高致病性禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和表位模擬肽的篩選與鑒定.docx

1、Vol.24No.6November2008病毒學(xué)報CHINESEJOURNALOFVIROLOGY高致病性禽流感病毒血凝素蛋白廣譜中和表位模擬肽的篩選與鑒定I宋恩娟，羅文新.，鄭振華，陳瑛煒，陳毅歆，陳自敏，張軍，夏寧那（廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院國家傳染病診斷試劑與疫苗1：程技術(shù)研究中心,福建廈門361005）摘婆：以H5N1型禽流感病毒HA蚩白廣譜中和單抗8H5為基礎(chǔ)，利用噬菌體展示肽庫技術(shù)及類病毒顆粒融合表達技術(shù)研究HA模擬表位.ELISA檢測結(jié)果顯示：篩選獲得模擬HA表位的模擬肽123,進行類病毒顆粒融合蛋白表達后，仍具有與8H5單抗特異結(jié)合的能力.免疫熒光檢測結(jié)果說明，類病毒顆粒免疫小鼠

2、后產(chǎn)生了能與HA交叉反應(yīng)的抗體。禽流感病毒HA模擬表位的研究與性質(zhì)的分析及類病每顆粒融合蛋白的表達與活性分析、免疫原性分析，都為研制禽流感通用表位疫苗奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：H5N1HA®白；噬菌體展示肽庫；模擬肽中圖分類號:R373.1文獻標識碼：A文章編號：1000-8721（2008）06-00421-06近年來，H5N1型禽流感病毒傳播呈增強趨勢,2005到2006年已迅速蔓延至俄國、歐洲、非洲及中東地區(qū)由于AIV抗原變異頻繁，機體不能有效防御病毒的侵襲，為疫苗的研究開發(fā)提出了嚴峻的考驗。目前雖然已有多種疫苗應(yīng)用于AIV的防治，如滅活疫苗、亞單位疫苗、重組活載體疫苗、核酸疫苗，但

3、其效率均在60%85%之間，且只針對特定類型病毒株。隨著生物化學(xué)、分子免疫學(xué)技術(shù)及基因工程技術(shù)的發(fā)展，表位疫苗的出現(xiàn)彌補了傳統(tǒng)疫苗的一些不足，尤其在誘導(dǎo)細胞免疫方面，減少了疫苗毒副作用，提高了安全性，增強了免疫針對性。天然表位或模擬表位在很多疾病，如HIV、HCV的研究中都產(chǎn)生很好的免疫反應(yīng)“罰。為防止禽流感大規(guī)模爆發(fā),有效預(yù)防其不定向突變趨勢，加快研制可提供交叉保護性的通用表位疫苗顯得尤為重要。血凝素蛋白（Hemagglutinin,HA）是病毒表面的主要刺突成分，在病毒吸附及穿膜過程中起關(guān)鍵作用，其在病毒中變異速度非?？欤ㄟ^突變與抗體的結(jié)合區(qū)域的氨基酸，或者改變表面糖鏈分子的分布，會降低

4、HA與抗體之間的反應(yīng)A”】。HA作為病毒最重要的表面抗原，可誘生保護性抗體及細胞收稿日期：2008-8-15;修日期：2008-09-15基金項目：教育部科技重點項日（108157）,科技支撐計劃（2OO6BAIO1BO6）,廈門市科技計劃社會發(fā)展項目（3502Z20073001）,福建省科技計劃重點項目（2008Y0059）作者簡介：來窟蠟（1983-），女，碩士研究生.通訊作者：羅文新.Email：wxluo免疫3，是當前流感疫苗的主要成分，也是尋找中和性抗體的關(guān)鍵考慮因素川。本實驗室在禽流感中和性單克隆抗體研制方面積累了豐富的經(jīng)驗，制備的8H5單克隆抗體，對近年來34株H5N1病毒株都有

5、血凝抑制和中和活性，具有特異性高、反應(yīng)性強、識別譜廣的特點該結(jié)果提示在HA上存在保守中和表位，為通用表位疫苗的研究奠定了良好基礎(chǔ)。本研究采用噬菌體隨機肽庫技術(shù)，選用禽流感廣譜中和抗體8H5對隨機十二肽庫進行篩選；又將表位模擬肽展示在類病毒顆粒上，對其免疫原性及免疫反應(yīng)性進行分析，旨在為高致病性H5N1禽流感病毒血凝素蛋白（HA）模擬表位及通用表位疫苗的研究提供參考。材料與方法1試劑、病毒、細胞、質(zhì)粒噬前體隨機十二肽庫（庫容：2.7X109個轉(zhuǎn)化子）及E.coli2738均購自美國NewEnglandBioLabs公司；辣根過氧化物醇（HRP）標記的抗M13單克隆抗體購自Pharmacia公司；

