接觸系統(tǒng)生物學意義的再認識

1、    接觸系統(tǒng)生物學意義的再認識        摘要目前，凝血學說發(fā)生了概念性改變，認為體內(nèi)凝血過程分為兩個階段，組織因子途徑負責凝血過程的啟動，以因子(F)為起點的內(nèi)在途徑負責凝血過程的放大，而接觸系統(tǒng)并不參與體內(nèi)凝血過程。已有資料表明，接觸系統(tǒng)是一個重要的血管生物學調(diào)制系統(tǒng)。它的主要作用包括調(diào)整血管緊張度、抑制血小板活化、促進纖溶、抑制粘附以及促進炎癥等。它的改變與敗血癥、血栓性疾病等病變過程密切相關。關鍵詞接觸系統(tǒng);組織因子途徑;高分子量激肽原;前激肽釋放酶;因子學科

2、分類號R331.1;R554Revision ofthe Biological Significance of the Contact SystemLIU Fa-Yi,HE Shi-Lin(Department of Physiology,Hunan Medical University,Changsha 410078)AbstractCurrent concept of blood coagulation is divided into two stages:an “initiation” stage which is handled by tissue factor pathway,and

3、 an “augmentation” stage handled by intrinsic pathway beginning in factor .Recent studies have demonstrated that the contact system is a modulator for vascular biology with vascular tone regulation,anticoagulant,profibrinolytic,antiadhesive and proinflammatory functions.Changes of contact system are

4、 associated with sepsis,thrombosis,etc.Key wordsContact system;Tissue factor pathway;High molecular weight kininogen;Prekallikrein;Factor 一、問題提出接觸系統(tǒng)(contact system)是由高分子量激肽原(HK)、前激肽釋放酶(PK)和因子( F)組成。在體外條件下，該系統(tǒng)必需與外源性帶負電荷表面接觸才能激活，故稱接觸激活。若將玻璃試管的表面負電荷予以中和或覆蓋，則引起凝血時間顯著延長。并且在接觸系統(tǒng)F、PK和HK三者中的任何一個蛋白缺乏(缺陷)，均可使

5、激活的部分凝血活酶時間(APTT)和全血凝固時間(CT)明顯延長。接觸激活的最終產(chǎn)物是激活的因子，即因子a(Fa)的形成。因此經(jīng)典的瀑布學說認為接觸激活F是內(nèi)在凝血途徑的啟動環(huán)節(jié)。然而臨床與實驗材料表明，接觸系統(tǒng)三個蛋白缺乏(缺陷)在體內(nèi)并不引起出血表現(xiàn)；相反，這三個蛋白純合子缺乏患者存在血栓傾向。所以現(xiàn)在普遍認為接觸系統(tǒng)并不參與生理性止血的凝血過程。不僅如此，在病理條件下彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)的發(fā)生也與該系統(tǒng)沒有明顯相關。對于體內(nèi)凝血過程，目前盛行的是兩階段學說13，即啟動階段和放大階段。啟動階段是通過組織因子(tissue factor,TF)途徑(外在途徑)實現(xiàn)的，當血管受損時，暴露

6、的TF即因子（F）與血漿中的因子(F)相互作用，使后者激活成激活的因子(activated factor ，F(xiàn)a)，并形成Fa/TF復合物。此復合物激活因子(F)和因子(F)成Fa和Fa，導致凝血酶的生成，但由于血小板催化表面尚未形成，因子(F)和因子(F)沒有活化，不可能生成足量的凝血酶；特別是組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)對Fa與Fa/TF具有滅活作用，故在啟動階段只可能形成少量凝血酶。然后是放大階段，即啟動階段生成的少量凝血酶既活化血小板，形成磷脂催化表面；又活化F和F，使之發(fā)揮凝血輔因子的活性；同時少量凝血酶通過激活F，從

