磷脂原料藥工藝研究

1、原料藥生產(chǎn)工藝的研究資料及文獻(xiàn)資料1、制備路線及詳細(xì)依據(jù)大豆磷脂是一種具有較高營養(yǎng)價值的天然乳化劑，含有豐富的卵磷脂、腦磷脂、肌醇磷脂、絲氨酸磷脂等成份，其脂肪酸中含有60%的不飽和脂肪酸，并含有豐富的維生素及微量元素，大豆磷脂除了補(bǔ)充人體必需的營養(yǎng)素，還具備其獨(dú)特的生理活性，對生物膜的生物活性和機(jī)體的正常代謝有重要的調(diào)節(jié)能力。卵磷脂具有較好的保健作用及營養(yǎng)作用1，是一種重要的醫(yī)藥原料。主要有口服級及注射級。 磷脂提取方法主要有以下幾種2： 有機(jī)溶劑萃取法，有機(jī)溶劑無機(jī)鹽復(fù)合沉淀法，色層分離，超臨界萃取技術(shù)，膜分離法。目前用工業(yè)上用于磷脂分離純化的方法主要是溶劑法和色層分離。其它方法都適用于實(shí)

2、驗(yàn)室研究，而難達(dá)到工業(yè)生的規(guī)模。溶劑法文獻(xiàn)3報道磷脂的制備主要有2條工藝路線。a路線：先用乙醇提取，后用丙酮脫脂；b路線：先用丙酮脫脂，再用乙醇萃取。乙醇萃取主要是利用蛋白和卵磷脂在乙醇中的溶解度不同，進(jìn)而將蛋白除掉，提高磷的含量。丙酮脫脂主要是利用油脂類成分易溶于丙酮而磷脂不溶于丙酮，這樣達(dá)到油脂與磷脂的分離，進(jìn)而提高磷的含量。本次申報采用的方法為溶劑法及硅膠柱層析法，通過溶劑法可以得到口服級磷脂。進(jìn)一步通過硅膠柱層析可以得到注射級磷脂。2、工藝流程圖濃縮磷脂20，加2倍量的丙酮脫脂3次，每次30min，靜置5min，傾出上清液，最后一次抽濾濾餅上清液+濾液60，2倍量90%乙醇反復(fù)提取3次

3、，每次1h，合并提取液提取液藥渣60，-0.08Mpa減壓回收溶劑，濃縮至相對密度為0.961.25（60）液狀磷脂稠膏大豆卵磷脂60減壓干燥24h，-0.08MPa用甲醇溶解完全，加入硅膠攪拌均勻，晾干，過篩200-300目硅膠甲 醇拌料硅膠硅膠干法裝柱，洗脫劑為甲醇，層析分。 流速：2535Lhr。每10L接一個流。 TLC檢測，分段合并。200-300目硅膠甲 醇磷脂主段回收溶劑（60，真空度-0.08Mpa），濃縮物減壓干燥（60，真空度-0.08Mpa）24h注射用大豆磷脂3.制備工藝研究3.1大豆卵磷脂的制備工藝3.1.1 a路線工藝研究 參考文獻(xiàn)a路線的流程圖如下：濃縮磷脂乙醇萃

4、取液狀磷脂丙酮脫脂大豆卵磷脂根據(jù)流程圖及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，采用正交試驗(yàn)對a路線進(jìn)行最佳工藝篩選。3.1.1.1 a路線乙醇萃取正交試驗(yàn)研究3.1.1.1.1 a路線乙醇萃取正交試驗(yàn)的因素及水平見表8-1表8-1 乙醇萃取工藝考察因數(shù)水平表因素A（溫度）B（時間）C（乙醇量）D（次數(shù)）水平15030min1：11水平26060min1：22水平37090min1：33采用以上因素及水平，按L9（34）進(jìn)行乙醇萃取試驗(yàn)。3.1.1.1.2樣品的制備取9份濃縮磷脂，每份50g，以90%乙醇為溶媒，按照正交表所設(shè)計的條件進(jìn)行提取，分別將提取液濾過，合并，濃縮，減壓干燥（60，真空度為-0. 08Mpa），得到