6、M13ssDNA提取試劑盒購自美國Omega公司；表達禽流感HA蛋白的SF21昆蟲細胞由本實驗室保存，滅活禽流感H5N1亞型病毒株由香港大學(xué)微生物系管軼教授惠贈,pC149-mut質(zhì)粒由本實驗室構(gòu)建。2單克隆抗體禽流感病毒H5N1HA中和單抗8H5、4D1、10F7、8G9、3G4、2F2、3C8、3D2、1G2、3CF1、7D1.6CF3、7H8、10DE2、13E7、16A12均由本實驗室制備.HEVE2蛋白中和單抗8C11由本實驗室制備。3儒選肽庫根據(jù)NEB公司肽序.篩選操作手冊進行，簡述如下。采用ProteinA捕獲法進行液相篩選，用1ml封阻緩沖液（0.Imol/LNaHCOjCpH

7、8.6）,5mg/mLBSA,0.02%Na、，過濾除菌，代貯存）封閉適量ProteinA-瓊脂糖介質(zhì)，4*C再育60min.取1.5X10*°個噬菌體粒子（相當于項原始文庫）和適量抗體在TBST（TBS+0.】v/vTween-20）緩沖液中反應(yīng)30min；再加入封閉好的介質(zhì)，室溫反應(yīng)30min.用TBST（0.1%）緩沖液淘洗混合物，采用不洗脫方式，重懸沉淀介質(zhì)于1mlTBS緩沖液中.留100/J用于噬菌體滴定實驗，剩余篩選物擴庫；用1/5體積PEG收庫，得到噬菌體沉淀，重懸后作為下一輪篩選的噬菌體肽庫。按照以上步驟，依次進行第二輪和第三輪的篩選。待第三輪篩選完畢，直接用稀釋一定

8、倍數(shù)的篩選物于LB/IPFG/Xgal平板h滴定噬菌斑.4哩菌體克隆ELISA檢測及DNA序列測定將單克隆抗體8H5（lMg/mL,PB稀釋）及對照抗體10F7、8C11、3G4（lMg/mL,PB稀釋）包被96孔微孔板.于滴定板上隨機挑取單克隆噬菌斑經(jīng)擴增后，取100訕上清加入包被了抗體的微孔板中，37*C溫育lh,0.1%PBST洗板5次，加入100m1HRP標記的抗-M13抗體（1»3000）,37*0作用0.5h,TMB（3,3,5,5,2四甲基聯(lián)苯胺）為底物，顯色15min,終止后測定450nm的吸光度值。以日標抗體ELISA讀值高于對照抗體ELISA讀值2倍及以上作為陽性

9、標準.用M】3ssDNA提取試劑款提取陽性噬菌體克隆基因組，送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序.5融合蛋白的表達、純化及電鏡觀察質(zhì)粒pC149-mut含有HBVcore蛋白的1-149氨基酸（C149）的核昔酸序列，其中第79、80位氨基酸的序列被BamHI酶切位點代替將123肽分別以一個拷貝和三個拷貝數(shù)插入到此位點，表達出的模擬肽將展示到HBcAg類病毒顆粒表面上。經(jīng)PCR擴增出N端連有模擬肽序列的C149a.a.81149DNA片段，經(jīng)BglII和EcoRl解切后回收純化，連接到BamWEcoRl雙醇切的pC149-mut載體中，分別構(gòu)建出帶有一個、三個拷貝123肽的重組質(zhì)粒pC149-mu

10、t-123、pC】49mut-T123,表達的融合蛋白分別稱為HBc-123.HBc-T123o重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿薄ER2566進行表達，用飽和硫酸鉉沉淀蛋白的方法純化蛋白.純化好的類病毒顆粒融合蛋白樣品用2%磷酸鈣負染后，直接進行電鏡觀察。6融合蛋白活性檢測及特異性分析將純化好的類病錐顆粒融合蛋白以10網(wǎng)/mL的濃度包被96孔板，與8H5單抗37*C辨育lh后,PBST洗板5次，再加入二抗GAM-HRP（1«10000）,371孵育30min.PBST洗板5次，加入顯色液顯色10min,終止液終止，酶標儀讀位.用13株針對禽流感病毒（AIV）血凝蛋白（HA）的單抗作對照來檢測類病毒