7、而通過內(nèi)在途徑促使足量凝血酶生成與纖維蛋白的形成。雖然接觸系統(tǒng)在生理止血過程中的意義趨向于否定，但這并不意味著該系統(tǒng)在體內(nèi)沒有重要意義。那么接觸系統(tǒng)究竟有何生物學意義呢？越來越多的事實表明，接觸系統(tǒng)對血管生物學特性具有重要調(diào)制作用。接觸系統(tǒng)蛋白在體內(nèi)主要與血管內(nèi)皮細胞、血小板、中性粒細胞和單核細胞發(fā)生反應，在體內(nèi)非但沒有激活接觸系統(tǒng)的帶負電荷表面，而且實際上它們的活化也不需要帶負電荷表面，而是裝配在這些細胞的細胞膜上。過去所謂由帶負電荷表面接觸激活，實際上是將體外試驗結(jié)論直接推論到體內(nèi)的結(jié)果，這是對接觸系統(tǒng)的一種“歷史誤會”，對于生理科學工作者來說，這也是應當引以為戒的一個教訓。從已有資料來看

8、，接觸系統(tǒng)三個蛋白主要與血壓調(diào)節(jié)、抗血小板活化、促纖溶、抗粘附與促炎癥等功能有關。二、接觸系統(tǒng)蛋白的裝配與激活4，5在體內(nèi)接觸系統(tǒng)三個蛋白發(fā)揮生物效應有賴于它們裝配在細胞表面。F的重鏈中有與表面結(jié)合部位。但在接觸系統(tǒng)中，HK是表面裝配的關鍵蛋白。HK由重鏈、含緩激肽(BK)肽段和輕鏈三部分組成。重鏈包括第13功能域，BK組成部分居于第4功能域，輕鏈包括第5、6二個功能域。第1功能域存在一個親和力較低的鈣結(jié)合部位，并對心房鈉利尿肽具有抑制活性。第2功能域有一個半胱氨酸蛋白酶抑制部位，主要抑制鈣賴酶(calpain)。第3功能域也有一個半胱氨酸蛋白酶抑制部位，它與第2功能域均能有效地抑制木瓜蛋白酶

9、(papain)與組織蛋白酶(cathepsin)L。第3功能域還含有一個重要的細胞結(jié)合部位。第4功能域的主體部分是BK，其N末端有-凝血酶抑制活性，其C末端有一細胞結(jié)合部位。第5功能域是HK與細胞結(jié)合的主要部位，也含有與人工表面結(jié)合部位。第6功能域是PK與F的結(jié)合部位。在HK與各種細胞結(jié)合過程中，Zn2+是絕對必需的。當HK結(jié)合于血小板、粒細胞或內(nèi)皮細胞時，其親和力介于752nmol/L。由于血漿中HK濃度是670nmol/L，故血管內(nèi)所有激肽原結(jié)合部位可能是飽和的。不同細胞表面激肽原結(jié)合位點的數(shù)量是不同的，血小板約1000位點細胞，粒細胞約50 000位點細胞，血管內(nèi)皮細胞約10 000

10、000位點細胞。由此可見，HK與血管內(nèi)皮細胞結(jié)合可能具有十分重要的生物學意義。細胞膜的HK結(jié)合位點可能是一類多蛋白復合物。對于HK與粒細胞的結(jié)合以及HK與經(jīng) ADP活化血小板的結(jié)合，纖維蛋白原是一個非競爭性抑制物。同樣，HK對纖維蛋白原與粒細胞和活化血小板的結(jié)合也有抑制作用。抗體抑制實驗表明，CD11b/CD18或與這一整合素連接在一起的復合蛋白可能是粒細胞的HK結(jié)合部位。利用親和層析方法發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞表面的 C1q受體(C1qR)能與HK 的第5功能域結(jié)合。F能阻斷HK與C1qR相結(jié)合的位點。新近實驗表明，HK可與血管內(nèi)皮細胞表面的尿激酶受體結(jié)合，進一步工作提示結(jié)合部位在尿激酶受體的第2