5、液狀磷脂。3.1.1.1.3考察指標(biāo)的測定 以水分、磷含量、丙酮不溶物為考察指標(biāo)。3.1.1.1.4 試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果見表8-2，直差分析及方差分析見表8-3和表8-4。表8-2 a路線乙醇萃取正交試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)編號濃縮磷脂質(zhì)量(g)液狀磷脂質(zhì)量（g）水分（%）丙酮不溶物（%）磷含量（%）150.066.971.8760.122.24250.1213.991.4257.232.44350.0918.111.6956.552.13450.0219.421.1657.462.35550.0416.251.5062.782.27650.116.281.3457.242.55750.0111.941.73

6、58.012.30850.058.291.0856.172.13950.0813.201.9463.522.24表8-3 a路線乙醇萃取正交試驗(yàn)直差分析列號1234含磷量（g）試驗(yàn)號111110.1533 212220.3372 313330.3785 421230.4505 522310.3640 623120.1583 731320.2698 832130.1749 933210.2904 K10.28967 0.29124 0.1622 0.2692 K20.32427 0.29203 0.3594 0.2551 K30.24505 0.27572 0.3374 0.3347 R0.07

7、921 0.01631 0.1972 0.0796 表8-4 a路線乙醇萃取正交試驗(yàn)方差分析離差來源平方和自由度均方F值P值顯著性因素A0.009462 20.004731 18.6422 P <0.1因素C0.070088 20.035044 138.0893 P <0.01*因素D0.010810 20.005405 21.2973 P<0.05*因素B（空白）0.000508 20.000254 F0.10（2，2）=9.0；F0.05（2，2）=19.0；F0.01（2，2）=99.0；3.1.1.1.5小結(jié)經(jīng)方差分析，相對于因素B，因素C對提取有非常顯著性影響，因素

8、D對提取有顯著性影響，因素A對提取的影響不顯著。通過直觀分析得到優(yōu)化的工藝路線為A2B2C3D2即，602倍量乙醇提取3次，每次60min。9批樣品的丙酮不溶物含量差距不大。所以a線路乙醇萃取的最佳工藝為： 60用2倍量90%乙醇提取濃縮磷脂3次，每次1小時，合并提取液，減壓濃縮，即得液狀磷脂。3.1.1.1.6提取工藝驗(yàn)證根據(jù)a路線乙醇萃取工藝優(yōu)選結(jié)果,連續(xù)投料三批,結(jié)果見表8-5表8-5 a路線乙醇萃取工藝驗(yàn)證結(jié)果編號濃縮磷脂量（g）液狀磷脂（g）水分（%）丙酮不溶物（%）磷含量（%）第一批50.0419.88 1.7862.98第二批50.1220.121.9161.46第三批50.06

9、20.031.8661.54由表8-15可見，三批結(jié)果平行，說明提取工藝條件基本穩(wěn)定。3.1.1.2 a路線丙酮脫脂正交試驗(yàn)研究3.1.1.2.1 a路線丙酮脫脂正交試驗(yàn)的因素及水平見表8-6表8-6 丙酮脫脂工藝考察因數(shù)水平表因素A（脫脂溫度）B（提取時間）C（丙酮量）D（提取次數(shù)）水平12020min1：12水平23030min1：23水平34040min1：34采用以上因素及水平，按L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)脫脂試驗(yàn)3.1.1.2.2 樣品的制備取濃縮磷脂2000g，以4000ml乙醇60提取3次，每次60min，合并提取液，減壓濃縮，至琺瑯盤中減壓干燥（60，真空度-0.08Mpa）24h，

10、稱重。保存供丙酮脫脂正交工藝用。取50g液狀磷脂，按照按正交試驗(yàn)表所設(shè)計的條件，攪拌脫脂，最后一次脫脂完畢進(jìn)行抽濾，取濾餅，減壓干燥（60，真空度-0.08Mpa）24小時，得到粉末磷脂；前幾次脫脂完畢后，均靜置5分鐘，將上清液傾出，沉淀繼續(xù)脫脂。3.1.1.2.3 考察指標(biāo)的測定 以水分、含磷量、丙酮不溶物為考察指標(biāo)。3.1.1.2.4 試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果見表8-7，直差分析及方差分析見表8-8和表8-9表8-7 a路線丙酮脫脂正交試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)編號液狀磷脂卵磷脂質(zhì)量（g）水分（%）丙酮不溶物（%）磷值（%）150.0630.60 1.2281.982.41250.1234.06 1.0783.7