11、顆粒融合徵白與8H5單抗結(jié)合的特異性。7競爭ELISA實驗病毒稀釋至同一活性比值（即和8H5單抗的ELISA反應(yīng)活性均在1.0左右）在包被8H5（lMg/mL）單克隆抗體的孔中，同時加入50Fl融合蛋白（0.1心/和50訕病毒，二者競爭結(jié)合8H5單抗，同時以HBcAg蛋門作為陰性對照以抗HA酶標抗體2F2-HRP（1：500）為二抗.競爭率計算公式：竟爭率=（1-競爭后OD值/競爭前OD值）X100%8免疫小鼠將純化的融合我白與等體積的福氏佐劑混合（初次免疫時與完全福氏佐劑混合，加強免疫時與不完全福氏佐劑混合），以肌肉多點注射的方式，免疫BALB/c小鼠，每只小鼠的免疫最為100尸g蛋白，34

12、只小鼠為一組.初次免疫后，每隔一周加強免疫一次，同時采取眼球血，存放于-20*C備用。9免疫血清與多肽反應(yīng)性ELISA檢測以本實驗室制備的含123多肽的239-123敝合蛋白作為固相包被抗原（lMg/孔），HRP標記的羊抗鼠IgG作為酶標二抗，用間接ELISA法檢測鼠血清中抗123多肽的抗體滴度。10免疫熒光檢測通過昆蟲細胞一桿狀病族發(fā)達系統(tǒng)，將禽流感病毒HA蛋白表達在SF21細胞表面。用4%多聚甲酵固定細胞，山羊多抗血清封閉，與1：20稀釋的HBC-T123免疫鼠血清室溫孵育】h,以8H5單抗作為陽性對照，HBcAg蛋白免疫鼠血清作為陰性對照。熒光標記的羊抗鼠抗體（Sigma,St.Loui

13、s,MO,USA）為二抗，室溫反應(yīng)半小時,取DAPI（Sigma,St.Louis,MO,USA）染細胞核，室溫10min,然后在正置熒光顯微鏡（Nikon）T觀察.結(jié)果與分析1模擬肽的篩選及序列獲得選用NEB公司的噬菌體十二肽庫，針對廣譜中和抗體8H5進行三輪篩選。隨機挑取96個噬菌體克隆，用ELISA法檢測，結(jié)果得到60個陽性克隆。經(jīng)測序分析得到相應(yīng)的氨基酸序列，即為噬菌體表面展示的十二肽序列。60個克隆共編碼五種不同十二肽序列（表1）,五種噬菌體克隆對8H5抗體的ELISA讀值均高于對照抗體讀值兩倍以上（圖1）。BLAST分析表明，五種肽的氨基酸序列與H5N1血凝素蛋白的知基酸序列無同源

14、性。其中123模擬肽出現(xiàn)的頻率高達48%,且展示123的噬菌體肽與8H5的反應(yīng)最強、特異性最好，故選取123模擬肽做進一步研究。表1模擬肽氨基酸序列Table1AminoacidsequenceofmimicpeptidesPeptideNo.AminoacidFrequencyofsequenceisolation(%)123ETPLTETALKWH48130HLQDGSPPSSPH10134APVPPTAWWHLS8135F'GSHIYSPFHP11136QWNLTPRQSLQL7圖1ELISA檢測哌前體肽與單抗的反應(yīng)性Figure1Detectionofreactivityofp

15、hagotopestomonoclonalantibodiesbyELISA2模擬肽與HBcAgaal149融合蛋白的表達及結(jié)合活性分析HBVcore蛋白的1-149個氨基酸可組裝成類病毒顆粒,其中第79.80位基基酸可被替換成外源蛋白而不影響類病毒顆粒形成因此HBcAg作為一種很好的外源表位載體已引起研究者的興趣“°本實驗室構(gòu)建了一個含HBcAgaal149的表達載體，本研究將得到的模擬肽插入其第7980位氨基酸處，表達融合蛋白。將模擬肽分別以一個和三個拷貝與HBcAgaal149融合，得到的融合蛋白相應(yīng)稱為HBc-123、HBC-T123.在ER2566菌中表達融合蛋白并加以純化