11、和第3功能域之內(nèi)6。也有報道血管內(nèi)皮細胞膜的細胞骨架蛋白(cytokeratin)能對HK 發(fā)生選擇性結(jié)合，這種結(jié)合是Zn2+依賴性的。進一步實驗證明，HK的第3和第5功能域都存在與細胞骨架蛋白結(jié)合的部位。HK結(jié)合于內(nèi)皮細胞與血小板具有重要意義。首先，這種結(jié)合可以避免血漿中蛋白酶特別是激肽釋放酶(Ka)對HK的水解。其次，結(jié)合在細胞膜表面的HK第6功能域可以作為PK與F的受體。盡管體外試驗表明，在PK與細胞膜表面HK結(jié)合后，PK可以通過Fa依賴性或非Fa依賴性機制而被激活。然而迄今為止，在體內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)誘導F自我激活的生理性帶負電荷表面。在體內(nèi)的PK激活主要是通過非Fa依賴性機制。晚近實驗證明，

12、細胞膜或基質(zhì)中的一種巰蛋白酶(thiolprotease)能夠?qū)K激活成為Ka7。與Fa相似，該酶也使PK的精371異亮372肽鍵裂開。由此轉(zhuǎn)變而成的Ka的重鏈具有與HK結(jié)合部位，輕鏈含絲氨酸蛋白酶活性中心(由組415、天冬464與絲559組成)。當PK與裝配在細胞膜表面HK結(jié)合后，巰蛋白酶活性增高，促使Ka生成。實驗還表明在細胞表面的PK激活的速率隨著HK濃度增大而增快。不僅如此，與HK呈結(jié)合狀態(tài)的Ka可以避免C1抑制物和2-巨球蛋白對它的滅活。Ka 一旦形成，它即酶解HK的賴362精363和精371絲372二個肽鍵，從而釋放一個九肽(RPPGFSPFR)，即緩激肽(BK)。釋出BK后的H

13、K稱為HKa。當HK變?yōu)镠Ka后，PK被激活的速率也隨之減慢。另一方面，由于BK能夠上調(diào)血管內(nèi)皮細胞膜HK結(jié)合位點的表達，故隨著BK增加，細胞膜HK結(jié)合位點增多，從而使較多HK免于Ka的裂解，BK生成隨之減少。關于F的激活，在Zn2+存在條件下，F(xiàn)與帶負電荷表面接觸導致構(gòu)象改變，這種活化稱為自身激活或固相激活。Ka通過酶解方式活化F，稱為液相激活。在體內(nèi)并無生理帶負電荷表面，因此F的激活通常發(fā)生在Ka形成之后8。Ka對F的作用首先是裂開精353纈354肽鍵，使單鏈F激活成為雙鏈的Fa(又稱Fa)。Fa分子量約80kD，它的重鏈與輕鏈之間通過一個雙硫鍵相連。重鏈存在表面結(jié)合部位，輕鏈存在絲氨酸蛋

14、白酶活性中心(由天冬442、組393、絲554組成)，故既有與帶負電荷表面結(jié)合的能力，又能有效地激活F，但激活PK與補體成分C1能力相對較弱。隨著Ka繼續(xù)作用于Fa，將精334天冬335與精343賴344兩處肽鍵裂開,釋出一個長的多肽(原重鏈的異亮1精334)和一個短肽(原重鏈的344精353),由此得到的保留催化中心的多肽稱為Fa(又稱Ff)。Fa仍具有PK與補體成分C1的能力，但喪失了與表面結(jié)合的特性。三、接觸系統(tǒng)對血管的調(diào)制作用接觸系統(tǒng)具有多方面功能，但集中到一點就是對血管發(fā)揮調(diào)制作用。（一)調(diào)節(jié)血管緊張度實驗發(fā)現(xiàn)，Ka過量表達的轉(zhuǎn)基因動物表現(xiàn)明顯低血壓，Ka結(jié)合蛋白(Kallikrei

