采用腺病毒作為豬用疫苗的研究進展載體.docx

1、采用腺病毒作為豬用疫苗的研究進展載體智海東（中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱150001）DOI:10.3969/J.ISSN,1671-6027.2012.03.002疫苗是獸醫(yī)學中最有效和最便宜的預(yù)防工具?，F(xiàn)實的獸醫(yī)領(lǐng)域不僅理想的疫苗很少，許多疫苗效力有限或布毒副效應(yīng)，而旦仍有一些嚴重疾病尚無有效疫苗。傳統(tǒng)的疫苗包括滅活疫苗、弱毒疫苗和亞單位疫苗。近期已采用基因工程技術(shù)改進和設(shè)計新型疫苗。腺病毒可誘導抗插入外源基因編瑪抗原的體液、黏膜和細胞免疫應(yīng)答，現(xiàn)已成為表達和運送外源免疫蛋白的候選載體之一，用于開發(fā)各種動物的疫苗，尤其是豬用的載體疫苗。本文總結(jié)了作為豬用載體疫苗的研究進展以及腺病

2、毒載體的生產(chǎn)和純化進展與策略。1引言傳統(tǒng)免疫使用的疫苗滅活疫苗、弱毒疫苗或亞氓位疫苗。滅活疫苗也稱“死苗”，含有處理過不能夏制的微生物，它們不能在細胞質(zhì)中刺激蛋白產(chǎn)生，因此病毒抗原不能被MHC-I類分f呈遞，不能產(chǎn)生細胞毒性CD*T細胞。弱毒疫苗在誘導包括細胞毒性CD"T細胞在內(nèi)很大數(shù)覺的相關(guān)效應(yīng)機制方面通常效力較高，但弱毒疫苗有時有殘余毒力.或通過突變成為有致病性的推株重新出現(xiàn)。亞單位疫苗本身要比依靠整個微生物制備的疫苗安全，但是它們的免疫原性不強,在誘導MHC-I類特異性應(yīng)答上很困難。因此疫苗研發(fā)仍是免疫學的一個重要目標。目前還需要進一步改進現(xiàn)有疫苗的不足來減少疾病對動物生產(chǎn)的經(jīng)

3、濟影響。理想的疫苗應(yīng)在預(yù)防感染中100%有效，但現(xiàn)實并非如此。一種疫苗.應(yīng)在單次接種后的數(shù)日至兒周內(nèi)能提供超過90%的保護力，就是非常好的疫苗了。為了降低再免疫帶來的成本，應(yīng)該研制-種接種次數(shù)最少、免疫持續(xù)期最K的免疫程序°多數(shù)病毒是通過黏膜表面入侵的，因此，通過黏膜途徑運送，即鼻內(nèi)或口服運送應(yīng)作為疫苗設(shè)計的首選。疫苗應(yīng)該安全不引起任何副反應(yīng)，比如免疫抑制或干擾同時接種其它疫苗的免疫應(yīng)答。當然，理想的疫苗還應(yīng)具備遺傳和熱穩(wěn)定性。遺傳穩(wěn)定是確保疫苗病毒毒力不會返強的基礎(chǔ)；由于疫苗從生產(chǎn)到運送并不總是能維持在冷鏈中，因此熱穩(wěn)定性顯得尤為重要。若疫苗能夠在幼齡時接種.即先天免疫和被動免疫存

4、在時進行，最為理想。理想疫苗最為重要的特點就是高效和低成本,也是疫苗研究迫尋的目標。腺病毒（Ad）是免疫原性很強的高效疫苗載體，町誘導對Ad載體表達抗原特異的CD"和CD*-T細胞的能力。雖然對Ad免疫后免疫應(yīng)答的動力學和本質(zhì)的了解很少，但已發(fā)現(xiàn)Ad載體具有：（1）運送大最抗原至淋巴組織的能力；（2）誘導CD8*T細胞的快速擴增,并遷移至整個淋巴組織的能力;（3）產(chǎn)生持續(xù)和高水平的CVT細胞應(yīng)答的能力。采用rAd作為獸用疫苗有許多優(yōu)點：（1）它們可以感染很大一類分裂或非分裂細胞;（2）Ad感染隨處可見，通常并不引起顯著或嚴戒地臨床癥狀；（3）它們可經(jīng)口服接種；（4）對Ads的基因組已

