紫外分光光度計測蛋白質(zhì)含量

1、紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量1 儀器與試劑TU-1901紫外-可見分光光度計，比色管，吸量管標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：5.00 mg.mL-1溶液0.9% NaCl溶液，待測蛋白質(zhì)溶液2 試驗方法與原理 本試驗接受紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。紫外-可見吸取光譜法又稱紫外-可見分光光度法,它是爭辯分子吸取190nm750nm波長范圍內(nèi)的吸取光譜，是以溶液中物質(zhì)分子對光的選擇性吸取為基礎(chǔ)而建立起來的一類分析方法。紫外-可見吸取光譜的產(chǎn)生是由于分子的外層價電子躍遷的結(jié)果，其吸取光譜為分子光譜，是帶光譜。蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸取紫外光的性質(zhì)，其最大吸取峰位于280nm

2、四周（不同的蛋白質(zhì)吸取波長略有差別）。在最大吸取波特長，吸光度與蛋白質(zhì)溶液的濃度的關(guān)系聽從朗伯-比耳定律。該測定法具有簡潔靈敏快速高選擇性，且穩(wěn)定性好，干擾易消退不消耗樣品，低濃度的鹽類不干擾測定等優(yōu)點(diǎn)。3 試驗步驟3.1 預(yù)備工作3.3.1啟動計算機(jī)，打開主機(jī)電源開關(guān)，啟動工作站并初始化儀器。 3.3.2 在工作界面上選擇測量項目（光譜掃描，光度測量），本試驗選擇光度測量，設(shè)置測量條件（測量波長等）。 3.3.3 將空白放入測量池中，點(diǎn)擊START掃描空白，點(diǎn)擊ZERO校零。3.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。 3.2 測量工作 3.2.1吸取曲線的繪制 用吸量管吸取2mL5.00mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白

3、質(zhì)溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液為參比，在190 nm400nm區(qū)間，q全波段掃描。 3.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 用吸量管分別吸取0.5、1.0 、1.5、 2.0 、2.5mL 5.00 mg.mL-1標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1 cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在280 nm處分別測定各標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A278記錄所得讀數(shù)。 3.2.3樣品測定 取適量濃度的待測蛋白質(zhì)溶液3mL，按上述方法測定278 nm處的吸光度。平行測定三份。4 試驗結(jié)

4、果記錄4.1 吸取曲線依據(jù)全波段掃描結(jié)果，已知蛋白質(zhì)的最大吸取峰位于280nm左右。（max=278nm）4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度C(mg/mL)吸光度A0.250.1750.500.3380.750.5381.000.6981.250.892繪制的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖所示。4.3 測定結(jié)果依據(jù)兩次平行測定的結(jié)果，得出未知蛋白溶液吸光度、依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出的蛋白溶液含量如下表所示。平行測定次數(shù)樣品液吸光度A樣品溶液濃度C(mg/mL)10.36440.51820.36600.520所測溶液平均濃度: C=0.519(mg/mL

5、) 5 試驗爭辯本次試驗接受的蛋白溶液為牛血清蛋白。蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，所以蛋白質(zhì)溶液在 275280 nm 處具有一個吸取紫外吸取高峰。在肯定濃度范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)溶液在最大吸取波特長的吸光度與其濃度成正比，符合朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。由于不同蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸的含量不同，所處的微環(huán)境也不同，所以不同蛋白質(zhì)溶液在 280 nm 的光吸取值不同。據(jù)初步統(tǒng)計，濃度為 1.0 mg/mL 的 1800 種蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)亞基在280 nm的吸光度在 0.33.0 之間，平均值為1.25±0.51。1上圖為文獻(xiàn)1中以0.9%NaCl溶液為參比液，將濃度為0

6、.3mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，進(jìn)行波長掃描測量，得到吸取曲線。從吸取曲線可得 0.3 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的最大吸取波長為279 nm，此波長下的吸光度為 0.167。依據(jù)文獻(xiàn)顯示，儀器誤差、不適當(dāng)?shù)男?zhǔn)曲線、測量中不符合朗伯比爾定律的光學(xué)、化學(xué)因素、顯色反應(yīng)條件、共存離子干擾以及儀器測試條件等都是影響分光光度計精確性的因素。2最讓我印象深的便是儀器誤差，主要體現(xiàn)在樣品池的使用上。一般來說，為得到最精確的定量結(jié)果,應(yīng)使用同一樣品池測量標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測樣品，雖然這樣比較麻煩，依據(jù)文獻(xiàn)2我們知道，最好的樣口池應(yīng)有平整、嚴(yán)格平行的光學(xué)表面,否則會使光束偏離,引起表觀吸光度誤差;另外，樣品池在樣品架

7、上的方位應(yīng)始終不變,這樣不致于使測量空白和樣品時的光學(xué)效應(yīng)不全都而產(chǎn)生誤差。因此我認(rèn)為，今后在使用分光光度計的時候，若要平行測定樣品，應(yīng)當(dāng)使用同一樣品池來裝樣品，不要像以往一樣，由于麻煩、圖快，就使用幾個不同的樣品池來測定，另外，師姐一再強(qiáng)調(diào)樣品池在裝不同樣品之前肯定要用去離子水、樣液潤洗幾遍，保證不會有上一樣品的殘留，并且將光面上的殘留物擦干，不能留有指紋，否則都會影響測定的精確性。另外，在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的時候也有肯定的講究，依據(jù)文獻(xiàn)我們知道3，理論上僅用一個已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測量其吸光度便可進(jìn)行定量分析校正,測得的吸光度值除以濃度便得斜率。但是有很多儀器和樣品因素會偏離朗伯-比耳定律。若校準(zhǔn)工作曲線不精確,會造成定量分析結(jié)果較大的誤差。因此要得到一條標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,應(yīng)測量至少三個已知濃度標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的吸光度,標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度范圍應(yīng)包括待測樣濃度。然后用線性回歸方法找到所測數(shù)據(jù)和校正曲線的最佳擬合,以打算哪種類型的工作曲線可給出最佳的擬合。我認(rèn)為在平常的試驗當(dāng)中，我們的待測樣濃度經(jīng)常沒有在標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度范圍內(nèi)，若樣品濃度不在此范圍內(nèi)，可能會導(dǎo)致線性關(guān)系不佳，造成試驗誤差，而本次試驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線很好，待測樣品濃度落在標(biāo)準(zhǔn)樣品范圍內(nèi)。參 考 文 獻(xiàn)1