15、n-binding protein，又稱Kallistatin)可使這種動物血壓正?；?對自發(fā)性高血壓大鼠進行組織Ka轉(zhuǎn)基因治療，可以有效地降低血壓；同樣，這一降壓效應也可被Ka結(jié)合蛋白所取消。Ka本身并無降壓作用。Ka這一作用是通過它作用于激肽原，生成BK而實現(xiàn)的，因為BK能強烈刺激血管內(nèi)皮細胞合成PGI2和NO，這兩種物質(zhì)均具有很強的舒血管作用。 以帶負電荷的硫酸右旋糖甙激活接觸系統(tǒng)，可以使動物產(chǎn)生低血壓，B2受體阻滯劑(HOE140)能阻斷低血壓反應，但B1受體阻滯劑并無此作用。由此可知BK降壓作用是通過B2受體介導的。一般認為由血漿中HK釋放的BK與全身血壓調(diào)節(jié)有關，由組織低分子量激

16、肽原(LK)釋放的BK主要與局部血流量調(diào)節(jié)有關。對正處于發(fā)育階段的大鼠較長期給予B2受體阻滯劑，結(jié)果這些動物血壓較高，心率較快，體重較重。因此BK可能是心血管活動的一個經(jīng)常性調(diào)節(jié)因素。BK的血管生物學作用是相當廣泛的。除上述調(diào)節(jié)血壓作用外，還可通過PGI2與NO釋放抑制血小板活化，通過組織型纖溶酶原激活劑(tPA)釋放促進纖溶，通過NO-cGMP途徑抑制血管平滑肌細胞增殖。 因此在血管內(nèi)皮完整條件下，BK有利于防止血栓形成與動脈粥樣硬化。BK在體內(nèi)的半存期僅15秒，它主要被血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE，又稱激肽酶)滅活，故在BK 生成減少或滅活增多的情況下，使用ACE抑制劑，通過減少BK滅活，可以

17、有利于保護心血管。 然而也應看到問題的另一方面，在血管內(nèi)皮完整性受到破壞時，BK直接作用血管平滑肌細胞，通過蛋白激酶C(PKC)和絲裂原激活蛋白酶(MAPK)途徑可導致血管平滑肌細胞增殖，這雖有利于血管壁修復，但也是促進動脈粥樣硬化的一個因素。因此，對血管內(nèi)皮廣泛嚴重受損患者使用ACE 抑制劑應持慎重態(tài)度。(二)抑制凝血酶對血小板的活化效應這一作用的機制涉及幾個環(huán)節(jié)。首先，HK抑制鈣賴酶。當-凝血酶激活血小板時，胞質(zhì)與/或膜內(nèi)的鈣賴酶轉(zhuǎn)位至活化的血小板表面。外露的鈣賴酶隨即水解血小板膜上活化的膜蛋白Ib(GPb)和ADP結(jié)合蛋白。GPb的水解與血小板的凝血酶受體活化有關。ADP結(jié)合蛋白的水解與

18、GPb/a活化有關，活化GPb/a 就是血小板膜形成纖維蛋白原受體的過程，這是血小板聚集發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)。HK通過第2功能域抑制鈣賴酶，可以抑制凝血酶誘導的血小板聚集。其次，HK抑制凝血酶與其受體結(jié)合9。已知血小板膜蛋白Ib、因子和因子的復合物(GPb-)與凝血酶受體有關。凝血酶作用于血小板的第一步是它與GPb結(jié)合。HK通過第3功能域抑制凝血酶與GPb結(jié)合，從而抑制凝血酶對血小板的活化作用。此外，HK 抑制凝血酶受體的活化。在凝血酶與GPb結(jié)合后，凝血酶隨即水解凝血酶受體精氨酸41后的肽鍵，從而引起受體變構(gòu)，然后通過G蛋白啟動磷酯酶C-三磷酸肌醇(PLC-IP3)途徑和抑制腺苷酸環(huán)化酶-cAMP

