dld00蛋白定量BCA法-最強(qiáng)試驗(yàn)protocol

1、蛋白定量ProteinQuantitation【蛋白定量的背景知識(shí)】“蛋白定量”即蛋白質(zhì)定量，蛋白質(zhì)定量根據(jù)其目的分為全蛋白質(zhì)的“總定量法”和特定蛋白質(zhì)的個(gè)別定量法”。蛋白定量是生物學(xué)實(shí)驗(yàn)不可缺少的一部分。為驗(yàn)證細(xì)胞裂解是否成功；2或?yàn)榱藢⒍鄠€(gè)樣品進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)比較或標(biāo)準(zhǔn)化保存， 需對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白定量；3為了判定蛋白的產(chǎn)量，需對(duì)純化好的蛋白進(jìn)行定量；4為了將純化好的蛋白用生物素或者報(bào)告酶進(jìn)行標(biāo)記，同樣需首先對(duì)蛋白樣品進(jìn)行定量，以保證標(biāo)記反應(yīng)在適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)濃度下進(jìn)行。蛋白定量分析涉及到生產(chǎn)科研的多個(gè)領(lǐng)域及行業(yè)，也是生物學(xué)科、食品檢驗(yàn)及打擊摻假摻偽、臨床檢驗(yàn)、診斷疾病和質(zhì)量檢驗(yàn)中最常見(jiàn)的方法。|

2、【蛋白定量的方法】蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其他生命學(xué)科常涉及的分析內(nèi)容。在生化實(shí)驗(yàn)中，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析，是一項(xiàng)經(jīng)常進(jìn)行的非常重要的工作。蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子，它的種類很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個(gè)理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法帶來(lái)了許多具體的因難?，F(xiàn)測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法有很多：根據(jù)物理性質(zhì)：紫外分光光度法；根據(jù)化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮服法、Folin-酚試劑法（Lowry法）、BCA法、膠體金法；3根據(jù)染色性質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法；4根據(jù)其他性質(zhì)：熒光法；蛋白定量的測(cè)試方法有很多種，其中較為常見(jiàn)的有五種，分別是Br

3、adford法、Bradford斑點(diǎn)試驗(yàn)、Coomassie斑點(diǎn)試驗(yàn)、紫外分光度檢測(cè)法及BCA法這五種。當(dāng)然，每種方法適用的情況都有所不同。實(shí)驗(yàn)最常用的蛋白定量方法為BCA法和Bradford法（也就是考馬斯染色法）BCABCA 蛋白定量和 BradfordBradford 法蛋白定量的區(qū)別|(1)Bradford法測(cè)得的主要是堿性氨基酸和芳香族氨基酸，BCA則沒(méi)有選擇性；該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)定量是相當(dāng)精確的，特別是用于小分子多肽定量，如核糖核酸酶或溶菌酶等。但是，去污劑(裂解液)的濃度超過(guò)0.2%則影響定量結(jié)果。如TritonX-100,SDS,NP-40等。(2) BCA法 蛋 白 濃

4、度 定 量 是Cu2+ 在 堿 性 的 條 件 下 ， 可 以 被 蛋 白 質(zhì) 還 原 成Cu+(BiuretReaction),Cu+和獨(dú)特的BCASolutionA(含有BCA)相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。兩分子的BCA螯合一個(gè)Cu+,形成紫色的反應(yīng)復(fù)合物。該水溶性的復(fù)合物在562nm處顯示強(qiáng)烈的吸光性，吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，因此根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。Bradford法蛋白定量是染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后引起染料最大吸收波峰的改變，從465nm變?yōu)?95nm,光吸收增加。蛋白質(zhì)染料復(fù)合物具有高的消光系數(shù)，因此大大提高了蛋白質(zhì)測(cè)定的靈敏度，最低檢出量為1口蛋白。染料與

