玻璃酸及其衍生物的臨床應用進展

1、玻璃酸及其衍生物的臨床應用進展凌沛學 賀艷麗 劉愛華 張?zhí)烀褡訫eyer和Palmer于1934年首次從牛眼玻璃體分離得到玻璃酸及其鹽（hyaluronan，簡稱HA）后，經過半個多世紀的研究，對其結構、理化性質已有了明確認識13。目前，HA及其衍生物在臨床上已得到廣泛的應用。本文對其應用進展作一概述。1 HA在眼科方面的應用Balazs等最先開展HA應用于眼前節(jié)和玻璃體手術的研究，并從人臍帶和雄雞冠提取得到高純度、非致炎性的HA組分（NIF-HA），作為眼科手術黏彈性保護劑應用于臨床，由此使眼科界黏性手術（viscosurgery）得到普及。此外，HA可延長淚膜破裂時間（BUT）從而對干眼癥

2、具有明顯的緩解作用，是目前治療干眼癥的首選藥物。1.1 應用于眼科手術行使眼前節(jié)手術時，若沒有黏彈劑發(fā)揮其填充和保護作用，手術往往失敗或不夠理想。黏彈劑應具備的特點如下：有效地填充前房至適當?shù)纳疃龋铱删S持至所需的時間；緩沖機械力，避免手術器械及植入物對眼組織造成損傷；覆蓋于組織、器械或植入物表面，形成保護屏障；將組織隔離、避免粘連的發(fā)生；提供清晰的手術視野，手術器械可在其中活動自如；無毒、無刺激，具有好的生物相容性等。1%3%NIF-HA溶液具有高度的黏彈性，可滿足以上要求。最先面市的是由瑞典Pharmacia藥廠出品的Healon，含1%HA，自雄雞冠提取制備。大量藥效學及安全性試驗表明，

3、Healon可有效地維持前房，降低角膜內皮細胞的損傷率。HA黏彈劑使以前不能或極難完成的操作成為可能。如：在青光眼手術中，需要在結膜下創(chuàng)造一個額外的空間或將狹小的空間拓展，注入HA溶液即可達到目的，且不會造成毛細血管損傷導致出血和滲出；在視網膜復位術中應用HA黏彈劑，擠壓脫落的視網膜復位，且維持一定的時間直至其與色素上皮愈合；無晶狀體眼的玻璃體前界面易凸出，極易損傷，將HA黏彈劑注入角膜和虹膜的間隙內，對其施壓使其后縮，便于手術操作，避免其損傷45。HA可作為黏彈性手術“鉗”（viscosurgical vice）來剝離組織，如剝離視網膜前膜，對組織沒有損傷，這是目前任何器械和方法無法比擬的。

4、HA黏彈劑還具有使植片易于著位和縫合，壓迫出血點利于止血，術中濕潤眼球表面，防止上皮干燥，中和器械和植入物表面的正電荷，消除晶體乳化過程中產生的自由基，減輕炎癥等作用6。迄今為止，臨床上應用的HA黏彈劑有10余種，已成功地應用于眼科20余種手術，發(fā)表了大量的臨床報告，包括各品牌的HA黏彈劑及其與羥丙基甲基纖維素的比較研究。還對維持前房深度和時間、角膜內皮細胞喪失率、術后眼壓（IOP）和炎癥反應等指標進行了評價。研究表明，HA的相對分子質量（Mr）越高，黏彈性越好，維持前房的效果越好。比較HA黏彈劑與羥丙基甲基纖維素的總體效果的好壞較為困難，因為兼顧幾個指標難以得出定論。最近推出了新一代HA黏彈

5、劑，商品名為Healon 5，含2.3%HA，具有更高的黏彈性，可滿足近幾年日益普及的超聲晶狀體乳化進行白內障摘除-人工晶體植入術的要求。Healon 5具有更低的內皮細胞喪失率、較好的血-房水屏障等作用。常見的不良反應為術后IOP升高和炎癥反應。術后將HA吸出或沖出前房，可避免IOP升高。除青光眼患者外，對絕大多數(shù)患者來說，術后IOP的升高一般在可以耐受的范圍內，且在術后24h內恢復正常，一般不需特殊處理。常見的炎癥反應是前房出現(xiàn)炎癥細胞、光斑、角膜水腫和混濁。對制劑本身來說，殘留的核酸和蛋白質等雜質會導致炎癥，但手術過程中器械對組織的損傷、殘留的組織碎片、積血等也是引發(fā)炎癥的原因。1.2