19、(AC-cAMP)途徑，使血小板活化。實驗證明HK第4功能域中的RPPGF結(jié)構(gòu)對凝血酶酰解它本身的受體具有抑制作用，因而可以抑制凝血酶對血小板的活化10。實際上，RPPGF五肽是BK前5個氨基酸組成的，在體內(nèi)其即為激肽酶水解BK的碎片。正常血漿中含有微量的RPPGF，故其可能是一種生理性抗血小板活化物質(zhì)。(三)促進纖溶接觸系統(tǒng)參與體內(nèi)纖溶過程的機制包括：（1）Ka與Fa均可直接激活纖溶酶原，但其作用遠弱于tPA與尿激酶型PA(uPA)；（2）HK與內(nèi)皮細胞尿激酶受體結(jié)合，通過促進Ka形成，而后Ka使單鏈uPA(scuPA)轉(zhuǎn)變成為雙鏈uPA(tcuPA)，后者促進纖溶酶原激活的活性遠較前者高；

20、（3）BK刺激血管內(nèi)皮細胞分泌tPA11，tPA促使纖溶酶原活化為纖溶酶。新近發(fā)現(xiàn)使用抗F的單克隆抗體可使纖溶活性明顯升高，提示F具有抑制纖溶的作用12，但其機制并未闡明。一般認為這可能與F活化，通過內(nèi)在途徑使凝血酶大量形成，在促使纖維蛋白形成的同時，凝血酶與內(nèi)皮細胞凝血酶調(diào)制素(TM)結(jié)合，既使蛋白C 活化，又使凝血酶活化纖溶抑制物(TAFI)得以激活的緣故。(四)抑制粘附5HK作為抗粘附蛋白，其主要依據(jù)包括：（1）不含 BK 的高分子量激肽原(HKa)能競爭性抑制其它粘附蛋白與帶負電荷表面結(jié)合；（2）HKa也能競爭性抑制其它粘附蛋白與細胞表面結(jié)合；（3）無論附于表面或存在溶液中的HK均可阻

21、止細胞與被蛋白覆蓋的表面結(jié)合。在人血漿與帶負電荷表面接觸后，可以發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原很快結(jié)合于表面上，但經(jīng)過若干分鐘后在這些表面再也測不到纖維蛋白原。實驗表明這是由于接觸激活促使HKa形成，進而在表面由HKa取代了纖維蛋白原所致。也有報道HK與/或HKa 還可取代中性粒細胞與血小板表面的纖維蛋白原。新近觀察到HKa不僅抑制血小板和單核細胞與細胞外基質(zhì)蛋白的結(jié)合，而且抑制血管內(nèi)皮細胞在覆蓋了纖維蛋白原與外連蛋白(VN)表面的擴展?？傊?，在生理條件下接觸系統(tǒng)在維持血液流體性和血管通暢性過程中起著重要作用。應當指出：在病理條件下，接觸系統(tǒng)活化具有促進炎癥發(fā)展的作用。其機制是復雜的。實驗表明，Ka與Fa是強

22、有力的趨化物質(zhì)，能引起中性粒細胞釋放活性氧和彈性蛋白酶。 有人發(fā)現(xiàn)Fa能刺激單核細胞表達白細胞介素-1和白細胞介素-6。然而，在接觸系統(tǒng)產(chǎn)物中促炎作用較強的還是BK，因為BK能使血管通透性明顯增高。四、接觸系統(tǒng)與疾病(一)遺傳性血管性水腫5接觸系統(tǒng)的主要血漿蛋白酶抑制物是C1抑制物與2-巨球蛋白，其中C1抑制物負責90的Fa與Ff和50的Ka的滅活。遺傳性血管性水腫是由于C1抑制物先天性缺陷，從而造成BK生成過量所致。(二)敗血癥臨床資料表明，革蘭氏陰性細菌感染所致敗血癥(尤其是伴有休克的患者) 接觸系統(tǒng)蛋白降低，相應的酶-抑制物復合物，如Ka-C1 Inh，Ka-a2M增高，并且這些改變與平