11、23.09350.0930.04 1.4392.153.08450.0226.43 1.2989.642.76550.0426.16 1.3690.283.13650.1134.59 1.5175.162.63750.0118.18 1.1490.073.13850.0532.78 1.2881.222.62950.0832.33 1.6270.332.71表8-8 a路線丙酮脫脂正交試驗(yàn)直差分析列號1234含磷量（g）試驗(yàn)號111110.72828212221.042236313330.913216421230.718896522310.808344623120.895881731320.5

12、61762832130.849002933210.863211K10.894580.669650.824390.79995K20.807710.899860.874780.83329K30.757990.890770.761110.82704R0.136590.009090.050390.02709表8-9 a路線丙酮脫脂正交試驗(yàn)方差分析離差來源平方和自由度均方F值P值顯著性因素A0.028674 20.014337 15.2095 P >0.1因素B0.101977 20.050988 54.0922 P <0.05*因素C0.019466 20.009733 10.3252 P

13、 >0.1因素D0.001885 20.000943 F0.10（2，2）=9.0；F0.05（2，2）=19.0；F0.01（2，2）=99.0；3.1.1.2.5 小結(jié)上述方差分析結(jié)果表明：以含磷量為考察指標(biāo)，相對于因素D，因素A、C無顯著性差異（P>0.1），因素B有顯著性差異（P<0.05），根據(jù)直觀分析結(jié)果，最佳水提取工藝應(yīng)為A1B2C2D2。從丙酮不溶物含量來看，2號樣品的丙酮不溶物含量大于90%，符合規(guī)定。結(jié)合直差、方差、磷含量來看，最佳工藝定為A1B2C2D2，即，液狀磷脂在 20進(jìn)行丙酮脫脂試驗(yàn)3次，每次用2倍量的丙酮，抽濾，干燥，得到卵磷脂。3.1.1.2

14、.6 a路線脫脂工藝驗(yàn)證根據(jù)a路線脫脂工藝優(yōu)選結(jié)果，連續(xù)投料三批，結(jié)果見表8-10表8-10 a路線脫脂工藝驗(yàn)證結(jié)果編號液狀磷脂量（g）卵磷脂量（g）水分（%）丙酮不溶物（%）磷含量（%）第一批50.0231.161.5994.31第二批50.2130.941.4792.95第三批50.0530.231.5193.68由表8-19可見，三批結(jié)果平行，說明提取工藝條件基本穩(wěn)定。結(jié)論：a路線丙酮脫脂最佳工藝為：液狀磷脂在20時，用丙酮脫脂3次，每次用2倍量的丙酮，抽濾，干燥，得到卵磷脂。3.1.1.3 a路線最佳工藝確定以上2組正交試驗(yàn)結(jié)果表明a路線的工藝為：濃縮磷脂60時用2倍量90%乙醇3次，

15、每次1小時，合并提取液，減壓濃縮，即得液狀磷脂。液狀磷脂在液狀磷脂在20時，用丙酮脫脂3次，每次用2倍量的丙酮，抽濾，干燥，得到卵磷脂。3.1.2 b路線工藝研究參考文獻(xiàn)b路線的流程圖如下：濃縮磷脂丙酮脫脂粉末粗磷脂乙醇萃取大豆卵磷脂根據(jù)流程圖及文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，采用正交試驗(yàn)對a路線進(jìn)行最佳工藝篩選。3.1.2.1 b路線丙酮脫脂正交試驗(yàn)研究3.1.2.1.1b路線丙酮脫脂正交試驗(yàn)的因素及水平見表8-6采用以上因素及水平，按L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)脫脂試驗(yàn)3.1.2.1.2 樣品的制備 取9份濃縮磷脂，每份50g，按3.1.1.2.2 的方法進(jìn)行樣品制備3.1.2.1.3考察指標(biāo)的測定 樣品的考察指標(biāo)同3