5、研究的很明確；（5）它們可容納36kb的外源基因；（6）它們的基因組很少整合入宿主染色體;（7）現(xiàn)在構(gòu)建rAd載體的技術(shù)已很成熟；（8）它們可在互補細胞系上復(fù)制，并達到很高的滴度。2Ad生物學Ad是6090nm無囊膜的20面體病毒,有大約36kb的線性雙鏈DNA基因組。根據(jù)病毒染色體基因組復(fù)制的前后，可將其基因組分為早期（E）和晚期（L）表達基因。E1基因產(chǎn)物涉及控制病毒基因的轉(zhuǎn)滎,關(guān)閉細胞蛋白和細胞轉(zhuǎn)化。E2基因編碼的蛋白涉及病毒復(fù)制，包括涉及DNA延長的I個DNA結(jié)合蛋白（E2A）和1個DNA聚合酶（E2B）；E3基因?qū)d的復(fù)制必不可少，編碼干擾宿主抗病毒感染免疫應(yīng)答的蛋白；地后E4基因

6、涉及由早期到晚期基因表達的轉(zhuǎn)換，關(guān)閉宿主細胞基因的表達,病毒復(fù)制并組裝成病毒粒子。第一代載體通常缺失它們的E1和E3區(qū).可是當在293細胞生產(chǎn)時，在第一代Ad載體的左末端與細胞基因組中與E】基因序列部分重疊的區(qū)域之間會發(fā)生重組，導致產(chǎn)生E1陽性復(fù)制全能的Ad（RCA）,如果想要非岌制型載體這是個重要的安金性問題。第二代載體是復(fù)制缺陷型Ad,進一步的缺失了E2A、E2B或E4,免疫原性和RCA產(chǎn)生均下降，但是構(gòu)建與這些載體互補穩(wěn)定細胞系的操作非常繁瑣，導致細胞生長差病毒滴度低。rAd載體已被開發(fā)為發(fā)制全能型的載體，將外源抗原的表達盒替代E3基因，或作為復(fù)制缺陷型病毒,用抗原表達盒來替代E1基因。

7、盡管更偏向于采用復(fù)制缺陷型病毒.但不同的研究支持在獸醫(yī)上采用RCA,因為報道在免疫后復(fù)制缺陷型病毒誘導黏膜免疫和保護抵抗呼吸道攻擊的能力有限?，F(xiàn)已知依麻RCA的疫苗具有克服母源獲得免疫的潛力。3腺病毒用于豬的免疫3.1豬瘟痛毒豬瘟（CSF）是豬的一種嚴如的病毒性傳染病死亡率很高.在豬和野豬密度高的地區(qū)很難控制，在集約化養(yǎng)豬地區(qū)是最重要的疾病。因此被列為國際貿(mào)易中最重要的A類傳染病。當前在世界很多地區(qū)仍進行預(yù)防性免疫，因此急需開發(fā)出在家豬和野豬中能控制CSFV的高效疫苗。新型疫苗研發(fā)包括采用不同策略來運送主要囊膜盅白E2,多數(shù)的中和抗體抗E2蛋白。Hammond等構(gòu)建了首株表達E2蛋白的rPAd

8、,并采用lOVCIDJ動物在組織培并上清中以單劑快接種。當皮下接種時，可足夠完全保護豬抵抗皮下攻擊。后來又發(fā)現(xiàn)采用口服攻擊時.僅有60%的動物得到保護，近期研究結(jié)果表明采用rPAd以1(YTODJ動物給豬口服免疫2次，可獲得徹底的保護。3.2偽和犬痍卓偽狂犬病毒(PrV)是一種a皰疹病毒.可在豬上引起經(jīng)濟性更要和廣泛傳播的偽狂犬病cPrV是一種高度嗜神經(jīng)病毒，可在其天然宿主豬以及很大類其它動物種類引起神經(jīng)系統(tǒng)與呼吸道的并發(fā)癥?，F(xiàn)已普遍采用弱毒疫苗或全病毒滅活疫苗來進行抗偽狂犬病的免疫°可是新生動物的免疫經(jīng)常受到母源抗體存在的影響.抑制對此兩種疫苗的免疫應(yīng)答。采用構(gòu)建的攜帶單個PrV基