5、蛋白質(zhì)的結(jié)合是很迅速的過(guò)程，大約需2min,結(jié)合物的顏色在1h內(nèi)是穩(wěn)定的。一些陽(yáng)離子，如K+,Na+,Mg2+,(NH4)2SO4,乙醇等物質(zhì)不干擾測(cè)定，而大量的去污劑如TritonX100,SDS等嚴(yán)重干擾測(cè)定，少量的去污劑可通過(guò)用適當(dāng)?shù)膶?duì)照而消除。由于染色法簡(jiǎn)單迅速，干擾物質(zhì)少，靈敏度高，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定?！緝?nèi)參(基因/蛋白)的背景知識(shí)】WesternBlot實(shí)驗(yàn)常用于檢測(cè)蛋白表達(dá)量、蛋白表達(dá)產(chǎn)物的正確性等。相對(duì)于其他檢測(cè)蛋白的方法而言WesternBlot實(shí)驗(yàn)在蛋白的定性定量分析、 與“目的蛋白”量的比較方面更簡(jiǎn)單一些。在定量分析時(shí)，為排除各樣本蛋白總量不同的干擾，WB的每

6、個(gè)樣本的“上樣量”(并不僅僅指上樣量的體積)即對(duì)應(yīng)泳道的蛋白總量應(yīng)該均一。因此需提前對(duì)各蛋白樣本進(jìn)行定量，使得各樣本的蛋白濃度一致，如此WB時(shí),當(dāng)每泳道上樣體積一致時(shí)，則對(duì)應(yīng)的蛋白總量也一致。作為Control,應(yīng)選擇能在各個(gè)細(xì)胞都能穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因(常見(jiàn)的內(nèi)參基因有&Actin,GAPDH等，具體需參考文獻(xiàn))，如WB的結(jié)果顯示內(nèi)參基因一致，則表明本次實(shí)驗(yàn)各泳道的蛋白總量一致，實(shí)驗(yàn)也就具備了分析的前提和基礎(chǔ)。內(nèi)參即是內(nèi)部參照( (InternalControl),對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來(lái)說(shuō)一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白( (HousekeepingProteins),它們?cè)诟鹘M織和細(xì)

7、胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物。在WesternBlotting實(shí)驗(yàn)中，除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外，還需要進(jìn)行內(nèi)參的檢測(cè)，以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過(guò)程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。雖然，順利的時(shí)候WesternBlot做起來(lái)很簡(jiǎn)單，可不順的時(shí)候也很令人心煩一一做不出結(jié)果、假陽(yáng)性、結(jié)果出現(xiàn)多條帶、到底是一抗有問(wèn)題還是二抗有問(wèn)題畢竟，作為一種有活性的生物大分子，抗體和抗原的反應(yīng)不像“1+1”那么明確，而用這種不確定的試劑來(lái)測(cè)定同樣知之甚少的表達(dá)產(chǎn)物，確實(shí)是有一定的不確定性。所以，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腤estern

8、Blot實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中要求有良好的參照體系，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析非常有用。特別是當(dāng)實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)，借助參照體系很容易就可以查出問(wèn)題所在，而不必抓耳撓腮，怨天尤人。良好的參照體系通常包括分子量Marker(用來(lái)確定蛋白條帶對(duì)應(yīng)的分子量大小卜空白載體對(duì)照(如果是誘導(dǎo)表達(dá)體系還應(yīng)該有誘導(dǎo)前的對(duì)照卜已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對(duì)照，另外還有內(nèi)參。可是由于經(jīng)費(fèi)限制或者偷懶的原因，國(guó)內(nèi)的不少人做WesternBlot往往省略參照，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)問(wèn)題時(shí)無(wú)法分析結(jié)果，即便有結(jié)果也可能影響結(jié)果的分析。實(shí)際上內(nèi)參是最容易被忽略的一項(xiàng)。我們知道，要用WesternBlot比較不同條件下或者不同組織中，目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少，前提條件

9、是等量的細(xì)胞上樣，才有比較的基礎(chǔ)，特別表達(dá)量不高時(shí)，上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析，所以需要內(nèi)參。在國(guó)外發(fā)表的文章中，WesternBlotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果須進(jìn)行內(nèi)參校正已成為一種慣例。但是，國(guó)內(nèi)仍有不少科研人員在WesternBlotting實(shí)驗(yàn)中忽略了內(nèi)參的使用，將蛋白濃度測(cè)定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯一方法。然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法，都存在局限性，不能完全準(zhǔn)確的確定各種樣品的蛋白濃度。如UV法直接定量，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)，相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō)，操作簡(jiǎn)單，但是容易受到平行物質(zhì)如DNA的干擾，且敏感度低，要求蛋白的濃度較高。比色法測(cè)定蛋白濃度一般有BCA