16、.1.2.1.4 試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果見表8-12，直差分析及方差分析見表8-13和表8-14表8-12 b路線丙酮脫脂正交試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)編號投料量粉末磷脂質(zhì)量（g）含水量干重（g）丙酮不溶物含量丙酮不溶物提取率磷含量150.2339.77 1.48%39.18 83.93%65.47%2.65%250.1237.60 1.57%37.01 90.60%66.90%3.16%350.0933.65 1.34%33.20 97.72%64.77%3.05%450.1133.75 1.61%33.21 95.10%63.02%3.23%550.0334.53 1.29%34.08 91.31%62.21%

17、3.37%650.0235.06 1.55%34.52 92.50%63.83%2.96%750.1734.79 1.06%34.42 93.90%64.42%2.75%850.2134.45 1.05%34.09 94.35%64.06%3.20%950.3533.78 1.15%33.39 95.90%63.60%2.86%表8-13 b路線丙酮脫脂正交試驗(yàn)直差分析列號1234丙酮不溶物提取率（%）試驗(yàn)號1111165.77 2122267.06 3133364.88 4212363.16 5223162.25 6231263.86 7313264.64 8321364.32 933216

18、4.07 K165.9052 64.5240 64.6470 64.0291 K263.0866 64.5407 64.7642 65.1868 K364.3435 64.2707 63.9242 64.1195 R2.8186 0.2700 0.8400 1.1577 表8-14 b路線丙酮脫脂正交試驗(yàn)方差分析離差來源平方和自由度均方F值P值顯著性因素A11.946425.973286.6938P < 0.05*因素C1.259320.629659.1386P > 0.1因素D2.515421.257718.2540P > 0.1因素B（空白）0.137820.0689F0

19、.10（2，2）=9.0；F0.05（2，2）=19.0；F0.01（2，2）=99.0；3.1.2.1.5小結(jié)上述方差分析結(jié)果表明：以丙酮不溶物提取率為考察指標(biāo)，相對于因素B因素（以因素B為空白），因素A有顯著性差異（P<0.05），因素C無顯著性差異（P>0.10），因素D無顯著性差異（P>0.10），根據(jù)直觀分析結(jié)果，最佳提取工藝應(yīng)為A1B2C2D2。從粉末磷脂的含磷量來看，9批樣品的磷含量均較高，除1號樣品外均達(dá)到口服級標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合直差、方差、磷含量來看，最佳工藝定為A1B2C2D2，即，先在20下，進(jìn)行丙酮脫脂3次，每次用2倍量的丙酮，抽濾，干燥，得到粉末磷脂。3.1

20、.2.1.6提取工藝驗(yàn)證根據(jù)a路線脫脂工藝優(yōu)選結(jié)果,連續(xù)投料三批,結(jié)果見表8-15表8-15 b路線脫脂工藝驗(yàn)證結(jié)果編號取樣量（g）粉末磷脂量（g）水分（%）丙酮不溶物（%）磷含量（%）第一批100.0871.251.6790.35第二批100.1573.811.790.16第三批100.0271.191.5990.28由表8-5可見，三批結(jié)果平行，說明提取工藝條件基本穩(wěn)定。結(jié)論：制備粉末磷脂的最優(yōu)工藝為20進(jìn)行丙酮脫脂試驗(yàn)3次，每次用2倍量丙酮，抽濾，干燥，得到粉末磷脂。3.1.2.2 b路線乙醇萃取正交試驗(yàn)研究3.1.2.2.1 b路線乙醇萃取正交試驗(yàn)的因素及水平見表8-1采用以上因素及水

21、平，按L9（34）進(jìn)乙醇萃取試驗(yàn)。3.1.2.2.2 樣品的制備取濃縮磷脂1500g，20用2倍量的丙酮脫脂3次，濾過，取濾餅，減壓干燥（60，真空度為-0.08Mpa）24小時，得到粉末磷脂900g。取9份粉末磷脂，每份50g，按 3.1.1.1.2方法制備樣品。3.1.2.2.3 考察指標(biāo)的測定3.1.2.2.4 試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果見表8-16，直差分析及方差分析見表8-17和表8-18表8-16 b路線乙醇萃取正交試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)編號投料量（g）卵磷脂質(zhì)量（g）水分干重（g）丙酮不溶物（g）磷含量150.013.43 1.91%3.36 90.98%3.24%250.2313.06 1.98

