非接觸式共培養(yǎng)技術在體外細胞實驗中的初步應用

1、    非接觸式共培養(yǎng)技術在體外細胞實驗中的初步應用            作者：時間：2007-11-22 14:50:00                           

2、             作者：趙學銘，劉易欣，倪春生，趙秀蘭，孫 濤，古強，孫保存 【關鍵詞】  ,間充質干細胞；惡性黑色素瘤；非接觸式共培養(yǎng),    摘要  目的  研究與惡性黑色素瘤細胞進行非接觸式共培養(yǎng)的間充質干細胞表型變化，從而明確非接觸式共培養(yǎng)體系可以應用于兩種細胞之間相互作用的研究。        方法  利用Transwell進行非

3、接觸式共培養(yǎng)，分析間充質干細胞形態(tài)變化，利用免疫組織化學與免疫熒光檢測其因子和CD34表達。        結果  間充質干細胞在非接觸式共培養(yǎng)體系中可以被惡性黑色素瘤細胞誘導為多角形或短梭形，同時因子和CD34表達上調。        結論  初步表明與惡性黑色素瘤細胞非接觸式共培養(yǎng)的間充質干細胞中部分細胞表型發(fā)生改變，明確非接觸式共培養(yǎng)體系可以應用于MSC和惡性黑色素瘤細胞之間相互作用的研究。      

4、;  關鍵詞  間充質干細胞；惡性黑色素瘤；非接觸式共培養(yǎng)               Primary application of in vitro cell research by indirect coculture system              Abstract  Objective  To

5、 study the phenotype change and interactions of mouse bone marrowderived mesenchymal stem cells induced by B16, a mouse malignant melanoma cell line.        Methods  Indirect coculture was based on transwell system to analyse the phenotype change of MSC. Determinat

6、ion of the expression of  factors and CD34 by immunohistochemistry and immunofluorescence.        Results  MSC was form in polygon and fusiform induced by B16. Then the immunohistochemistry and immunofluorescence staining show factors and CD34 was upregulation

7、 of MSC.         Conclusion  The results of the indirect coculture experiments with B16 cell and MSC in vitro can initially confirm that parts of the MSC transform their phenotype, it means that indirect coculture system may used in cell interaction research in vit

8、ro.        Key words  mesenchymal stem cells; malignant melanoma; indirect cocuuture               間充質干細胞（mesenchymal stem cells, MSC）是指存在于骨髓基質中的非造血組織的另一類重要的干細胞，它最顯著的生物學特征是既有自我更新的能力，又具有向多種中胚層和神經外胚層來源的組織細胞分

9、化的潛能1,2。它有著廣泛的來源，包括骨髓、骨骼肌、軟骨、骨、肌腱等，故在干細胞研究領域中具有突出的優(yōu)勢及非常重要的理論研究意義和臨床應用價值。        筆者希望通過進行MSC細胞和惡性黑色素瘤細胞的非接觸式共培養(yǎng)，觀察不同培養(yǎng)條件下的MSC形態(tài)，檢測多種指標免疫組織化學染色結果、分析差異，初步表明與惡性黑色素瘤細胞非接觸式共培養(yǎng)的MSC中部分細胞表型發(fā)生改變，明確非接觸式共培養(yǎng)體系可以應用于MSC和惡性黑色素瘤細胞之間相互作用的研究。        1  材

10、料與方法        2  實驗結果        實驗中單獨培養(yǎng)對照組可見有大量緊密貼壁生長的細胞，貼壁細胞形態(tài)主要表現為梭形細胞，胞核呈卵圓形，細胞形態(tài)較一致，為成纖維細胞樣形態(tài)，呈較典型的MSC形態(tài)。非接觸式共培養(yǎng)組部分MSC細胞光鏡下為成纖維細胞樣形態(tài)；部分細胞為多角形或短梭形，邊界清晰，大小較均勻，胞核圓形或橢圓形，位于細胞中央，見圖1和圖2。        