10、、Bradford、Lowry等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford法敏感度最高，且與一系列干擾Lowry、BCA反應(yīng)的還原劑(如DTT,疏基乙醇)相容，但是對(duì)去污劑依然是敏感的，其最主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無(wú)可比性。另外，蛋白質(zhì)定量以后進(jìn)行電泳時(shí)需要等量上樣，此步驟也存在操作誤差。在Westernblotting實(shí)驗(yàn)時(shí)使用內(nèi)參，即可簡(jiǎn)便地對(duì)定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進(jìn)行校正。在WesternBlot中使用內(nèi)參其實(shí)就是在WB過(guò)程中另外用內(nèi)參對(duì)應(yīng)的抗體檢測(cè)內(nèi)參，這樣在檢測(cè)目的產(chǎn)物的同時(shí)可以檢測(cè)內(nèi)參的表達(dá)，由于內(nèi)參在各組

11、織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，借助檢測(cè)每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差，這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完全、整個(gè)WesternBlot顯色或者發(fā)光體系是否正常。在 WesternBlottingWesternBlotting 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用內(nèi)參的方法通常有以下三種：(1)第一種是超級(jí)簡(jiǎn)便的標(biāo)記內(nèi)參使用法，只要在二抗孵育時(shí)加入HRP標(biāo)記內(nèi)參抗體，按照正常操作即可；(2)第二種是普通內(nèi)參，當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量相差不大時(shí)，可以先進(jìn)行目的蛋白的抗體溫育顯色和檢測(cè)， 然后使用Strip緩沖液洗掉膜上的抗體， 重新進(jìn)行內(nèi)參蛋白的抗體

12、溫育、顯色檢測(cè)。(3)第三種(最常用)，當(dāng)目的蛋白的分子量大小與選用的內(nèi)參蛋白分子量大小相差比較明顯情況下，可以在轉(zhuǎn)膜后預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì)Marker的大小將膜剪為大分子量和小分子量?jī)刹糠?，使?nèi)參蛋白與目的蛋白分開(kāi)，然后兩塊膜分別與內(nèi)參蛋白抗體以及目的蛋白抗體進(jìn)行孵育，二抗孵育以及顯色。常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulino一般我們選擇內(nèi)參與要檢測(cè)的目的蛋白的分子量最好相差10kDa以上。因此你要知道你檢測(cè)的蛋白的分子量來(lái)選擇合適的內(nèi)參?！?

13、amp;ActinActin、GAPDHGAPDH、TubulinTubulin 的具體應(yīng)用】actin即肌動(dòng)蛋白，是細(xì)胞的一種重要骨架蛋白。Actin大致可分為六種，其中四種是不同肌肉組織特異性的，包括alpha-skeletalmuscleactin、alpha-cardiacmuscleactin、alpha-smoothmuscleactin和gamma-smoothmuscleactin,其余兩種廣泛分布于各種組織中，包括beta-actin(&non-muscle)和gamma-non-muscleactin。這些不同的亞型組織分布是不一樣的，在肌肉組織中的beta-act

14、in分布就很少，心肌主要是alpha-cardiacmuscleactin。因此不同的組織本來(lái)就應(yīng)該選擇不同的內(nèi)參，不能一概而論的。Beta-actin作為內(nèi)參是得到了公認(rèn)的，這是針對(duì)大多數(shù)組織和細(xì)胞來(lái)說(shuō)的，它廣泛分布于細(xì)胞漿內(nèi)，表達(dá)量非常豐富。盡管最近有一些文章已經(jīng)開(kāi)始質(zhì)疑beta-actin作為內(nèi)參的有效性(疑似對(duì)于上樣量20的的蛋白區(qū)分能力下降)，但是發(fā)文章應(yīng)該還是沒(méi)有問(wèn)題的。至于其他的內(nèi)參也是可以考慮用的，GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)是參與糖酵解的一種關(guān)鍵酶，而tubulin和actin類似，是細(xì)胞骨架的組成部分，但不是肌肉的主要成分，應(yīng)該是一個(gè)代替品。上述三種內(nèi)參同時(shí)發(fā)生變化