6、對干眼癥的治療眼表面覆蓋著一層透明的液體薄膜，即淚膜，具有濕潤角膜上皮、營養(yǎng)眼表面上皮細胞、預防感染以及保護、促進角膜損傷愈合等功能。結膜病變，淚腺、副淚腺等腺體萎縮如Sjgren綜合征均可導致BUT明顯縮短，失去其生理功能，發(fā)生干眼癥。以往對干眼癥的治療多采用頻繁滴注生理鹽水、人工淚液等對癥治療，但效果均不理想。1982年，Polck等最先將0.1% HA溶液用于治療15例干眼癥患者?；颊呤褂煤?，疼痛立刻消失，且只要角膜上留有HA溶液，眼就沒有疼痛感。眼部紅腫也得到明顯改善，視力有了明顯的提高，點眼頻率也逐漸減少。Tabatabay等用0.1% HA溶液治療干眼癥患者的2次試驗均獲得成功。尤

7、其是1985年，對3例嚴重而又久治不愈的患者進行的試驗更引人注目，短期治療即獲得明顯療效?；颊咦杂X癥狀完全消失，組織學檢查也表明改善顯著。HA滴眼液治療干眼癥既有效又安全7。Stuart等用0.1% HA治療14例患者中，有6位患者使用時間長達1年未見不良反應，用藥長達2年的患者也耐受良好。研究表明，HA溶液延長BUT而具有穩(wěn)定淚膜的作用。Mengher等發(fā)現(xiàn)，0.1%HA溶液與生理鹽水相比，BUT可至少延長40min以上。Hamana等對研究了HA的量效關系，結果表明，當HA的濃度達到0.1%以上時，效果才顯著。2 對關節(jié)疾病的治療2.1 機制探討補充外源性高Mr HA治療類風濕性關節(jié)炎（R

8、A）及骨性關節(jié)炎（OA）等關節(jié)疾病是由Balazs等人最先提出的。他們認為，高Mr HA注入關節(jié)腔內，恢復病理狀況下的滑液至正常狀態(tài)，重建其潤滑、屏障和保護功能，打斷病變過程中如下的惡性循環(huán)：滑液黏彈性降低屏障和保護作用降低軟骨進一步破壞釋放的酶和炎癥因子進一步使滑液的黏彈性降低。對關節(jié)提供潤滑和屏障功能的同時，為病變的關節(jié)提供一個自然修復的時間，使軟骨自然修復和愈合。此外，高Mr HA還可抑制血管和組織的增生，抑制炎癥反應，屏蔽痛覺感受器，從而明顯緩解癥狀。其治療機制如下。2.1.1 對軟骨及糖胺聚糖的作用對各種動物模型研究所得的結果均表明，HA可抑制軟骨退行性變，促進病變軟骨的修復89，且

9、高Mr HA的效果好于低Mr HA10。組織生化學研究發(fā)現(xiàn)，HA抑制OA軟骨基質蛋白聚糖聚集物（PGA）的降解，減少蛋白聚糖的釋放。此外，HA可明顯提高蛋白聚糖的聚集率。結果提示HA對PGA的生成和降解具有重要的作用1112。2.1.2 對疼痛覺感受器的屏蔽作用高Mr HA可抑制由舒緩激肽和尿酸鹽引發(fā)的關節(jié)疼痛13。若在關節(jié)腔內注入玻璃酸酶，則關節(jié)對疼痛的敏感性明顯增強，即使關節(jié)軟骨沒有明顯的病變。當關節(jié)發(fā)生炎癥時，炎癥介質如二十烷、激肽、胺和細胞活素可激活神經細胞膜上的傷害感受器。一些化學物質如前列腺素、5-羥色胺等可作用于受體，使細胞產生第二信息遞質等來激活傷害感受器。傷害感受器的激活是感

