環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其在沙門氏菌檢測中的應(yīng)用2

1、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)及其在食品中沙門氏菌檢測的應(yīng)用摘要:本文主要綜述了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP）的原理、優(yōu)缺點(diǎn)及其在食品中沙門氏菌檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并展望了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食品病原菌快速檢測中的應(yīng)用前景。關(guān)鍵詞：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；LAMP；沙門氏菌Loop-mediated isothermal amplification technology and its application in the detection of salmonella in foodAbstract: The principles of Loop-mediated isothermal amplificati

2、on (LAMP) , and also its the advantages and disadvantages were introduced in this paper, as well as its recent application status in the detection of salmonella in food. Finally, the prospect of the application of the LAMP technology for rapid detection of pathogens in food was given.Keywords: Loop-

3、mediated isothermal amplification technology; LAMP; salmonella沙門氏菌病是一種最為常見的食源性疾病，是英國、澳大利亞、美國等國家主要食源性疾病的病因1。美國CDC（疾病預(yù)防與控制中心）的監(jiān)控?cái)?shù)據(jù)顯示，在2009年，沙門氏菌引起的中毒病例占細(xì)菌感染型食物中毒病例中的一半以上2。在中國內(nèi)陸地區(qū)，每年發(fā)生的細(xì)菌性食物中毒事件占中毒事件總數(shù)的30%-90%3。在引發(fā)細(xì)菌性食物中毒的病原菌中，沙門氏菌約占40%4屢居首位。從食品中分離和檢測沙門氏菌，當(dāng)前大多數(shù)國家和國際ISO標(biāo)準(zhǔn)等均沿用傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)分離方法。盡管方法證明可靠，但利用其得到陽性

4、和陰性結(jié)果需要47天，且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，在日常監(jiān)控、暴發(fā)事件病原體確定和溯源等方面存在著瓶頸。為了尋求準(zhǔn)確、快速、簡便的檢測技術(shù)和方法，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的研究，一些分子生物學(xué)技術(shù)，如PCR5、鏈置換擴(kuò)增6、依賴核酸序列擴(kuò)增及再生式序列復(fù)制反應(yīng)7等在沙門氏菌等病原菌的檢驗(yàn)與診斷方而發(fā)揮了重要的作用。然而，分子生物學(xué)技術(shù)檢測核酸對(duì)儀器設(shè)備的要求，操作程序的復(fù)雜、技術(shù)要求較高等原因限制了其作為快速診斷方法的開展與推廣。Notomi等在2000年建立的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)8 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP)解決了以上難題。目前，該技術(shù)己經(jīng)應(yīng)用于

5、沙門氏菌等病原體的快速檢測中。1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)1.1環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的原理環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(LAMP)是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異引物，利用具有鏈置換活性的Bst (嗜熱脂肪芽胞桿菌）DNA 聚合酶在恒溫條件(65 左右)保溫60分鐘，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，通過肉眼或者熒光染料SYBR Green I（EvaGreen熒光染料）染色后，在日光下進(jìn)行判定。針對(duì)靶基因擴(kuò)增產(chǎn)生各種大小的莖環(huán)狀DNA混合物，副產(chǎn)物為肉眼可見的白色焦磷酸鎂沉淀。與PCR相比，LAMP具有快速（30120分鐘），簡便（普通恒溫水箱），直觀（肉眼可以觀察結(jié)果），特異（4條引物）、

6、等溫高效（一個(gè)溫度）及不需要特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，有利于實(shí)驗(yàn)室條件較差的機(jī)構(gòu)開展食品安全相關(guān)病原體的核酸檢測。1.2引物設(shè)計(jì)由于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增是通過兩對(duì)引物即兩條外部引物和兩條內(nèi)部引物與6個(gè)不同區(qū)域的相互識(shí)別來產(chǎn)生擴(kuò)增效應(yīng)，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增對(duì)引物特異性的要求更高，設(shè)計(jì)也更為復(fù)雜。LAMP引物設(shè)計(jì)一般選取一段長約130 200bp（最長300bp，不可超過500bp）8的保守序列作為內(nèi)部引物擴(kuò)增目的序列。每條內(nèi)部引物的兩段DNA短片段通過TTTT序列連接8，也有研究結(jié)果認(rèn)為在內(nèi)部引物之間不加TTTT序列并不影響等溫?cái)U(kuò)增，說明TTTT序列在串聯(lián)內(nèi)部引物上并不是必需的9。最近Nagamine K等的研究提示