15、的情況很少，需要具體分析。一旦出現(xiàn)上述三種內(nèi)參同時(shí)發(fā)生變化，如果是總蛋白可以用胞核的內(nèi)參如PCNA,TATA-boxbindingprotein(TBP)甚至線粒體的內(nèi)參來(lái)代替，當(dāng)然一般這種可能性出現(xiàn)的幾率微乎其微。不同異構(gòu)體表達(dá)對(duì)蛋白的檢測(cè)是有很大的影響，買抗體前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗體雜不出條帶其實(shí)未必是抗體質(zhì)量的問(wèn)題。很多公司的內(nèi)參抗體是用抗原片段制備的， 不同的公司選擇的片段不一樣。 以最常用的beta-actin為例，有的公司選擇N-端，有的選擇C-端。選用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-G

16、ly-Lys16aa作為抗原制備抗體(單抗和多抗)的占大多數(shù)，主要有SantaCruz(Cat#sc-69879),sigma(Cat#A197等)，ProSci(Cat#3779),CellSignaling(Cat#4967),AxxoraPLATFORM(BET-A300)等，這類抗體均不能檢測(cè)心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用C-端16aa短肽作為抗原制備抗體的主要有AxxoraPLATFORM(PSC-3777),EPITOMICS(1784-1,1854-1等)， 這類抗體可以在肌肉細(xì)胞中檢測(cè)到actin陽(yáng)性信號(hào)。有時(shí)候在實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)內(nèi)參時(shí)產(chǎn)生組織特異性”，就是由于抗體選擇不對(duì)造成

17、的。actin幾種異構(gòu)體存在組織分布特異性，不同型actin之間具有較高的序列相似性(90%)。&actin是分布于非肌細(xì)胞中的一種骨架蛋白，選擇作lactin內(nèi)參時(shí)首先得保證是組織廣泛表達(dá)的(尤其是做蛋白的組織表達(dá)譜時(shí))。那么制備(-actin抗體的抗原應(yīng)該是選用與actin其它異構(gòu)體一致的氨基酸序列。公司制備抗體是選用lactin的某一段小短肽作為免疫原，可能會(huì)因?yàn)檫x取的短肽在不同型actin之間保守與否，而導(dǎo)致所制備抗體具有一定的組織特異性.如選取的短肽僅在beta型存在，所得抗體就僅能檢測(cè)非肌細(xì)胞中的actin,而選取的短肽在六型中均存在，則此抗體除非肌細(xì)胞外，還可以檢測(cè)car

18、diac,skeletal,smoothmuscle細(xì)胞的actin。WesternBlot實(shí)驗(yàn)中選擇內(nèi)參作為參照體系對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析具有很好的說(shuō)明性。內(nèi)參的選擇往往使用一些常見(jiàn)的持家基因（管家基因），常用蛋白內(nèi)參有GAPDH、beta-actin等。WesternBlot實(shí)驗(yàn)中內(nèi)參的選擇及其使用方法都會(huì)直接影響對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。【BCABCA 法蛋白定量的原理】Cu2+在堿性的條件下，可以被蛋白質(zhì)還原成Cu+,Cu+和獨(dú)特的BCASolutionA（含有BCA）相互作用產(chǎn)生敏感的顏色反應(yīng)。從原來(lái)的蘋(píng)果綠色螯合成紫藍(lán)色的復(fù)合物。在562nm處顯示強(qiáng)烈的吸光性， 且吸光度和蛋白濃度在廣泛范圍內(nèi)

19、有良好的線性關(guān)系，因此根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度。BCABCA 法蛋白定量的工作范圍BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的范圍是20醫(yī)g/m1200醫(yī)g/ml【碧云天 BCABCA 試劑盒特點(diǎn)簡(jiǎn)介】碧云天BCA試劑盒官方說(shuō)明http:/ 37c37c 生化培養(yǎng)箱；一般推薦每天上午裂解細(xì)胞，收取蛋白樣品，下午立刻行BCA法進(jìn)行蛋白定量實(shí)驗(yàn)，如此可以防止蛋白降解；如果裂解細(xì)胞第二天開(kāi)始進(jìn)行蛋白定量實(shí)驗(yàn)，則務(wù)必檢查是否有足夠的冰；02.待檢測(cè)的蛋白樣品插置冰上且保存在 4c4c 冰箱待用；03.檢查預(yù)先配制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品是否夠用，如果不足，則重新配制；蛋白標(biāo)準(zhǔn)品在BCA試劑盒（碧云天）內(nèi)，由廠家提前配制好貯存溶液