22、%12.80 91.12%3.18%350.1113.03 1.84%12.79 90.26%2.90%450.0215.70 1.98%15.39 91.05%3.29%550.1311.38 1.95%11.16 92.36%2.87%650.254.21 1.92%4.13 90.56%3.13%750.3114.28 1.80%14.02 91.11%2.91%850.0911.38 1.85%11.17 91.32%3.17%950.065.90 1.76%5.80 92.26%3.25%表8-17b路線乙醇正交試驗(yàn)直差分析列號1234含磷量（g）試驗(yàn)號111110.1091 212

23、220.4076 313330.3714 421230.5055 522310.3198 623120.1292 731320.4084 832130.3539 933210.1882 K10.29597 0.34101 0.1974 0.2057 K20.31819 0.36039 0.3671 0.3150 K30.31685 0.22960 0.3665 0.4103 R0.02222 0.13079 0.1697 0.0952 表8-18 b路線乙醇萃取正交試驗(yàn)方差分析離差來源平方和自由度均方F值P值顯著性因素B0.0299 20.0149 32.0894 P<0.05*因素C0

24、.0574 20.0287 61.6000 P<0.05*因素D0.0629 20.0314 67.5059 P<0.05*因素A（空白）0.0009 20.0005 F0.10（2，2）=9.0；F0.05（2，2）=19.0；F0.01（2，2）=99.0；3.1.2.2.5小結(jié)上述方差分析結(jié)果表明：以含磷量為考察指標(biāo)，相對于因素A，因素B、C、D均有有顯著性差異（P<0.05），根據(jù)直觀分析結(jié)果，最佳提取工藝應(yīng)為A2B2C3D2。從粉末磷脂含磷量來看，9批樣品的磷含量均較高，均達(dá)到口服級標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)合直差、方差、磷含量來看分析佳工藝定為A2B2C2D3，即，在60下用2倍量

25、90%乙醇提取粉末磷脂，每次1小時，合并提取液，減壓濃縮，即得卵磷脂。9批樣品丙酮不溶物含量均大于90%，符合規(guī)定。3.1.2.2.6提取工藝驗(yàn)證根據(jù)a路線乙醇萃取工藝優(yōu)選結(jié)果,連續(xù)投料三批，結(jié)果見表8-19表8-19 b路線乙醇萃取工藝驗(yàn)證結(jié)果編號粉末磷脂量（g）卵磷脂質(zhì)量（g）水分（%）丙酮不溶物（%）磷含量（%）第一批100.1423.54 1.8891.05第二批100.3124.031.9192.12第三批100.0523.391.7691.19由表8-10可見，三批結(jié)果平行，說明提取工藝條件基本穩(wěn)定。3.1.2.2 b路線工藝驗(yàn)證以上三組正交試驗(yàn)結(jié)果可以得到b路線的最佳工藝。并對該

26、工藝進(jìn)行驗(yàn)證。平行取濃縮磷脂3份，每份100g，20丙酮脫脂3次，每次用2倍量的丙酮，抽濾，干燥，得到粉末磷脂，該粉末磷脂在60時用2倍量90%乙醇提取粉末磷脂，每次1小時，合并提取液，減壓濃縮，即得卵磷脂。a路線工藝驗(yàn)證結(jié)果見表8-20。表8-20 b路線工藝驗(yàn)證結(jié)果編號濃縮磷脂質(zhì)量（g）卵磷脂質(zhì)量（g）水分（%）丙酮不溶物（%）磷含量（%）第一批100.2117.891.85%90.57%第二批100.1917.191.93%91.08%第三批100.0617.091.7690.69%由表8-20可見，三批結(jié)果平行，說明提取工藝條件基本穩(wěn)定。3.1.3 a、b路線對比由a路線及b路線來看，