7、在LAMP反應(yīng)中加入環(huán)引物能夠明顯加快等溫?cái)U(kuò)增的速度，大大提高了檢測效率，檢測率比沒有加環(huán)引物的高7個(gè)數(shù)量級(jí)10, 11。1.3擴(kuò)增反應(yīng)DNA在65左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，任何一個(gè)引物向雙鏈DNA的互補(bǔ)部位進(jìn)行堿基配對(duì)延伸時(shí)，另一條鏈就會(huì)解離，變成單鏈12。在鏈置換DNA酶作用下內(nèi)引物與外引物依次進(jìn)行鏈置換擴(kuò)增反應(yīng)，LAMP法基因擴(kuò)增循環(huán)的起點(diǎn)結(jié)構(gòu)即兩端莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈得以形成，反應(yīng)正式開始。由于反應(yīng)過程中內(nèi)外引物的作用不同，內(nèi)、外部引物濃度的比例要進(jìn)行優(yōu)化，各成分的最佳濃度具有不確定性。一般來說，內(nèi)部引物和外部引物的濃度比為1 : 41 : 1013。1.4結(jié)果判定環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增結(jié)果判定主要方法

8、有：（1）電泳，將擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后在紫外燈下觀察可見擴(kuò)增產(chǎn)物呈梯狀條帶；（2）直接觀察擴(kuò)增管的濁度。研究發(fā)現(xiàn)LAMP陽性擴(kuò)增管反應(yīng)后形成副產(chǎn)品焦磷酸鎂，而沒有發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)的陰性管中沒有副產(chǎn)品焦磷酸鎂產(chǎn)生，因此陽性管的濁度比陰性管高，經(jīng)高速離心后出現(xiàn)更為明顯的白色沉淀，陰性對(duì)照管則沒有白色沉淀14；（3）加入染料直接用肉眼判定結(jié)果。有研究者向其擴(kuò)增產(chǎn)物中加入能摻入到雙鏈DNA中的熒光染料SYBR Green I，發(fā)現(xiàn)電泳結(jié)果陽性管加入染料后顏色變?yōu)榫G色，而沒有目的DNA片段擴(kuò)增的陰性對(duì)照管顏色沒有發(fā)生變化，這一發(fā)現(xiàn)使得LAMP結(jié)果的判定更為簡捷13, 15, 16。（4）利用專門的儀器。日本榮研株

9、式會(huì)已經(jīng)利用LAMP反應(yīng)過程中會(huì)生成白色沉淀副產(chǎn)物焦磷酸鎂這一特點(diǎn)，研制出專門用于LAMP檢測的實(shí)時(shí)監(jiān)控終點(diǎn)濁度儀，它可以實(shí)現(xiàn)對(duì)LAMP擴(kuò)增過程的全程實(shí)時(shí)監(jiān)控。從而使擴(kuò)增和檢測一管一步完成。2 LAMP的技術(shù)特點(diǎn)2.1 LAMP的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：反應(yīng)迅速高效，不需要雙鏈DNA的預(yù)熱變性，核酸擴(kuò)增一般在1h內(nèi)均可完成。這對(duì)于快速診斷十分重要，便于醫(yī)生及時(shí)獲得臨床檢驗(yàn)結(jié)果、決定治療方案。與定性PCR相比，LAMP法的檢測率要比其高出12個(gè)數(shù)量級(jí)，具有熒光實(shí)時(shí)定量 PCR同樣的靈敏度，能滿足低拷貝數(shù)樣品的檢測，擴(kuò)增產(chǎn)物靶序列可達(dá)到109以上。有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)引物的加入使得其檢測的靈敏度更高，在極低模板量(0

10、.01 PFU)即可獲得結(jié)果11。由于是針對(duì)靶序列6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，6個(gè)區(qū)域中任何區(qū)域與引物不匹配均不能進(jìn)行核酸擴(kuò)增，故其特異性極高。擴(kuò)增過程不需特殊儀器，擴(kuò)增結(jié)果判定不需要對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳，而可直接用肉眼觀察擴(kuò)增管濁度，或通過向其擴(kuò)增產(chǎn)物中添加熒光染料再通過顏色變化來判定結(jié)果，操作簡單。2.2 LAMP的技術(shù)缺點(diǎn)引物設(shè)計(jì)有難度，尤其對(duì)GC含量低的短片段。引物設(shè)計(jì)涉及6個(gè)區(qū)域的4條特異性引物，要避免引物之間二聚體的形成。長引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不同引物不同的熔解溫度，F(xiàn)2/B2，F(xiàn)3/B3的3端和F1c/B1c的5端的自由能最佳改變值等因素17都要考慮。試劑價(jià)格高，所使用的酶為具有鏈置換活性

