揮干溶劑。按顯色條件顯色，冷卻至室溫后測(cè)定吸光度值。RSD0.65%，結(jié)果表明，精密度良好。2.7  供試品溶液的制備1         精密稱取2 g 藥材于250 ml 圓底燒瓶中，按正交實(shí)驗(yàn)表設(shè)計(jì)提取條件進(jìn)行提取，得到的提取液過(guò)濾后，于水浴上揮干溶劑，殘?jiān)运?，水溶液?0 ml 正丁醇萃取4次，合并正丁醇層，用循環(huán)水泵減壓蒸干溶劑，得到的殘?jiān)眉状既芙?，定容?0 ml 容量瓶中,所得溶液待測(cè)。精密吸取定容后各供試品溶液置具塞試管中，水浴揮干溶劑，按“2.2”項(xiàng)下操作方法顯

11、色供測(cè)試用，同時(shí)以隨行溶劑作空白，楓香槲寄生總皂苷百分含量。結(jié)果見(jiàn)表3。方差分析按方差分析理論得方差分析結(jié)果（見(jiàn)表4）。表4表明乙醇濃度有顯著性差異。乙醇用量、提取時(shí)間、提取次數(shù)無(wú)顯著性差異。最佳提取條件為A1B2C3D2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表34 。表3  正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果（略）表4  方差分析（略）2.8  重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一產(chǎn)地藥材6份按正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表第1號(hào)實(shí)驗(yàn)提取，按顯色條件顯色，測(cè)定吸光度。計(jì)算藥材中的總皂苷含量。重復(fù)進(jìn)行5次，RSD= 0.202%。結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。表5  重現(xiàn)性考察結(jié)果（略）2.9  回收率實(shí)驗(yàn)精密2.10

12、  樣品的含量測(cè)定按正交實(shí)驗(yàn)所得出的最佳提取條件分別進(jìn)行2004和2005年兩批次樣品（每批樣品測(cè)定3次）的總皂苷含量測(cè)定。按“2.2”項(xiàng)下操作方法顯色，在540 nm處測(cè)定吸光度。兩批總皂苷的平均含量分別為1.87，2.09%。3  討論在前期楓香槲寄生的研究中，分離鑒定到齊墩果酸，所以選用齊墩果酸為對(duì)照品，測(cè)定楓香槲寄生正丁醇部位中總皂苷的含量。在總皂苷測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，紫外掃描最大波長(zhǎng)在540 nm，樣品顯色的線性范圍在60150 g（r0.999 3）,顯色后100 min內(nèi)顯色穩(wěn)定，精密度實(shí)驗(yàn)的RSD0.202%，說(shuō)明了總皂苷含量測(cè)定采用紫外分光

13、光度法具有準(zhǔn)確，靈敏，穩(wěn)定的特點(diǎn)。在考察的各個(gè)因素中，A因素為乙醇濃度，B因素為乙醇用量，C因素為提取時(shí)間，D因素為提取次數(shù)。對(duì)得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，由極差R分析得知A因素即乙醇濃度對(duì)提取效果影響具有顯著性意義，因素C，D對(duì)結(jié)果也有一定影響，其影響因素依此為 A > D > C > B 。方差分析最佳提取方案為A1B2C3D2。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，采用醇回流提取法提取楓香槲寄生的總皂苷，醇提液揮干溶劑后水溶解，水溶液分別用石油醚，醋酸乙酯，正丁醇萃取，檢測(cè)到在正丁醇部位皂苷含量最高，且具有抗腫瘤細(xì)胞活性（該研究成果待發(fā)表），故實(shí)驗(yàn)中采用正丁醇萃取部位進(jìn)行含量測(cè)定研究，為今后的化

14、學(xué)成分及生物活性研究提出新的思路。對(duì)楓香槲寄生的正丁醇部位總皂苷含量的測(cè)定表明，總皂苷的含量較高，2005年采摘藥材的皂苷含量略高于2004年采摘藥材皂苷含量。表明楓香槲寄生正丁醇部位皂苷化合物的性質(zhì)較穩(wěn)定，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。【】  1院華南植物研究所.廣東植物志M.廣州：廣東科技出版社，1987:227. 2中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志M.北京:科學(xué)出版社，1988:156.3Chen CS, Chen SZ. Phytochemical studies on Viscum liquidambaricolumJ.Taiwan yaoxue Zazhi ,1973,25(1-2):55.4Liu KC, Lee SS. Flavanoid glucgsides isolated from Viscum liquidambaricolumJ.Zhonghua Yaoxue Zazhi,1993,45(3):231.5楊燕軍.楓香槲寄生化學(xué)成分的研究J