10、覺疼痛的原因14。神經膜細胞上的傷害感受器鑲嵌在以HA為主要成分的細胞外基質（ECM）中，HA的大分子網狀結構介于刺激源和感受器之間，對刺激信號起到濾器樣作用，調節(jié)信號的傳導和化學物質向感受器的傳遞。研究發(fā)現(xiàn)，高Mr HA注入到病變關節(jié)腔后，隨即可出現(xiàn)疼痛緩解作用，只要滑膜和軟骨表面有HA覆蓋，就有止痛作用。當滑膜和軟骨表面的HA膜消失后，止痛作用隨即消失。低Mr HA以及一些其它高分子黏性物質如羧甲基纖維素、硫酸軟骨素等均沒有止痛作用。結果提示，只有高Mr HA的構象與傷害感受器受體的相適應，或與上述的致痛物質具有結合作用，從而緩解疼痛。2.1.3 清除自由基，調節(jié)細胞功能發(fā)生RA或OA時，

11、炎癥細胞釋放大量的自由基，降解結締組織中的大分子物質，導致組織損傷和病變。關節(jié)滑液中的HA濃度和Mr均明顯降低，就是自由基對HA的降解和關節(jié)積液對滑液的稀釋所致。研究表明，HA可與自由基發(fā)生反應而將其清除，因而高Mr HA具有保護軟骨細胞免受自由基損傷的作用15。正常狀況下，關節(jié)內含有的高Mr HA可能具有抑制血管生成的作用，但當發(fā)生RA或OA時，由于HA的濃度和Mr明顯降低，對血管的生成抑制作用減小，而低Mr HA具有誘導血管生成的作用，導致病變部位毛細血管和組織增生16。HA還可作用于免疫細胞表達的HA受體，影響免疫細胞的趨化性，抑制炎癥17。2.2 臨床研究2.2.1 療效評價大量的臨床

12、報道多為每周給藥1次，37周為1療程。評價指標為嚴重度指數(shù)、關節(jié)疼痛、關節(jié)伸展度、晨僵、關節(jié)積液以及止痛藥的攝入量等。文獻報道多為肯定的結果?；颊咦⑸?3次后，癥狀獲得明顯改善。對關節(jié)疼痛的緩解最為明顯和迅速，給藥后患者馬上能夠感受到，其次是關節(jié)活動度的改善。療效與患者的嚴重度和病程具有相關性，對嚴重度較高的患者療效較差18。療效與HA的Mr也有相關性，在一定范圍內，療效與Mr呈正相關。許多試驗未設空白對照組，報道的短期觀察較多。有的雖觀察了遠期療效，但樣本數(shù)較少。張鴻逵等19報道了HA治療OA的遠期觀察，結果表明，停止治療16個月后，70%患者的臨床癥狀未復發(fā)。許多試驗將HA與其他有效的治療

13、方法做了比較20。Leardini等研究結果表明，HA 20mg的總體療效比6-甲基潑尼松龍40mg的療效還要好。HA 20mg對疼痛的緩解和關節(jié)活動度的改善作用均明顯好于超氧化物歧化酶（SOD）8mg。同時使用HA和SOD，會獲得更為滿意的效果。Kopp等發(fā)現(xiàn)，盡管HA消除顳下頜OA導致的疼痛和功能障礙的近期和遠期療效與倍他米松相似，但HA的不良反應較低而具有更好的應用前景21。HA與甾體激素或非甾體抗炎止痛藥的聯(lián)合用藥具有更好的效果。Grecomoro等在首次注射HA時，配伍地塞米松磷酸鈉0.4mg，結果表明，止痛效果與關節(jié)活動度的改善比單純用HA好得多。2.2.2 安全性評價多數(shù)臨床結果

14、表明，HA有較好的耐受性，未見明顯的不良反應。少數(shù)資料報道的不良反應多局限在注射部位，如疼痛或腫脹，極個別的患者出現(xiàn)頭痛和發(fā)熱等癥狀。不良反應常發(fā)生在注射后13d內，患者一般能夠耐受，不需處理，23d內可自行消失。不良反應的發(fā)生率多為1%10%。有的報道可高達37%，同時安慰劑組的發(fā)生率也達39%22。制劑若污染了內毒素可導致關節(jié)出現(xiàn)腫脹、疼痛加劇和積液增多，殘存的微量雜蛋白和核酸也可導致免疫反應，局部出現(xiàn)皮疹和瘙癢等癥。3 HA衍生物的制備和應用天然的HA在體內的存留時間較短，限制了其療效的發(fā)揮。尤其是近年來在預防粘連和軟組織填充等方面的應用，要求HA在體內應具有適宜的存留時間，由此激發(fā)了研