23、均動脈壓改變顯著相關。實驗證明，事先給予狒狒抗F的單克隆抗體，以阻斷接觸激活，然后由靜脈注入大腸桿菌，這些動物并不發(fā)生非可逆性低血壓，但仍然發(fā)生DIC13。 新近實驗表明，若事先給予激肽釋放酶特異性抑制物(PRSI)，動物在接受內(nèi)毒素注入后發(fā)生DIC，但可防止“成人呼吸窘迫綜合征”的發(fā)生；若事先給予組織因子途徑阻斷劑(DEGR-a) 則可防止DIC發(fā)生，但對“成人呼吸窘迫綜合征”的發(fā)生并無影響14。由此可見，敗血癥時接觸系統(tǒng)活化主要涉及休克和全身性炎癥反應綜合征的發(fā)生，而DIC 的發(fā)生主要與組織因子途徑啟動有關。本室觀察到內(nèi)毒素休克時血中TF大增，TFPI/TF比值顯著降低15。晚近資料表明，

24、大腸桿菌與傷寒桿菌的某些菌株存在纖維狀表面蛋白(fibrous surface proteins，簡稱Curli)。Curli除可與細胞外基質(zhì)蛋白(層素、纖聯(lián)素等)相互反應外，還能與接觸系統(tǒng)蛋白(F、PK、HK、F)和纖維蛋白原結(jié)合，但對其它凝血因子與抗凝蛋白并無結(jié)合能力。體外試驗發(fā)現(xiàn)純化的F與這些菌株結(jié)合后，隨之自動激活成為a。將F、PK和HK 與這些細菌混合，不僅引起F和PK活化與BK產(chǎn)生，而且導致a形成。若將這些細菌加入人血漿，BK將增加100倍以上，并產(chǎn)生纖維蛋白缺陷的凝塊。由靜脈注入這些細菌，引起血漿中BK顯著升高與纖維蛋白原耗竭，并伴隨血壓降低與凝血障礙。由此可見，革蘭氏陰性桿菌纖

25、維表面蛋白與接觸系統(tǒng)蛋白相互作用，在全身炎癥反應綜合征和敗血癥休克的發(fā)展中起著重要作用16，17。(三)心肺旁路在體外循環(huán)中，肝素化血液與人工表面廣泛接觸，引起接觸系統(tǒng)活化。 由于纖溶系統(tǒng)與補體系統(tǒng)活化，因此損傷局部常有滲血現(xiàn)象。抑肽酶不僅抑制Ka和纖溶酶，而且抑制中性粒細胞和血小板活化18，現(xiàn)已廣泛用于體外循環(huán)患者，并已收到良好的止血效果。本室觀察到抑肽酶通過抑制Ka，可以與肝素抗凝發(fā)生協(xié)同作用，使激活凝血時間(ACT)與APTT大為延長。在此條件下，若仍以ACT或APTT作為判斷肝素用量的指標，必然超過血中肝素實際濃度，所以，此時應采用全血或血漿凝血酶原時間作為監(jiān)測肝素的指標19。（四)非

26、感染性關節(jié)炎與小腸結(jié)腸炎5，20臨床與實驗資料表明在這些非感染性炎癥的發(fā)病學中，Ka-BK系統(tǒng)占有重要地位。無疑，對于這些患者給予Ka抑制劑或B2受體阻滯劑可能是有益的。（五)血栓性疾病5由于接觸系統(tǒng)抑制凝血酶誘導血小板活化和促進纖溶以及抗粘附等作用，故在生理情況下該系統(tǒng)具有抗血栓形成的作用。隨著F先天缺陷患者與HK先天缺陷患者均死于血栓性肺梗塞，其后陸續(xù)有人報道F、PK與HK缺陷患者出現(xiàn)血栓傾向。一般認為接觸系統(tǒng)蛋白缺陷導致血栓形成，主要是由于纖溶系統(tǒng)受到抑制所致。劉發(fā)益(湖南醫(yī)科大學生理學教研室，長沙 410078)賀石林(湖南醫(yī)科大學生理學教研室，長沙 410078)參考文獻1，Davi

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