9、因的rAd疫苗可作為一個安全替代。PrV的慵蛋l(fā)ilgB.gC和gD在誘導抗病毒感染的保護性免疫應(yīng)答中起亟荽作用，因此成為候選蛋白。現(xiàn)已表明采用攜帶此3個基因復(fù)制全能的HAd5以1砂IO“TCJDa/動物給小豬在出生后IH齡進行肌肉接種，無論有無母源抗體，產(chǎn)生相似的中和抗體應(yīng)答，在16周后攻毒仍可獲得部分保護。對于在出生后數(shù)月就宰殺的豬來講，出生時免疫一次即可提供足夠持續(xù)期的保護“最后采用2mL含有WqCIDe表達PrVgD基因rPAd的澄清組織培養(yǎng)液上清經(jīng)皮下免疫2次,可保護豬抵抗攻擊。病理剖檢在免疫-次豬的肺臟寺可見的肺炎損傷，而在免疫兩次豬的肺臟則無病變。3.3口玷疫癰毒口蹄疫(FMD)

10、是種在包括家養(yǎng)反芻獸、豬和超過70多種野生動物偶蹄件的嚴重的、臨床急性、水泡樣疾病。一只豬可在很短時間內(nèi)釋放相當于3000頭牛產(chǎn)生的氣霧病毒,因此豬被當作此病傳播的個重要因素，當在一個有商密度免疫空白動物的無FMD國家暴發(fā)FMI)時，其經(jīng)濟和社會影響可以說是災(zāi)難性的。當前的疫苗是采用濃縮的病毒感染細胞培養(yǎng)上清經(jīng)化學滅活的制備物“可是無FMD國家通常禁止使用疫苗.因為缺乏可切實將免疫動物與感染動物區(qū)分出來確定的診斷檢驗。現(xiàn)有疫苗僅可在免疫后大約7日誘學保護性應(yīng)答，這對于無FMD國家非常重要，一旦FMD暴發(fā).迅速控制并預(yù)防疾病傳播是最關(guān)鍵的。因此需要開發(fā)出依靠迅速誘導保護的疾病控制策略.Mayer

11、等構(gòu)建了株復(fù)制缺陷型HAd5載體,含有來FMDVA12株的核衣殼多肽P1和病毒3C蛋白酶編碼區(qū)域，這對于將P1加工為衣殼蛋白VP0.VP3和VP1是必須的。他們觀察到以1x10*PEU/動物在PBS中給豬免疫.產(chǎn)生抗FMDV結(jié)構(gòu)果白的抗體和FMDV特異性的中和抗體應(yīng)答，在初免后4周再采用5xIWFU/動物在PBS中進行第二次免疫抗體會稍微加強。此免疫程序可給豬提供顯著程度地保護.6頭豬中有5頭徹底保護，另外】頭的發(fā)病癥狀顯著減輕。后來Moraes等表明采用表達來自FMDVA24株P(guān)1編碼區(qū)的復(fù)制缺陷型HA(I5以5x10WU/動物在PBS中接種一次，可在免疫后的7、14或42日完全保護豬抵抗同

12、源強誰的攻擊。因為有效的免疫是禰株依賴的，采用-種血清型感染并不能提供對另一種的保護，因此乂開發(fā)出了»Ad5的雙順反于載體疫苗.這降低了開發(fā)多價FMD腺病毒載體疫苗的成本。為了構(gòu)建這些載體，采用了來自FMDVA24株和01株的核衣殼蛋白編碼區(qū)P】以及A12株的3C蛋白酶編碼區(qū)。可是采用雙順反子疫苗以2.5x10WFU/動物在PBS中免疫，誘生的中和抗體應(yīng)答要比商品化FMD疫苗或單價Ad-A24疫苗誘導的應(yīng)答明顯低。根據(jù)FMDV對干擾素(IFNa/B)高度敏感的情況，近期采用復(fù)制缺陷型HA<15開發(fā)出了一個新型策略?，F(xiàn)已表明以10TFU/動物免疫后的24h采用FMDV強毒進行攻擊

13、，此策略可獲得完全的保護。3.4豬繁殖與號甄侏合征痛毒豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是一種經(jīng)濟性很重要的豬的傳染病，在全球分布，以修豬生殖失敗和未斷奶仔豬和生長豬的呼吸道疾病為特點。感染豬和清潔豬的在接接觸是PRRSV傳播的主要途徑。由PRRSV感染導致的肺炎在青年豬要比成年豬更嚴重，若并發(fā)細菌感染會更夏雜oGonin等觀察到在PRRSV感染豬體內(nèi)存在的與中和作用有關(guān)的循環(huán)抗休主要針對GP.囊膜蛋白。Gagnon等構(gòu)建了一株表達Gl蛋白的復(fù)制缺陷型HAd5,并采用此毫組病毒以5x1伊xlOTFU/動物在含有IOOjaLPBS和100aL濃度為0.02%沙姆1017的混合物給豬進行2次肌肉注射。

