細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟及說明

1、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的詳細(xì)步驟及說明細(xì)胞遷移(cell migration):也稱為細(xì)胞移動(dòng)、細(xì)胞爬行或細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，是 指細(xì)胞在接收到遷移信號(hào)或感受到某些物質(zhì)的梯度后而產(chǎn)生的移動(dòng)。它參與到很多生理和病理的活動(dòng)中，如下：免疫：如淋巴細(xì)胞的定向遷移是其分化成熟和發(fā)揮功能的關(guān)鍵之一；炎癥：炎癥反應(yīng)最重要的功能是將白細(xì)胞送到炎癥灶，白細(xì)胞遷移到炎癥 部位并發(fā)揮其吞噬和組織損傷作用；腫瘤轉(zhuǎn)移：腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤惡化后最常見的活動(dòng)，如侵入淋巴管、血管后 隨脈管系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；損傷修復(fù)：當(dāng)機(jī)體發(fā)生損傷時(shí)，免疫細(xì)胞和血小板會(huì)遷移到損傷部位，參 與消炎和凝血；胚胎發(fā)育：胚胎期不同類型祖細(xì)胞遷移至特異靶位以保證各組織、器官的

2、 正常發(fā)育。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的基本原理：在融合的單層細(xì)胞上人為制造一個(gè)空白區(qū)域，稱為“劃痕/傷口”，邊緣的細(xì) 胞會(huì)逐漸進(jìn)入空白區(qū)域使"劃痕/傷口 ”愈合。因其類似體外傷口愈合過程，又名 傷口愈合實(shí)驗(yàn)(Wound-Healing Assay),廣泛用于可以觀察藥物、基因等外源因素對(duì)細(xì)胞遷移和修復(fù)的影響。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)過程:在體外培養(yǎng)皿或平板培養(yǎng)的單層貼壁細(xì)胞上，用微量槍頭或其它硬物在細(xì)胞生長的中央?yún)^(qū)域劃線，去除中央部分的細(xì)胞，然后再繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至實(shí)臉設(shè) 定的時(shí)間（可有不同時(shí)間點(diǎn)），取出細(xì)胞培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察周邊細(xì)胞是否遷 至中央劃痕區(qū)，并拍照。具體實(shí)驗(yàn)步驟：1 .培養(yǎng)板劃線標(biāo)記用marke

3、r筆在6孔板背后畫橫線（用直尺比著），每孔至少穿過5條線， 每條線均勻且平行。2 .細(xì)胞鋪板在孔內(nèi)接種約5-10*105個(gè)細(xì)胞（可根據(jù)細(xì)胞的生長快慢調(diào)整接種數(shù)量），原 則為過夜后細(xì)胞能夠長滿，切記一定要鋪勻（細(xì)胞鋪板均勻技巧可參考往期內(nèi) 容）。3 .細(xì)胞劃線第二天用20uL槍頭（滅菌）或牙簽，垂直孔板背后的黑線劃痕，使劃痕與標(biāo) 記線相交。Tips :減少劃痕距離的誤差辦法 不同孔之間最好使用同一只槍頭或牙簽； 槍頭要垂直，不能傾斜，劃痕時(shí)可比著直尺； 最好保持力度一致，盡量一次性劃完。4 .洗細(xì)胞，去除劃下的細(xì)胞劃線完成后，使用無菌PBS洗細(xì)胞2-3次，去除劃下的細(xì)胞，使留下的間 隙肉眼即清晰

4、可見，然后更換新鮮無血清或低血清(<2%)的培養(yǎng)基。Tips :在用PBS緩沖液沖洗時(shí)，注意貼壁慢慢加入，以免沖散單層貼壁細(xì)胞；為了避免細(xì)胞數(shù)量和狀態(tài)受到影響，盡量不要用吸泵，可用移液槍緩慢 吸走。5 .細(xì)胞培養(yǎng)與觀察將細(xì)胞放入37C。，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間點(diǎn)，如0,6. 12, 24小時(shí)后取出細(xì)胞,在顯微鏡下觀察并拍照。6.數(shù)據(jù)分析使用Image J軟件打開圖片后，隨機(jī)劃取6至8條水平線，計(jì)算細(xì)胞間距離的均值。注意事項(xiàng)1,劃痕實(shí)驗(yàn)一般選擇6孔板?因?yàn)?孔板大小適中，可保證有相當(dāng)距離的 平直劃痕，便于觀察;當(dāng)然若是需要高通量初篩時(shí)，也可以用12或者24孔板。2,細(xì)胞的接種密度原則一般是過夜為100%融合，若過夜后細(xì)胞未100% 融合，雖可以適當(dāng)延長培養(yǎng)時(shí)間，但因細(xì)胞密度已經(jīng)很大，所以細(xì)胞狀態(tài)會(huì)逐 漸變差，后續(xù)細(xì)胞可能不遷移而是凋亡。3,降低細(xì)胞增殖對(duì)遷移造成的假陽性結(jié)果的方法：使用無血清或低血清培養(yǎng)基(<2%)可降低細(xì)胞增殖對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響； 一般認(rèn)為24h為細(xì)胞的一個(gè)周期，在選取合適的時(shí)間點(diǎn)(6, 12, 24h)檢測 劃痕寬度時(shí)，最好不要超過細(xì)胞一個(gè)周期的時(shí)間;如果要單純考慮細(xì)胞遷 移,可以先用絲裂霉素(1pg/ml)處理1h,抑制細(xì)胞的分裂。4,確保拍照的觀察