20、，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定；具體步驟為：完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10口稀釋至100口使終濃度為0.5mg/ml。一般而言，蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，也可以用0.9%NaCl溶液或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。 稀釋后的0.5mg/ml蛋白標(biāo)準(zhǔn)可以放置在-20C長(zhǎng)期保存。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案，標(biāo)記相應(yīng)的 EPEP 管；由于BCA法需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，故即便樣本量不大，也需要較多的EP管；如樣本量較大，以及需要雙梯度稀釋蛋白樣本時(shí)，則需要大量的EP管，因此需提前標(biāo)記好待用；一般標(biāo)準(zhǔn)曲線8個(gè)；樣本則需標(biāo)記3套EP管，20倍稀釋（1口樣品），10倍稀釋（2L樣品），最終的調(diào)平蛋白濃度（高濃度蛋白

21、樣品補(bǔ)齊之后）；加上此前裂解細(xì)胞提取蛋白所需的EP管（通常是一天之內(nèi)進(jìn)行），因此需要4套EP管；為實(shí)驗(yàn)方便，用于配制梯度稀釋的蛋白樣品的EP管的標(biāo)記，可以使用簡(jiǎn)寫(xiě)，但操作時(shí)需嚴(yán)格得從始至終一一對(duì)應(yīng)；05.估算擬加 BCABCA 工作液檢測(cè)的孔數(shù)；標(biāo)準(zhǔn)曲線 1616 孔，蛋白樣品每個(gè)樣本 2 2 個(gè)副孔，共 3 3 個(gè)孔；考慮到 BCABCA 工作液的價(jià)格，一般預(yù)留 10%10%配制;04.01248121620 蛋白標(biāo)準(zhǔn)液體積標(biāo)準(zhǔn)曲線10 倍稀釋2HL士呈口件口口20 倍稀釋1pL樣品06.將上述實(shí)驗(yàn)方案簡(jiǎn)單繪制于檢測(cè)使用的 9696 孔板上，放在冰上孵育待用；蛋白極易降解，因此實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，除

22、需佩戴口罩外，全程皆應(yīng)在冰上進(jìn)行；有條件時(shí)，盛放蛋白樣品的EP管，96孔板要進(jìn)行提前預(yù)冷；07.開(kāi)始配制標(biāo)準(zhǔn)曲線（蛋白標(biāo)準(zhǔn)品線性稀釋液）以及樣品孔的上樣溶液”；按照匯總配制的原則，標(biāo)準(zhǔn)曲線按 2.52.5 孔體積配制，樣品孔按3.53.5 孔體積配制；配好后，插冰待用；（1）蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線梯度樣品的配制將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20醫(yī)加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，力口標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20醫(yī) 相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/ml;蛋白標(biāo)準(zhǔn)品體積（dD01248121620對(duì)應(yīng)蛋白濃度（mg/ml）00.0250.050.10

23、.實(shí)際按照2.5個(gè)孔匯總配制；單塊96孔板（1根標(biāo)準(zhǔn)曲線）（2.5well）蛋白標(biāo)準(zhǔn)品體積（醫(yī)。01248121620應(yīng)加蛋白標(biāo)準(zhǔn)品體積（醫(yī)L）02.551020304050應(yīng)補(bǔ)充蛋白稀釋液體積（醫(yī)L）5047.545403020100兩塊96孔板（2根標(biāo)準(zhǔn)曲線）（Swell）（樣本量較大時(shí)）蛋白標(biāo)準(zhǔn)品體積（01248121620P13應(yīng)加蛋白標(biāo)準(zhǔn)品體積（醫(yī)L）051020406080100應(yīng)補(bǔ)充蛋白稀釋液體積（醫(yī)L）1009590806040200上述為理想情況；一般實(shí)驗(yàn)時(shí)，蛋白樣本量不會(huì)太大，同時(shí)制作兩根標(biāo)準(zhǔn)曲線也費(fèi)時(shí)費(fèi)力，一般制作一根即可；如一定要制作兩根標(biāo)準(zhǔn)曲線，則