14、發(fā)現(xiàn)豬在加強免疫后14d進行鼻內(nèi)病毒攻擊時.已產(chǎn)生了高水平的抗GP,蛋白抗體。而且免疫豬呈現(xiàn)出特異性的免疫記憶應(yīng)答，在PRRSV感染后，導致針對其實病毒GP,蛋白的中和性表位記憶細胞快速的克隆增殖。3.5傳染性胃炎癰*傳染性胃腸炎病毒(TGEV)nf感染新生仔豬的腸道和呼吸道組織，導致接近100%的死亡率。TGEV感染上皮細胞并在一些情況下可感染肺臟巨噬細胞?，F(xiàn)已開發(fā)出兒種滅活和致弱的商品化TGEV疫苗.這些疫苗都不能對仔豬提供完全保護，現(xiàn)正在嘗試開發(fā)有效的重組TGEV疫苗°現(xiàn)已鑒定纖突S蛋白是TGEV中和抗體的主要誘生物，并介導TGEV結(jié)合于其細胞受體上。這樣表達S蚩門的HAd5被

15、構(gòu)建出來并用于研究誘生抗體對豬的保護?，F(xiàn)觀察到采用此重組病毒以10WU/動物在PBS中免疫豬獲得的豬血清，在給易感豬接種致死劑雖強毒之前與之混合，經(jīng)口服接種病帝血清混合物可預(yù)防TGEV強毒的復(fù)制，徹底保護豬不出現(xiàn)癥狀和死亡。而旦使用的劑量并未在超過50只的接種豬上出現(xiàn)任何臨床癥狀并持續(xù)至接種后10周，提示此載體可被用于豬的活疫苗而不引起任何與載體有關(guān)的次級并發(fā)癥°PAd載體應(yīng)比HAd更有效。Tuboly和Nagy構(gòu)建了表達TGEVS蛋白的rPAd5,采用此重蛆病茬以5xIbPFU/動物的劑量經(jīng)單次口服免疫,可足夠誘導系統(tǒng)和局部的體液免疫應(yīng)答可惜并未進行攻毒試驗C3.6豬沆感瘋?cè)i流感

16、病毒(SIV)是一種在家禽、豬、海洋哺乳動物和人等不同物種中廣泛傳播的重要病原體。在豬上流感作為一個群的傳染病,或更通常引起ARI)的暴發(fā)。雖然很少致命，豬流感對經(jīng)濟具有潛在的影響。當前對SIV和PRRSV的混合感染更加關(guān)注。除了豬流感對養(yǎng)豬業(yè)的影響之外，豬對A型流感病律在人上的全球生態(tài)學非常逾要?，F(xiàn)在已經(jīng)商品化的SIV疫苗有全病毒滅活疫苗和亞單位疫苗。雖然這些疫苗會降低發(fā)病率和臨床上疾病的嚴重性,但他們不能持續(xù)提供抵抗病毒感染的完全保護。2株復(fù)制缺陷型HAd5被開發(fā)出來作為抗SIV潛在的疫苗,表達流感病毒H3亞型HA的rHAd5可主要誘導亞型特異為主的體液免疫應(yīng)答，而表達核衣殼蛋白（NP）的

17、rHAd5可群特異性地刺激對所有血清亞型A型流感病毒提供交叉反應(yīng)免疫的細胞毒性T淋巴細胞。并且觀察到采用上述首株重組病毒以5xIgCID%/動物在PBS中給小鼠免疫，以2x10"CIDJ動物在PBS中給豬免疫，在免疫后4周可誘導高水平的抗SIV的病毒特異性HI抗體，并給動物提供部分保護。而另一方面以2xKTTCIDJmL在PBS中的2種重組病毒混合物給豬免疫，可提供完全保護。4作為獸用疫苗腺病毒的生產(chǎn)與純化當開發(fā)成本有效的粹用疫苗時過程設(shè)計很關(guān)鍵,如果準備進行工業(yè)化應(yīng)用減少步驟過程是一個前提。目前并未要求獸用疫苗要達到人用疫苗最終那樣的純度，這會在純化方案中有所體現(xiàn)。在獸醫(yī)上應(yīng)用的A