15、究者改構天然HA的興趣。HA被修飾的部位為羧基、羥基、N-乙酰氨基和還原末端，N-乙酰氨基中的乙酰基脫掉后形成的氨基可大大拓展對HA修飾的途徑和方法。目前臨床使用的HA衍生物多為對其羧基和羥基修飾而成23。3.1 碳二亞胺對羧基的修飾碳二亞胺（R1N=C=NR2）與HA的羧基反應先生成N-?；寮雍衔?，再根據需要與不同的碳二亞胺進一步加合，形成親脂、芳香族以及不同功能基的系列衍生物。常用的碳二亞胺有單碳二亞胺和雙碳二亞胺。用碳二亞胺修飾HA有一定的局限性，因為反應要求在酸性條件下進行，導致一些胺發(fā)生質子化從而親核性降低，使反應不能完成。3.2 酰肼對羧基的修飾最先應用的酰肼為己二酸二酰肼（AD

16、H），生成ADH-HA中間產物，仍保留一個酰肼，既可與HA分子中的羧基繼續(xù)反應將HA交聯(lián)，也可以與藥物反應將藥物系掛到HA分子上。常用的酰肼包括單酰肼、雙酰肼和多酰肼。多酰肼與HA反應后剩余的NH-，一部分與HA分子中其他羧基反應，使HA交聯(lián)，另一部分與藥物連接；或藥物也可以先與酰肼連接，再與HA發(fā)生反應從而系掛到HA分子上。3.3 對羥基的修飾對羥基修飾的試劑多為醛類和二乙烯基砜。Balazs等自雄雞冠提取HA之前，用甲醛處理組織，使HA分子中的羥基經醛與蛋白質反應，形成的蛋白質橋將HA鏈交聯(lián)在一起?？刂平宦?lián)程度，可制得溶液、凝膠或固體狀物。Balazs將以上產品稱為hylan A。在弱堿性

17、條件下，將hylan A用二乙烯基砜與HA再發(fā)生交聯(lián)，形成整體的網狀結構，稱為hylan B，為水不溶性物質?？刂平宦?lián)度也可獲得凝膠、膜狀或管狀等固體狀物。3.4 HA衍生物的應用3.4.1 應用于眼科手術和關節(jié)疾病的黏彈性補充療法hylan G-F 20 （Biomatrix公司出品）為一種交聯(lián)的HA，Mr大于5106，具有較好的黏彈性，作為眼科手術黏彈劑比HA具有更好的效果。Synvisc（Biomatrix 公司出品，Mr為6106）含0.8%hylan，與Orthovisc（1.5%HA，Anika公司出品，Mr為1.5106）相比，具有更高的黏彈性。由于在關節(jié)內的代謝較慢，每周用藥1

18、次，注射3次即可。而普通HA制劑要求注射5次為一療程。3.4.2 預防術后粘連HA溶液對術后粘連的預防作用機制可能如下：術中涂布于組織表面，形成保護膜可減輕手術器械對組織的損傷；保濕作用可防止組織發(fā)生干燥；壓迫出血點，抑制出血等。但是，HA溶液往往由于其在體內存留時間太短而奏效不大。Genzyme公司將HA修飾后與羧甲基纖維素結合在一起（商品名Seprafilm），在體內的存留時間明顯延長，粘連預防作用明顯提高。腹腔術后粘連預防的臨床結果表明，給藥組51%的患者未發(fā)生粘連，而對照組只有6%。HA衍生物由于具有更密集的網狀結構和較長的存留時間，組織隔離作用持久，抑制炎癥細胞的激活和聚集，減少成纖

19、維細胞、血纖蛋白原的聚集等作用均比HA強，因此具有更好的粘連預防效果24。3.4.3 軟組織修復及美容Biomatrix公司用hylan B凝膠制備的軟組織填充劑（商品名Hylaform），在體內既不降解也不轉移，具有良好的生物相容性，不致炎，不產生異物排斥等免疫反應，在體內的存留時間符合要求。在軟組織修復和消除皺紋等方面具有廣泛的應用前景。3.4.4 HA及其衍生物的給藥體系HA及其衍生物對藥物具有控釋作用。最簡單的一種，為其與藥物并不發(fā)生反應，前者僅充當一種媒介，通過其物理增黏和膜親和作用對藥物控釋；或將藥物鑲嵌在其網狀結構中，通過控制藥物的釋放速率達到控釋效果；或通過改變劑型如將其水分除