24、檢測(cè)時(shí)，一塊96孔板應(yīng)將全部樣品上樣（比如都上20倍稀釋的樣），如此才可以根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量（樣品太多跨兩塊96孔板的話，則涉及到使用哪一根標(biāo)準(zhǔn)曲線的問(wèn)題）；（2）待檢測(cè)蛋白樣品的配制稀釋20倍（樣品1L）匯總配方：3.5Lsample+66.5LPBS稀釋10倍（樣品2L）匯總配方：7dLsample+6dLPBS稀釋的目的是因?yàn)锽CA法測(cè)定蛋白濃度有工作范圍”；一般而言，裂解所得的蛋白樣品濃度過(guò)高，需進(jìn)行稀釋方能檢出；常見(jiàn)的稀釋倍數(shù)為10倍,即2dL樣品+18醫(yī)LPBS;但個(gè)別情況濃度還較高，為免重復(fù)實(shí)驗(yàn)，一般還平行補(bǔ)充一組20倍稀釋的樣本；08.根據(jù)步驟 0505 估算的總孔數(shù)配制

25、BCABCA 工作液；一般以 A A 液體積為準(zhǔn)，忽略 B B 液體積；A A 液:B B 液=50:1;=50:1;BCA工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配，一般在樣本加入96孔前配制即可；09.將步驟 0707 所配置的各土樣蛋白溶液，按每孔 2020pLpL 的體積加入到對(duì)應(yīng)孔中；96孔板在實(shí)驗(yàn)時(shí)容易看錯(cuò)，操作時(shí)應(yīng)嚴(yán)格“唱名”，一一對(duì)應(yīng)；同一樣品同一梯度可不換Tip頭，但吸取不同的土樣蛋白溶液”時(shí)則需及時(shí)更換Tip頭；止匕外，當(dāng)移液槍殘留液體較多時(shí)，則每加完一上樣孔，需更換Tip頭；先加20口的土樣蛋白溶液”再加200口的BCA工作液看似違背加液體的原則（只能小體積加入大體積），但采取此辦法，一則加樣品時(shí)

26、不需要每孔都要換Tip頭，二則節(jié)約更換Tip頭的時(shí)間，可以使得各孔內(nèi)BCA反應(yīng)更均一；操作時(shí)，96孔板應(yīng)始終置于冰上；10.每檢測(cè)孔加入 200pLBCAI200pLBCAI 作液;加BCA工作液前，打勻勿忘記；11.將待檢測(cè) 9696 孔板放入 37c37c 生化培養(yǎng)箱內(nèi)，孵育 3030min;min;也可以室溫放置2小時(shí)，或60c放置30分鐘；如忘記打開(kāi)生化培養(yǎng)箱,則放入60c烘箱內(nèi)；BCA法測(cè)定蛋白濃度時(shí)，顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷加深。并且顯色反應(yīng)會(huì)因溫度升高而加快。如果濃度較低，適合在較高溫度孵育，或適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間；12.將待檢測(cè) 9 96 6 孔板放入酶標(biāo)儀內(nèi),如實(shí)驗(yàn)室的酶標(biāo)儀非全

27、波長(zhǎng)而又沒(méi)有540-595nm之間的其他波長(zhǎng)的濾光片進(jìn)行檢測(cè);蛋白定量（蛋白總量配平）的數(shù)據(jù)處理本次實(shí)驗(yàn)酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果如下所示:程序：Demo219.12.201611.50.00標(biāo)準(zhǔn)曲線區(qū)域板格式-96孔2。倍稀釋區(qū)域吸光率漉鏡1：完 2納米10 倍稀釋區(qū)域1不34567S9101112A0.1310.1340.1410,】590.190.2070.2250.2470.1470.1480.1560.16B0.1280.134。13901560.1880.2010.222Q.2430.1460.0590.1540.044C0.1350.134013201360.1320.1290.1310.1

28、31013401430.1390.142D0.1350.135013401320.1320.1360.1301301310.140.13S0.142E0.1350.13201320.1340.1320.130.1310.1310.13201390.1410.1-HF0.1420.1430.1410.1320,1390.1380.1320.1470.1380.1530.1510.154G0.1420140.1401380.140.1360.1390.1390.13801520.1560.153H0.1450.143014301420.1+40.140.M0.1420.142015701570.1