18、d疫苗主要采用傳代細胞系比如293、MDBK、VRlBL、HeLa和A549來生產(chǎn)。在細胞增殖步驟.一般采用不同的動物血清來提高細胞生長?？墒窃诩毎囵B(yǎng)基中添加這樣的成分存在幾種缺陷,比如批次之間的不同，被外源病毒、支原體和阮病毒等污染的可能風險。當前歐洲（EMEA）和美國（FDA）的管理機構(gòu)鼓勵生物制品廠在生產(chǎn)過程中減少或取消動物源性材料的使用。近期有幾種無血清和無蛋白培養(yǎng)基已經(jīng)商品化。雖然使用這樣確定的培養(yǎng)基仍然很貴，但大規(guī)模生產(chǎn)Ad載體會要求使用這類培養(yǎng)基以便于下游加工，而且時間長了會降低整個過程成本。根據(jù)使用黏附或懸浮培養(yǎng)細胞的類型生產(chǎn)方法有所不同。從生產(chǎn)上講，懸浮適應(yīng)細胞系更便于大規(guī)

19、模生產(chǎn)?，F(xiàn)已開發(fā)出Ad生產(chǎn)的不同操作模式：（1）批模式，提供了最簡易的操作方式,無需額外補料，降低了污染的風險;（2）補料模式，容易操作與規(guī)?；ㄟ^補充有限的營養(yǎng)或減少有毒代謝物的積累，延長培養(yǎng)的生命周期；（3）灌注模式，細胞可以相對高的密度在生物反應(yīng)器內(nèi)遲滯.而新鮮營養(yǎng)供應(yīng)和代謝產(chǎn)物移出同時進行。對Ad市場需求的增加要求生產(chǎn)濃縮Ad載體方法的成本必須很低。Ad具有生產(chǎn)很高滴度的優(yōu)勢（10，。10“PFU/mL）,可在很大比例的接種動物中誘導很好的免疫應(yīng)答，尤其黏膜免疫需要使用的劑量大，因此對培養(yǎng)體積有要求。為了提高產(chǎn)量很明顯必須進行進一步的過程研發(fā)。在生產(chǎn)體積上的改進可通過增加被感染細胞的

20、濃度來實現(xiàn)，而不降低產(chǎn)品的特異性產(chǎn)錄，可是在批次操作生產(chǎn)中Ad載體維持的最大的特異性生產(chǎn)率被限制在細胞密度為Ix106細胞/mL的范圍°現(xiàn)已經(jīng)制定了幾種方案來克服所謂的“細胞密度效應(yīng)”。Gamier等證實在感染時替換培養(yǎng)基并在感染后24h添加簡萄糖，間斷性調(diào)節(jié)pH值，允許維持最大的特異性生產(chǎn)率在1.6x106細胞/mLo而Nadeau等通過在感染后24h添加必需氨基酸來進一步改進此策略.穩(wěn)定體積生產(chǎn)率在細胞密度為2X1063xW細胞/mL之間。此結(jié)果提示在細胞密度高時存在著基質(zhì)限制和/或副產(chǎn)品抑制。灌注操作模式已經(jīng)被嘗試作為一種控制培養(yǎng)環(huán)境和移除有毒副產(chǎn)品的手段。在感染后2d采用灌注

21、率為每日2個反應(yīng)器體積，最大特異性生產(chǎn)率僅可被維持在感染細胞密度為3X106細胞/mL,但更換培養(yǎng)基的體積大卻大大地提高了生產(chǎn)成本。在Ad生產(chǎn)中感染動力學很重要，必須對一些變段進行研究。比如感染最（MOI）和在過程中優(yōu)化收獲時間對于增加產(chǎn)品產(chǎn)量來講很重要.可避免快速消耗成本和經(jīng)鑒定的種毒庫，并確保在不同生產(chǎn)規(guī)模間的感染動力學是可重復(fù)的°在大規(guī)模生產(chǎn)中采用低MOI受到歡迎因為可省略病春接種的中間步驟。最后應(yīng)采用最少的步驟來對獸用制品進行純化,而且采用的單元操作應(yīng)簡單而便宜。傳統(tǒng)上在實驗室純化rAd是采用兩輪氯化鎮(zhèn)（CsCl）密度梯度超速離心。可足CsCl密度梯度方法不能規(guī)?；?。色譜層析純化、離子交換、疏水作用、金屬螯合和尺寸排除層析已被用于評價捕捉和純化HAd5oKamen和Henry開發(fā)/一種復(fù)雜和昂貴的用于基因治療載體的純化方法。雖然此方法可對Ad載體進行大規(guī)模純化并使其純度達到CsCl梯度超商方法所得純度，可是顯著地增加了終產(chǎn)品的