20、去形成膜，藥物被包埋于其中，在體內溶脹后，藥物的釋放速率受其網狀結構的調節(jié)；與藥物通過離子對或共價結合的方式如與藥物成鹽或酯化等與藥物形成加合物，對藥物的控釋作用更加明顯。HA作為眼用制劑的媒介已廣泛地應用，如將HA作為氯霉素、阿昔洛韋、硝酸毛果蕓香堿等滴眼液的媒介，取得好的臨床療效25。高濃度的HA與激素或抗生素制成凝膠，球內注射治療眼內炎，彌補了全身用藥局部濃度低、療效差的不足，且減少了用藥次數(shù)及由此造成的不便和痛苦。蛋白質類藥物由于iv給藥在血漿內的清除速率較快，而其他的給藥途徑又不能充分吸收，因而研制蛋白質的控釋技術及非注射給藥途徑具有很好的應用前景26。研究表明，改構HA與蛋白質連接

21、后可延長其在血漿的半衰期，或為媒介促進其在黏膜的吸收。如SOD與改構HA連接后在血漿中的半衰期明顯延長。改構HA制成的緩釋微球將胰島素吸附或包埋，鼻腔黏膜或眼黏膜給藥可達到有效的血藥濃度，開發(fā)了新的給藥途徑。利用HA與HA受體結合的原理，可研制生物粘連性脂質體（bioadhesive liposome），將HA結合到脂質體表面，在體內與特異性細胞結合，具有定向給藥的特點27。當機體發(fā)生炎癥時，HA在炎癥部位聚集。研究發(fā)現(xiàn)，經全身給藥的HA可聚集于炎癥或損傷部位，因此可開發(fā)定向給藥體系。如連接在改構HA上的激素，采用全身給藥方式時，可在炎癥部位聚集，通過此處酶的水解作用，得以釋放而發(fā)揮療效。氟尿

22、嘧啶、雙氯滅痛借助于HA可聚集于腫瘤組織，在局部發(fā)揮更強的作用28。HA在體內被淋巴結和肝臟攝取和降解，利用該原理，與HA加合的藥物可在上述組織中大量釋放，達到局部治療作用。OA或肌肉疼痛等患者使用HA與抗炎藥物加合物治療時，除采用關節(jié)腔給藥外，采用透皮給藥也可獲得明顯效果29。4 展望基礎研究已表明HA在體內的生理功能已不局限于大分子網狀結構及黏彈性等物理機械功能。HA受體的發(fā)現(xiàn)對HA的認識有了一個質的飛躍，揭示了其通過與受體的結合、調節(jié)細胞的功能從而在胚胎發(fā)育、腫瘤侵襲、組織愈合等方面扮演的重要角色。HA受體的發(fā)現(xiàn)還有助于開發(fā)新的給藥途徑。明確掌握HA代謝機制，通過發(fā)現(xiàn)其代謝異常，可對一些

23、疾病的診斷和治療具有指導意義。然而，HA的應用受檢測方法所限而不能滿足臨床需要，應在以下方面加強對HA的應用性開發(fā)。4.1 HA微量檢測技術的普及HA與腫瘤侵襲力具有相關性，腫瘤周圍基質HA與其受體含量的比值、HA與硫酸多糖含量的比值對腫瘤預后的判斷和治療具有指導意義。但HA探針（probe）測定基質所含的微量HA還局限于基礎研究領域，配套試劑沒有商品化，因此，臨床目前未開展該項工作。實際上，臨床上對血漿和尿液等HA含量較高樣本的HA濃度檢定也未開展。開展該項檢測對基質病變，RA，OA，肝硬變，腫瘤和一些炎癥的診斷和治療具有積極的作用。4.2 加強HA及其衍生物給藥體系的應用HA受體的發(fā)現(xiàn)以及