27、分別以100g液態(tài)磷脂為原料a路線得到的磷總量高，另外從試驗(yàn)的操作難易上來看，a路線比較簡單易行，因此卵磷脂的制備采取a路線，即602倍量乙醇提取3次，每次60min，再室溫經(jīng)2倍丙酮脫油3次，每次30min。3.2 大豆磷脂柱層析研究按照上述工藝制出的大豆磷脂。磷含量在2.73.3之間，沒有達(dá)到注射磷脂要求，需要對該大豆磷脂進(jìn)一步分離。通過柱層析條件摸索，最終確定層析條件為：固定相為硅膠（200-300目），拌樣用硅膠為樣品質(zhì)量的2.5倍，空白硅膠為樣品的10倍，流動相為甲醇。取濃縮磷脂20kg，按照上述工藝制備卵磷脂樣品3.72kg，以其為原料，對磷脂柱層析進(jìn)行工藝研究。3.2.1 柱層析

28、薄層檢測方法3.2.1.1 對照品溶液配制 取德克塞大豆磷脂對照品0.1g，用10ml甲醇溶解作為對照品溶液。3.2.1.2 卵磷脂樣品溶液配制 取自制卵磷脂0.1g，用10ml甲醇溶解，作為磷脂樣品溶液。3.2.1.3 監(jiān)測條件每個流份作為一個供試品溶液。吸取上述供試品溶液、對卵磷脂樣品溶液、對照品溶液各10ml，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素納為粘合劑的硅膠GF254薄層板上，以二氯甲烷-甲醇（1：1）為展開劑，展開，取出，晾干，碘熏至斑點(diǎn)顯色清晰（大概3min）。分別將五個供試品溶液與對照樣品溶液及對照品溶液點(diǎn)于同一薄層板上。3.2.1.4 供試品溶液薄層板檢測判定 PCB1合并段，層析開始

29、至TLC板圖上大豆磷脂標(biāo)樣PC平行位置出現(xiàn)斑點(diǎn)之間的流份；此合并段TLC板圖上主要顯示的是PC平行位置上方的雜質(zhì)斑點(diǎn)，沒有PC斑點(diǎn)出現(xiàn)。PCB2合并段，TLC板圖上PC標(biāo)樣平行位置有斑點(diǎn)、且上方有明顯雜質(zhì)斑點(diǎn)至雜質(zhì)斑點(diǎn)消失、TLC板圖上僅只在PC標(biāo)樣平行位置有斑點(diǎn)之間的流份；此合并段TLC板圖上主要顯示的是PC標(biāo)樣平行位置和上方有斑點(diǎn)。 PCB3合并段，TLC板圖上僅只在PC標(biāo)樣平行位置有斑點(diǎn)至斑點(diǎn)模糊之間的流份；此合并段為目標(biāo)物PC的主段層析液，TLC板圖表現(xiàn)為僅只在PC標(biāo)樣平行位置有斑點(diǎn)，上下沒有任何雜質(zhì)斑點(diǎn)。 PCB4合并段，TLC板圖PC標(biāo)樣平行位置斑點(diǎn)模糊至斑點(diǎn)消失之間的流份；此合并

30、段TLC板圖上主要顯示的是PC標(biāo)樣平行位置有模糊斑點(diǎn)或者沒有斑點(diǎn)，下方有模糊的雜質(zhì)斑點(diǎn)。3.2.2柱層析固定相選擇文獻(xiàn)報道磷脂的分離可以用三氧化二鋁及硅膠。流動相可以用甲醇和乙醇。現(xiàn)對所用固定相進(jìn)行考察。主要考察硅膠（200-300目）及中性三氧化二鋁（200-300目）對卵磷脂樣品的分離及吸附狀況。取編號為1# 、2#的自制卵磷脂（批號為 ）兩份，質(zhì)量分別為2.01g及2.04g。分別將兩批樣品用20ml甲醇溶解，拌于固定相中，揮干溶劑。分別將1# 、2#空白固定相裝于玻璃柱（Ø2.5×50）中，抽實(shí)，上樣，用甲醇作為流動相進(jìn)行洗脫，每25ml為一個流分。固定相、拌樣用量