11、的Bst DNA 聚合酶，反應(yīng)體系有時(shí)需要加甜菜堿、硫酸銨優(yōu)化以獲得更高的反應(yīng)速率。極其微量的核酸污染即可造成結(jié)果的假陽性的可能。擴(kuò)增產(chǎn)物為混合物，克隆純化有難度。3 LAMP技術(shù)在食源性沙門氏菌檢測中的應(yīng)用分離培養(yǎng)方法檢測沙門菌需要經(jīng)過非選擇性增菌、選擇性增菌、篩選可疑菌落、生化和血清學(xué)鑒定這幾個(gè)步驟，得到陰性結(jié)果往往需要4天左右，檢出沙門菌至少需要7天；血清學(xué)鑒定也存在效價(jià)低，試劑昂貴等不足之處。LAMP方法可以在24 h 內(nèi)檢出食品中的沙門菌，相比分離培養(yǎng)法更快速，這對(duì)于生鮮食品的安全檢測和食物中毒的快速檢測具有一定的意義。Hara-Kudo Y 等利用LAMP對(duì)沙門氏菌亞種腸道菌的39

12、個(gè)血清型220株分離株和沙門氏腸道菌亞種的7株分離株進(jìn)行了檢測，根據(jù)反應(yīng)體系的濁度變化以及其中熒光染料熒光強(qiáng)度的變化檢測產(chǎn)物，結(jié)果顯示，全部220株沙門菌得到陽性結(jié)果，反應(yīng)特異性高，該法的檢測限為2.2 cfu/反應(yīng)管9。Ohtsuka等18利用LAMP方法檢測雞蛋清中的沙門菌，并采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法和PCR方法進(jìn)行平行檢測，結(jié)果顯示， LAMP方法和培養(yǎng)方法都成功地檢測出全部110個(gè)樣品中的沙門菌，PCR方法漏檢了其中10%的陽性樣品，但相比于培養(yǎng)方法， LAMP方法速度更快，檢測靈敏度更高，更具有實(shí)用意義。萬進(jìn)等19以沙門氏菌高度保守基因fimY基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計(jì)兩對(duì)引物（F3&B3、

13、FIP&BIP），建立LAMP反應(yīng)體系。經(jīng)試驗(yàn)分析對(duì)體系特異性、Mg2+濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化和摸索，對(duì)35株臨床菌株均檢出達(dá)100，其他陰性菌株基因組均無檢出，在人工添加樣品檢測得其在牛奶中靈敏度為33CFU/管。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法耗時(shí)少、具有高特異性，適合牛奶中沙門氏菌污染的快速檢測。王羽等20針對(duì)沙門氏菌的特異基因 invA 基因設(shè)計(jì)兩對(duì)LAMP引物，建立LAMP檢測沙門氏菌的新方法，并對(duì)肉及肉制品中的沙門氏菌進(jìn)行檢測。結(jié)果表明：建立 LAMP 技術(shù)檢測肉及肉制品中沙門氏菌的方法，該方法能夠特異檢測沙門氏菌，且靈敏性可達(dá)10-9CFU/mL，對(duì)48份樣品檢測，該方法

14、檢出率為91.6%、敏感性 100%、特異性70.0%、符合率為93.8%、檢出時(shí)間1.5h。在食品檢測中，LAMP法是對(duì)沙門菌屬的通用檢測方法，但不能進(jìn)一步鑒定分型和分離菌株是其不足之處；故可以將LAMP方法配合傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法對(duì)食品中沙門氏菌進(jìn)行食品衛(wèi)生檢測，LAMP檢測發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果后再利用分離培養(yǎng)法進(jìn)行沙門菌的鑒定分型和菌株分離。4 展望LAMP技術(shù)在提高PCR等分子生物學(xué)方法的特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，克服了模板的熱變性、長時(shí)間的溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等復(fù)雜過程的缺點(diǎn)，不需要昂貴儀器設(shè)備，操作更為簡便，為食源性致病菌的檢測提供了新的技術(shù)方向。目前 LAMP 技術(shù)的研究主要集中在產(chǎn)物

15、檢測的方便性和反應(yīng)速度上，各國科技工作者都在努力提高反應(yīng)速度、縮短反應(yīng)時(shí)間、找到簡便的產(chǎn)物檢測方法，以更好地應(yīng)用于基層臨床診斷和現(xiàn)場檢測。憑借其操作簡單、特異性強(qiáng)、可以在短時(shí)間內(nèi)快速獲得大量特異性擴(kuò)增產(chǎn)物、擴(kuò)增產(chǎn)物易判斷、不需要昂貴的儀器和試劑等優(yōu)點(diǎn)，LAMP 技術(shù)非常適用于食品中即時(shí)、快速簡便的大樣本量檢測要求，在食品病原微生物檢測領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用前景?？傊?LAMP技術(shù)將來有望成為國內(nèi)應(yīng)對(duì)突發(fā)公共食品安全事件的有力檢測手段。參考文獻(xiàn)1Scallan E, Hoekstra R M, Angulo F J, et al. Foodborne Illness Acquired in t

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