16、，ELISA檢測融合蛋白與8H5抗體的結(jié)合活性。實驗結(jié)果顯示（圖2）：融合蛋白HBc-T123與8H5抗體有很強的結(jié)合活性，而HBc-123融合蛋白圖2模擬肽融合蛋白與8H5抗體的反應(yīng)性Figure2Thereactivityofrecombinantproteinwith8H5detectedbyELISA3類病毒顆粒的電鏡觀察HBc-T123融合蛋白樣品經(jīng)磷酸鴇負染后，于電鏡下觀察。如圖3所示,HBC-T123可組裝成完整的類病毒顆粒，顆粒呈空心球形，直徑約30nm左右。4HBC-T123»合蛋白與8H5的反應(yīng)特異性分析進一步對HBC-T123融合蛋白與8H5單抗結(jié)圖3HBc-T

17、123組成的類病毒顆粒（電鏡負染，標尺為100nm）Figure3Virus-likeparticleassembledfromrecombinantproteinHBc-T123合的特異性進行分析。包被HBc-T123融合蛋白，分別與14種禽流感病毒單克隆抗體進行反應(yīng)。結(jié)果顯示（圖4）,HBc-T123融合蛋白只和8H5單抗有很好的反應(yīng)性，與其他單抗均無反應(yīng)，且陰性對照HBcAg的反應(yīng)讀值均很低，說明HBc-T123融合蛋白與8H5單克隆抗體有好的結(jié)合特異性。 HBC-TI23HBcAg屠.庫&面牌街，房.時新,SQ0Q一LZG1L一E8oc受。寸耳一eeQzqNAVIantibod

18、ies圖4H&-T123融合蚩白與抗體反應(yīng)的特異性分析Figure4AnalysisofspecificbindingofHBc-T123to8H55HBZT123融合蛋白與禽流感病毒競爭結(jié)合8H5單抗包被8H5單抗，將HBc-T123融合蛋白分別與7株H5N1型病毒混合加入，二者競爭結(jié)合8H5單抗，再以禽流感病毒HA特異酶標抗體（2F2-HRP）來檢測病毒。由圖5可知，HBc-T123融合蛋白與禽流感病毒競爭的百分比達到50%62%,說明HBc-T123融合蛋白與8H5單抗的結(jié)合力和病毒相近，進而說明123模擬肽較好的模擬了HA蛋白上與8H5單抗結(jié)合的中和表位。上與8H5單抗結(jié)合的中

19、和表位。(季cowpdEOu70.00%60.0()%5O.(K)%40.0()%30.00%-10.00%HK213HKK2Iyij61512A5115-20.00%HBC-TI23HBcAgWeekspost-immunizationvies圖5ELISA檢測HBc*T123融合蛋白與H5N1病毒競爭結(jié)合8H5抗體Figure5Detectiono(HBc-T123competingwithH5N1virusesfor8H5byELISAtest6HBC-T123融合蛋白的免疫原性分析用HBC-T123融合蛋白免疫BALB/c小鼠，隔周加強,ELISA檢測抗模擬肽抗體產(chǎn)生情況。本實驗室已制

20、備出一種239-123融合蛋白，即123模擬肽融合于239蛋白的C端，239為HEVE2蛋白的239個氨基酸的序列。239-123融合蛋白亦具有與8H5單抗結(jié)合活性。以純化的239-123包板，ELISA檢測抗模擬肽抗體的產(chǎn)生。結(jié)果如圖6所示，HBcT123融合蛋白免疫小鼠后產(chǎn)生了很高的針對123肽的抗體滴度;4周后滴度均達到1：120000。圖6HBc-T123DA合蚩白免疫隊血清中抗123肽的抗體滴度變化Figure6Thetiterofanti-123antibodyinserumfrommiceimmunizedwithHBc-T123protein7免疫熒光檢測模擬肽抗血清與HA的反

21、應(yīng)性圖7免疫熒光檢測抗血清與SF21細胞表達HA的結(jié)合反應(yīng)Figure7DetectionofbindingreactivityofserumtoHAexpressedonSF21cell#byimmunofluorescenceassay本實驗室利用昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(tǒng)，將禽流感YU22病毒的HA蛋白表達在SF21細胞表面。因此可以用免疫熒光來檢測模擬肽抗血清與HA的反應(yīng)性，其中以8H5單抗作為陽性對照，以HBcAgaal149抗血清為陰性對照。由圖7的結(jié)果可知，HBc-T123免疫的鼠血清能特異地與SF21細胞反應(yīng)，表明HBc-T123免疫小鼠產(chǎn)生了HA交叉反應(yīng)性抗體，也進一步說明1