31、及空白固定相的量見表8-21. 按照3.2.1中所述方法對1# 、2# 柱各個流分進(jìn)行薄層監(jiān)測，根據(jù)薄層行為進(jìn)行合并。合并情況見表8-21。1#柱薄層板見附圖16；2# 柱板見附圖714。表8-21 固定相考察數(shù)據(jù)對照綜合表柱子編號1#2#固定相三氧化二鋁硅膠拌樣固定相用量5.035.01空白固定相量40.1740.06PCB1段流份編號-1-16PCB2段流份編號-PCB3段（磷脂主段）流份編號1-3017-29PCB4段流份編號-30-41將磷脂主段層析液于60減壓濃縮（真空度-0.08Mpa），得到主段樣品。送檢，測其磷含量。1#柱得到主段樣品0.60g，磷含量為2.9%，1#柱主段樣品

32、收率為30%。2# 柱得到主段樣品0.95g，磷含量為2.9%，2#柱主段樣品收率為47.5%。由1# 柱、2# 柱主段樣品磷值測定結(jié)果可知，三氧化二鋁柱及硅膠柱都可以分離出注射用磷脂，但2# 柱收率明顯大于1# 柱，所以選擇硅膠為固定相。3.2.3空白硅用量的考察 由2# 柱結(jié)果可知，空白硅膠為20倍上樣量時分離效果比較好，但從成本來看，需對空白硅膠用量進(jìn)行考察。取編號為3# 、4#的自制卵磷脂兩份，質(zhì)量分別為2.06g及2.15g。分別將兩批樣品用20ml甲醇溶解，拌于硅膠中中，揮干溶劑。分別將3# 、4#空白固定相裝于玻璃柱（Ø2.5×50）中，抽實(shí)，上樣，用甲醇作為

33、流動相進(jìn)行洗脫. 3#柱每每7ml為一個流份；4# 柱每20ml為一個流份。拌樣及空白硅膠質(zhì)量量見表8-22. 按照3.2.1中所述方法對3# 、4# 柱各個流分進(jìn)行薄層監(jiān)測，根據(jù)薄層行為進(jìn)行合并。合并情況見表8-22。3# 柱薄層板見附圖1520；4# 柱薄層板見附圖2128。表8-22 固定相用量考察數(shù)據(jù)對照綜合表柱子編號3#4#拌樣硅膠量（g）5.135.21空白硅膠量（g）10.0120.11PCB1段流份編號1-71-9PCB2段流份編號8-910PCB3段（磷脂主段）流份編號10-1711-30PCB4段流份編號18-3031-40 將3#主段層析液分別于60減壓（真空度-0.08

34、Mpa）濃縮，得到主段樣品0.95g（磷含量為2.9%），收率為37%。將4# 柱主段層析液分別于60減壓（真空度-0.08Mpa）濃縮，得到主段樣品0.89g（磷含量為2.9%），收率為44.5%。由3# ，4# 柱層析結(jié)果可知，雖然3# 柱對分離磷脂有一定效果，但是交叉部分比較多，主段收率也沒有4# 柱高，4# 柱與2# 柱主段收率相差較少，所以將空白硅膠定為樣品10倍量。3.2.3流動相考察 有文獻(xiàn)報道，乙醇也可以用于磷脂分離?，F(xiàn)對乙醇作為流動相進(jìn)行考察。 取自制卵磷脂2.01g，用20ml甲醇溶解，拌于5.14g硅膠中，5#樣。 取20.12g硅膠裝于玻璃柱（Ø2.5

35、5;50）中，抽實(shí)，將5#樣上樣，記為5#柱。用95%乙醇為洗脫液進(jìn)行洗脫，對其進(jìn)行薄層監(jiān)測，每20ml為一流分。按照3.2.1中所述方法對5#柱行薄層監(jiān)測。5# 柱薄層板見附圖2934。 5# 柱接到第28流份時已經(jīng)洗脫7個保留體積，此時磷脂斑點(diǎn)還未出現(xiàn)，表明乙醇對磷脂分離效果不好所以流動相選擇為甲醇。3.2.4 工藝驗(yàn)證 取自制卵磷脂3份，質(zhì)量分別為125.21g，125.36g，125.03g，分別用1250ml甲醇溶解。分別用313.01g，313.52g，312.53g硅膠拌樣，編號依次為1#，2#，3#樣品。 取三根玻璃柱（Ø8.0×120），分別裝入約1.25kg硅膠