11、60;     非接觸式共培養(yǎng)體系中B16細胞對MSC細胞的誘導分化作用實驗中，經對比觀察單獨培養(yǎng)對照組（表1）與非接觸式共培養(yǎng)組（表2）中96孔MSC細胞IHC和免疫熒光結果，呈現單獨培養(yǎng)對照組CD34陰性（陽性率4.8%），因子陰性（陽性率5.5%）；呈現非接觸式共培養(yǎng)實驗組CD34陽性（陽性率50.9%），因子陽性（陽性率42.2%），見圖36。并應用SPSS統(tǒng)計軟件進行2檢驗分析共培養(yǎng)組與對照組在CD34和因子這2個指標間平均陽性細胞數的差別（表3），結果表明實驗組與對照組在CD34和因子這2個指標上差異有非常顯著性（P<0.01）。

12、60;       表1  單獨培養(yǎng)對照組MSC細胞兩種檢測指標  略     表2  非接觸式共培養(yǎng)組MSC細胞兩種檢測指標  略    表3  共培養(yǎng)組與對照組MSC細胞兩種檢測指標表達差異略        圖1  圖6  略        3  討論   

13、;     本實驗中培養(yǎng)的間充質干細胞緊密貼壁生長，形態(tài)較均一，其形態(tài)特征基本上為梭形的成纖維細胞狀，符合骨髓間充質干細胞形態(tài)3。細胞CD34及因子陰性，排除了造血細胞和內皮細胞的可能性4,5。綜合分析上述結果證明本次實驗中對照組培養(yǎng)的細胞符合小鼠骨髓間充質干細胞的特點，是未產生分化小鼠骨髓來源間充質干細胞。        血管內皮是指血管內壁覆蓋的一層上皮細胞，具有許多重要標志，主要包括：因子關聯(lián)抗原（von willebrand factor，vWF），可以由全身所有血管內皮細胞產生，檢測這一因子主要

14、用相應的抗體。vWF具有很高的特異性，通常認為它是反映內皮細胞的最好指標6，如人的vWF抗體對牛的內皮細胞沒有交叉反應。        本次實驗中非接觸式共培養(yǎng)組中MSC細胞光鏡下    部分細胞為多角形或短梭形；IHC和免疫熒光結果呈現CD34陽性，因子陽性，并且通過統(tǒng)計分析得到共培養(yǎng)組與對照組在CD34和因子2個指標上差異均有非常顯著性（P<0.01）。以上結果初步證實與B16非接觸式共培養(yǎng)的MSC部分細胞發(fā)生向內皮細胞方向分化。     

15、60;  此次實驗采用了非接觸式共培養(yǎng)7，此種培養(yǎng)體系排除了以往接觸式共培養(yǎng)的細胞混雜不利于后期觀察和區(qū)分結果的弊端，細胞分類明確，變化一目了然。而且當培養(yǎng)體系中細胞間相互作用需要通過建立細胞間緊密連接和（或）需要采用旁分泌的作用方式時，則不會引起靶細胞變化。根據非接觸式共培養(yǎng)體系的特點，可以進一步推測B16細胞是否通過向共同培養(yǎng)體系中分泌較高含量的某種或某些細胞因子對MSC產生作用，導致MSC的分化。        綜上所述，本研究通過體外進行的非接觸式共培養(yǎng)實驗，初步表明與惡性黑色素瘤細胞非接觸式共培養(yǎng)的MSC中部分細胞

16、表型發(fā)生改變，明確非接觸式共培養(yǎng)體系可以應用于兩種細胞間相互作用及作用方式的研究。雖然，本研究還無法說明B16誘導MSC分化的具體方式以及確切機制，但是筆者認識了MSC在血管形成中的作用，以及非接觸式共培養(yǎng)體系在研究細胞間相互作用及作用方式的重要作用。        參考文獻        1 Minguell JJ, Erices A, Conget P.Mesenchymal stem cells. Exp Biol Med，2001，226（6）:507-520.

17、60;       2  Friedenstein AJ, Gorskaja JF,Kulagina NN. Fibroblast precursors in normal and irradicated mouse hematopoietic organs. Exp Hematol，1976，4（5）:267-274.        3  Guo ZK,Yang JQ, Liu XD, et al.Biological properties of mesenchy

18、mal stem cells derived from bone marrow.Chin Med J，2001，114（6）:950-953.        4  Huss R, Lange C, Weissinger EM,et al.Evidence of peripheral bloodderived,plasticadherent CD 34 （-/low）hematopoietic stem cell clones with mesenchymal stem cell characteristics. Stem Cells，2000，18（1）:252-260.