29、5601.數(shù)據(jù)區(qū)域劃分待用，并審核是否有異常數(shù)據(jù);562nm562nm 波長(zhǎng)處測(cè)定 ODOD 值；562nm波長(zhǎng)的濾光片，則選取標(biāo)涯曲線OD值0.1510.1340.1410.1590.190.2070.2250.2470.12B0.H40.1390.1560.1380.2010.2220.243標(biāo)準(zhǔn)曲線OD均值0.12950.1340.140.15750.1890.2040.22350.245如R2值0.99,則本次實(shí)驗(yàn)可信；如R2值V0.99,則根據(jù)情況，剔除不可信值或重復(fù)實(shí)驗(yàn)；標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的制作|選定數(shù)據(jù)后，“插入”菜單欄里選擇“散點(diǎn)圖”，再選擇僅帶數(shù)據(jù)標(biāo)記的散點(diǎn)圖;選定上圖中的“數(shù)據(jù)點(diǎn)

30、”后，右鍵選擇“添加趨勢(shì)線”國(guó)H叼.0E福爵里表格SEJ表格BCA-2016112116無(wú)血清譏限L匚M返北賽峭證白Ft&sl取看5油敝二圉特西站亙制圖表rfEjffi住造困谷虧方俏FTig-ml)比砥物藪瓦cone.泳HE帶省國(guó)二MHC.（收時(shí)睛值不以X軸為度序,atMi示獨(dú)立的的刖可慎用該圖.苴31布局公式近施畝間唄溝Acrobar形狀SmarlArt號(hào)苜做圉柱F溷折短期語(yǔ)圖條形能Ac1238 值concr(40.12950501340025G0.140.0570.15750.1艮0.1850290.2040.3ID0.22350.4110.2J50.51213141516B3理粒

31、(Eanc.(rne/ml)單欄中選擇“線性”,同時(shí)下方的“顯示公式”和“顯示R平方值”兩個(gè)02.計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程待用;OD值cone,(mgml)0.129500.1340.0250.140.050.15750,10.1890.20.2040.30.2454545SOSO+ +;在彈出來(lái)的菜選項(xiàng)框也一并勾選;03.計(jì)算出樣本的 ODOD 平均值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線分析評(píng)估；1計(jì)算樣本OD均值之前，要對(duì)相關(guān)孔的OD值進(jìn)行初篩，如出現(xiàn)數(shù)值明顯異常的，需提前排除；2樣本OD值一般無(wú)特殊情況，數(shù)值不會(huì)相差懸殊；OD值需在標(biāo)準(zhǔn)曲線的區(qū)間之間，即不得低于最低值（樣本蛋白質(zhì)濃度太低），高于最高值（樣本蛋白質(zhì)濃

32、度太高，稀釋不夠）；3如進(jìn)行了雙梯度稀釋，選擇的標(biāo)準(zhǔn)在于，何者更接近標(biāo)準(zhǔn)曲線的中間段；1匹稀釋2。倍0.1350.13404320.1360.1320.1290.1310.1310.134 0,1430.1390,142OD值0J35043504340,1320.1320.B60.130,130.1310.140.1380.1420.135OJ320.1320.1340.1320,130.1310.1310,132 0.1390,1410.141IpLOD均值0.1350.1340.1330.1340,1320.1320310.1310.1320.1410.1390.142標(biāo)準(zhǔn)曲線OD均值范圍

33、0.1295-02452ML稀釋2。倍0.1420.1430.1410.13204390.13804320.1470.138 0.1530.1510.154OD值0.143S0.140.1360.1390.1390.138 0.1520.1560.1530.1450.1430J430,14204420,142 0,1570,1570.1562HL0口均值0.1430.1420.1410.1370.1410.1380.1370.1430.139 0.1540.155Q.1S4出字fist更審息到任就能型m.選解莊正；.彳H3niIIliB0t5!如$45;和蔚3,1)tone*(mg/ml)的兇.S至1.10五正)_招除必生波以年舊5式圖04.確定使用某一稀釋梯度的數(shù)值后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得出各樣品的蛋白濃度；本實(shí)驗(yàn)采納稀釋10倍（2L樣品）的數(shù)值；05.確定基準(zhǔn)（最小值）濃度，根