實驗十七（2）煙草原生質(zhì)體融合

1、實驗十七實驗十七 （2）煙草原生質(zhì)體融合）煙草原生質(zhì)體融合一、原理一、原理 PEG帶微弱極性的負(fù)電荷，能與水、蛋白質(zhì)和碳帶微弱極性的負(fù)電荷，能與水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等具有正電荷基團(tuán)的分子形成氫鍵。在鄰近水化合物等具有正電荷基團(tuán)的分子形成氫鍵。在鄰近原生質(zhì)體表面之間起著分子橋的作用，加上原生質(zhì)體表面之間起著分子橋的作用，加上PEG滲透滲透吸水的作用，使原生質(zhì)體相互接觸在一起。吸水的作用，使原生質(zhì)體相互接觸在一起。 在洗滌過程中，直接或間接與質(zhì)膜結(jié)合的在洗滌過程中，直接或間接與質(zhì)膜結(jié)合的PEG分分子從原生質(zhì)體表面洗脫，并隨著子從原生質(zhì)體表面洗脫，并隨著pH的降低，導(dǎo)致膜電的降低，導(dǎo)致膜電荷的不平

2、衡和發(fā)生重新分布；在原生質(zhì)體荷的不平衡和發(fā)生重新分布；在原生質(zhì)體 吸水過程中，吸水過程中，發(fā)生原生質(zhì)體融合。發(fā)生原生質(zhì)體融合。二、實驗?zāi)康亩?、實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)植物原生質(zhì)體融合的方法，為進(jìn)行體細(xì)學(xué)習(xí)植物原生質(zhì)體融合的方法，為進(jìn)行體細(xì)胞雜交，培育體細(xì)胞雜種和胞質(zhì)雜種打下基礎(chǔ)。胞雜交，培育體細(xì)胞雜種和胞質(zhì)雜種打下基礎(chǔ)。三、實驗材料和用具三、實驗材料和用具1、材料：煙草、材料：煙草BY2愈傷組織，煙草組培苗愈傷組織，煙草組培苗2、用具、用具：過濾器，注射筒，不銹鋼網(wǎng)篩過濾器，注射筒，不銹鋼網(wǎng)篩（ =54 m），漏斗，三角瓶，滴管，），漏斗，三角瓶，滴管，10ml刻度離刻度離心管，血球記數(shù)板。心管，血球記

3、數(shù)板。四、實驗步驟四、實驗步驟1、配制酶液、配制酶液 各組（各組（2人）配制下列酶液各人）配制下列酶液各10ml， 4000rpm離心離心6min后過濾滅菌于無菌三角瓶中。后過濾滅菌于無菌三角瓶中。 CPW培養(yǎng)基培養(yǎng)基+0.4mol/L甘露醇甘露醇+2%纖維素酶纖維素酶 +0.5%離析酶離析酶23周齡愈周齡愈傷組織和葉傷組織和葉片各約片各約1g和和0.5g，葉片，葉片剪成細(xì)條剪成細(xì)條 加入到酶加入到酶液中、用液中、用鑷子分散鑷子分散愈傷組織愈傷組織黑暗、黑暗、 25酶解酶解56小時，小時，間歇輕輕搖間歇輕輕搖動。動。2、BY2愈傷組織和葉肉原生質(zhì)體分離愈傷組織和葉肉原生質(zhì)體分離3、過濾和離心洗

4、滌原生質(zhì)體、過濾和離心洗滌原生質(zhì)體過過濾濾800rpm離離心心3min棄上棄上清液清液加入加入3ml CPW培養(yǎng)基，用滴培養(yǎng)基，用滴管重新懸浮原管重新懸浮原生質(zhì)體生質(zhì)體800rpm離離心心3min棄上清棄上清液液,重新重新懸浮在懸浮在0.5ml CPW溶溶液中液中4、原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體融合（1）調(diào)整密度：用血球板計數(shù)后，將原生質(zhì)體）調(diào)整密度：用血球板計數(shù)后，將原生質(zhì)體的密度調(diào)整為的密度調(diào)整為106個原生質(zhì)體個原生質(zhì)體/ml。（2）配置）配置PEG融合液（無菌下）融合液（無菌下）PEG溶液：甘氨酸緩沖液：溶液：甘氨酸緩沖液：DMSO=8：1：1（3）將愈傷組織原生質(zhì)體和葉肉原生質(zhì)體等體）將愈

5、傷組織原生質(zhì)體和葉肉原生質(zhì)體等體積混合。積混合。（4）原生質(zhì)體融合步驟）原生質(zhì)體融合步驟取取0.2ml混合原混合原生質(zhì)體生質(zhì)體懸浮液懸浮液加入加入0.2ml 高鈣高高鈣高pH PEG融合液融合液靜置靜置10min5min內(nèi)緩慢內(nèi)緩慢加入加入5ml W5稀釋液，輕稀釋液，輕輕吸打混勻輕吸打混勻靜置靜置30min800rpm離離心心3min，棄上清夜棄上清夜重新懸浮重新懸浮在在0.5ml W5，靜置靜置10min（5）融合原生質(zhì)體的觀察）融合原生質(zhì)體的觀察 吸吸1滴融合的原生質(zhì)體懸浮液于血球計數(shù)滴融合的原生質(zhì)體懸浮液于血球計數(shù)板上，在顯微鏡下融合的原生質(zhì)體，統(tǒng)計融板上，在顯微鏡下融合的原生質(zhì)體，統(tǒng)

6、計融合率。合率。融合原生質(zhì)體的特征：融合原生質(zhì)體的特征：A：異源融合；：異源融合；B：同源融合：同源融合融合率融合率=融合的原生質(zhì)體數(shù)融合的原生質(zhì)體數(shù)/觀察的原生質(zhì)體數(shù)觀察的原生質(zhì)體數(shù)準(zhǔn)備下次實驗的試劑（各準(zhǔn)備下次實驗的試劑（各100ml）：）：（1）2CTAB提取緩沖液：提取緩沖液：100mM Tris-HCl（pH8.0），），2（w/v）CTAB，1.4M NaCl，40mM -巰基乙醇，巰基乙醇，20mM EDTA （2）TE緩沖液：緩沖液：10mM Tris-HCl (pH7.4), 1mM EDTA。 （3）50 TAE電極緩沖液：稱取電極緩沖液：稱取24.2gTris溶解于適量蒸餾溶解于適量蒸餾水中，加入水中，加入5.7ml冰乙酸，冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)溶溶液，液，定容到定容到100ml。（4）溶液）溶液I：50 mmol/L葡萄糖葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl（pH8.0），），10 mmol/L EDTA（pH8.0） （5）溶液）溶液