24、病變局部HA受體的表達和HA濃度明顯升高的現(xiàn)象，揭示了HA在體內可定位聚集特性。由此可制備以HA受體為靶向的定向給藥體系。可能在不久的將來，會有以HA-藥物加合物的口服或透皮吸收制劑取代關節(jié)腔給藥治療RA和OA。將來會有多種以HA及其衍生物為給藥體系的抗腫瘤藥物推出，強化了對腫瘤的局部殺傷作用，又可減少全身不良反應。4.3 拓展HA的應用領域成人創(chuàng)傷修復后的新生組織含有大量的纖維，彈性差，硬度大，疤痕明顯，臨床上稱之為“纖維性修復”；而嬰幼兒創(chuàng)傷修復后的新生組織的彈性如正常皮膚，幾乎無疤痕，得到“再生性修復”。其原因就是嬰幼兒皮膚含有高濃度、高Mr HA，具有較高的促愈合、調節(jié)成纖維細胞活性和

25、抗炎等作用。在創(chuàng)傷的早期給予大量的高Mr HA，可使成人像嬰幼兒那樣獲得再生性修復。HA具有保濕功能，應用于化妝品已多年。低Mr HA制成的透皮吸收制劑也具有較好的美容效果。但外用有一定的局限性，因為高Mr不能透皮吸收，只能作用于表層，而吸收的低Mr HA在局部處于游離狀態(tài)，不能結合到基質中去，很快從局部排泄掉。此外，衰老的特征是真皮層HA含量明顯降低出現(xiàn)褶皺所致。研究發(fā)現(xiàn)，HA口服可被吸收，提高真皮層HA的含量，對全身發(fā)揮抗皺和美膚作用。因此，研究HA的口服美膚產品具有很好的前景?？傊琀A的應用開發(fā)尚處于初期，隨著對其基礎研究的進一步深入，相信越來越多的產品會涌現(xiàn)，為人們做出應有的貢獻。參

26、考文獻1 Laurent TC, Fraser JRE. FASEB, 1992, 6:23972 張?zhí)烀瘢?凌沛學，沈渤江，等. 玻璃酸的研制及應用研究. 王鳳山，凌沛學. 生化藥物研究，北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：2722763 Wik BH, Wik O. Rheology of hyaluronan and its derivatives. Laurent TC ed. The Chemistry, Biology and Medical Applications of Hyaluronan and its Derivatives, London: Portland Press,

27、1998:25324 Pape LG, Balazs EA. Ophthalmology, 1980, 87:6995 Algvere P. Acta Ophthalmol, 1971, 49:9756 Holster A, Rolfsen W, Svensson B, et al .Curr Eye Res, 1993, 12:3597 Bernatchez SF, Camber O, Tabatabay C, et al . Use of hyaluronic acid in ocular therapy. Edman P. Biopharmaceutics of Ocular Drug

28、Delivery. Bocaraton: CRC, 1993,1051208 王韶進，賀艷麗，楊曉紅，等. 中國生化藥物雜志，1997，18（1）：129 凌沛學，蘇淮，賀艷麗，等. 中國生化藥物雜志，1996，17（6）：24210 Yoshimi T, Kikuchi T, Obara T, et al. Clin Orthop Relat Res, 1994, 298:29611 Kikuchi T, Denda S, Yamaguchi T. Jpn Pharmacol Ther, 1993, 21（Suppl 2）:15712 Denda S, Yamaguchi T, Namiki

29、 O. Jpn Pharmacol Ther, 1993, 21（Suppl 2）:16513 Gotoh S, Miyazaki K, Onaya J, et al. Folia Pharmacol Jap, 1988, 92:1714 Belmonte C, Pozom A, Balazs EA. Modulation by hyaluronan and its derivatives（hylans）of sensory nerve activity signalling articualr pain A. Laurent TC. The Chemistry, Biology and Me

30、dical Applications of Hyaluronan and its Derivatives. London: Portland Press, 1998, 20521715 Sato H, Takahashi T, Tde H, et al. Arthritis Rheum, 1988, 31:6316 West DC, Hampson IN, Arnold F, et al. Science, 1985, 228:132417 Forrester JV, Balazs EA. Immunology, 1980, 40:43518 Namiki O, Toyoshim AH, Morisaki N. Int J Clin Pharmacol Ther Toxicol, 1982, 20:50119 張鴻逵，王韶進，王永惕，等. 中國生化藥物雜志，1998，19（5）：23120 Goa KL, Benfield P. Drug Evaluation, 1994, 47:5362