22、23肽較好的模擬了HA蛋白的抗原表位。討,論禽流感病毒HA基因是AIV最主要的保護性抗原基因，是研制疫苗的理想靶基因。本研究以H5N1型禽流感病毒HA蛋白廣譜中和單抗8H5為基礎(chǔ)，利用噬菌體肽庫技術(shù)篩選獲得模擬HA表位的模擬肽，進行通用表位疫苗的初步研究。為了增強免疫原性，將篩選出的123模擬肽與HBcAgaal-149蛋白融合，使模擬肽展示在HBV類病毒顆粒上。ELISA檢測結(jié)果顯示，融合蛋白后的123肽仍具有與8H5單抗特舁結(jié)合的能力。免疫熒光檢測結(jié)果說明，類病毒顆粒免疫小鼠后產(chǎn)生了HA交叉反應(yīng)性抗體。由于缺乏天然蛋白的三維結(jié)構(gòu)，表位模擬肽的分子小，免疫原性差，半衰期短，使機體無法產(chǎn)生免疫

23、反應(yīng)，還可能引起免疫耐受。因此增加免疫原性與穩(wěn)定性是近年來表位疫苗的研究熱點。表位展示載體這一方法，在國內(nèi)外已經(jīng)取得了不少令人欣喜的研究成果，噬菌體、蛋白分子載體、脂肽等都可以作為表位的載體。本研究曾選用噬菌體和HEVE2的一段蛋白239作為載體，實驗結(jié)果證實免疫小鼠后產(chǎn)生抗體滴度較低，而且產(chǎn)生抗體的周期較長，效果不夠理想。而類病毒顆粒是一種較為理想的載體，可以用于展示表位模擬肽的類病毒顆粒包括HBV-VLP：”】、HCV-VLP,81、HPV-VLP0叮等多種形式。本研究將模擬肽表達在HBV類病毒顆粒上，是由于其含有T輔助細胞表位，可以大大提高融合蛋白的抗原性和免疫原性；同時類病毒顆粒容易被

24、機體內(nèi)的抗原遞呈細胞吞噬，從而可以更快的激起機體的免疫應(yīng)答。展示模擬肽的HBV類病毒顆粒免疫小鼠一周后，血清中抗體滴度即可達到1:1000,四周后血清中抗體滴度可達1：120000。氨基酸序列分析表明123模擬肽與HA在一級序列上并沒有相似性，卻與8H5單抗有很好的特異結(jié)合活性，說明此十二肽是在空間結(jié)構(gòu)上模擬了HA的表位。當一個拷貝的模擬肽融合表達在HBV類病毒顆粒上，可能影響了其特定的空間結(jié)構(gòu)，失去了與8H5特異的結(jié)合活性；而中間通過連接肽GGGGS串聯(lián)的三個拷貝模擬肽,展示在HBV類病毒顆粒上，就維持了十二肽自身的構(gòu)象，保持了活性。以上結(jié)果說明，雖然123模擬肽是從線性卜二肽庫中篩選出來的

25、，但是仍具有一定的構(gòu)象性以維持其活性。GGGGS的空間結(jié)構(gòu)具有高度易變性和靈活性，廣泛用于蛋白質(zhì)或肽之間的連接N。】，本實驗用其作為表位之間的連接，目地是使多個抗原表位在空間上互不干擾,提高模擬肽的分子址、增強其免疫原性。用HBc-T123類病毒顆粒與7株H5N1亞型禽流感病毒競爭結(jié)合8H5單抗，這7株H5N1型的病毒是不同年份的代表毒株。HBc-T123類病毒顆粒與病毒的競爭抑制率均達到50%62%，說明HBc-T123類病毒顆粒與8H5單抗的結(jié)合能力與病毒相近，進而說明123模擬肽較好的模擬了多種毒株共同的HA蛋白抗原表位保守區(qū)域。本研究結(jié)果可為高致病性禽流感病毒通用表位疫苗的研究提供參考

26、。(致謝：待別感謝香港大學(xué)微生物系新發(fā)傳染病國家重點實驗宅管軼教授和陳河霖教授惠贈滅活念流感病也株.)參考文獻：1jSimsLD,DomenechJ»BenignoC,etal.Originande-volutionofhighlypathogenicH5N1avianinfluenzainA-siaDB.PubMed.VetRec,2005,157：159164.2 WorldHealthOrganization.H5N1influenza.timelineDB.http：//csr/disease/avian-influen-za/timeline.pdf(

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