新藥的方法學(xué)考察

1、3.方法學(xué)考察新藥可以引用藥典或文獻(xiàn)收載的與其相同成分的測(cè)定方法，但因品種不同，與自行建立新方法一樣均要進(jìn)行方法學(xué)考察研究。一般考察項(xiàng)目如下：（1 ）提取條件的選定 優(yōu)選提取條件對(duì)測(cè)定結(jié)果有直接影響、特別對(duì)于制劑中含有藥材原粉的，即由組織細(xì)胞中提出有關(guān)成分，提取方法的選擇尤為關(guān)鍵，常見的提取方法有冷浸、熱浸回流、索氏提取器提取、超聲波提取等，濾除殘?jiān)吹锰崛∫?。?duì)提取液的取舍一 般有兩種方法，一種為取全量，即充分洗凈殘?jiān)?，并將洗滌液合并于提取液中；另一種為取 一定量，即在提取前精密加入定量溶劑，稱重，提取后再補(bǔ)充提取過程損失的溶劑，搖勻，過濾，精密吸取-定量的提取液進(jìn)行含量測(cè)定，最后結(jié)果按相當(dāng)

2、的樣品量計(jì)算，即得。提取條件的確定，一般要有不同溶劑、不同提取方式、不同時(shí)間以及不同溫度、PH值等條件比較而定，可參考文獻(xiàn)，重點(diǎn)對(duì)比某種條件也可用正交試驗(yàn)全面優(yōu)選條件，再配合回收率試驗(yàn)或與經(jīng)典方法比較，從而估計(jì)方法的可靠性。（2 ）分離純化 根據(jù)被測(cè)成分的性質(zhì)，采用一定方法，排除干擾物質(zhì)，使供試樣品達(dá) 到一定純凈度。特別是氣相、液相色譜分析更應(yīng)注意此點(diǎn)，以提高分析準(zhǔn)確性并可保護(hù)色譜 柱。（3 ）測(cè)定條件的選擇 如比色法、高效液相、薄層掃描法中最大吸收波長(zhǎng)的選擇，液 相色譜法中固定相、流動(dòng)相、內(nèi)標(biāo)物的選擇，薄層掃描法層析與掃描條件的選擇等。（4 ）空白試驗(yàn) 在色譜法中常用陰陽對(duì)照法，即以被測(cè)成分

3、或藥材與除去該成分或該 藥材的成藥作對(duì)照， 可考察被測(cè)成分的斑點(diǎn)（或峰）位置是否與干擾組分重迭，以確證測(cè)定 指標(biāo)（如吸收度、蜂面積）是否僅為被測(cè)成分的響應(yīng)，防止假陽性的誤判。紫外分光光度法 或比色法中的空白對(duì)照液常見的有溶劑空白、試劑空白（溶劑加顯色劑），對(duì)復(fù)方制劑也須同色譜法做陰性對(duì)照確證吸收度僅為被測(cè)成分的響應(yīng)。對(duì)單一成分或大類成分測(cè)定，均須 做此試驗(yàn)。（5 ）樣品濃度與響應(yīng)值樣品濃度與吸收度或色譜峰面積（或峰高）之間的線性關(guān)系考 察、即標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。紫外分光光度法或比色法須制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以確定取樣量并計(jì)算含量。色譜法一般均采用對(duì)照品比較法如外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法測(cè)定，但也必須進(jìn)行線性考察，目

4、的有三：a.確定樣品濃度與峰面積或峰高是否呈線性關(guān)系；b.確定線性范圍，即適用的樣品點(diǎn)樣或進(jìn)樣量的確定；c.直線是否通過原點(diǎn)，以確定是以一種或二種對(duì)照品量（即一點(diǎn)法或二點(diǎn)法）測(cè)定并計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)應(yīng)在 0.999以上，薄層掃描法可在 0.995以上。（6） 測(cè)定方法的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 此項(xiàng)考察目的是選定最佳的測(cè)定時(shí)間范圍。用紫外分光 光度法、比色法或薄層掃描法等測(cè)定時(shí)， 應(yīng)對(duì)被測(cè)液或薄層色譜斑點(diǎn)的吸收度值穩(wěn)定性進(jìn)行 考察，即每隔一定時(shí)間測(cè)定一次，延續(xù) 3-4小時(shí)，視其是否穩(wěn)定，以確定適當(dāng)?shù)臏y(cè)定時(shí)間。（7）精密度試驗(yàn) 如氣相、液相色譜法對(duì)同一供試液多次進(jìn)樣測(cè)定，簿層掃描法對(duì)同一薄層板及異板多個(gè)同

5、量斑點(diǎn)掃描測(cè)定，可考察其精密度，對(duì)同一薄層斑點(diǎn)連續(xù)進(jìn)行多次測(cè)定，則可考察儀器精密度。（ 8）重復(fù)性試驗(yàn) 按擬定的含量測(cè)定方法，對(duì)同一批樣品進(jìn)行多次測(cè)定（平行試驗(yàn)至 少 5 次以上，即 n>5 ），計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（ RSD ），一般要求低于 5% 。同一人測(cè)定多次 稱重復(fù)性，不同人或?qū)嶒?yàn)室測(cè)定稱再現(xiàn)性。（ 9）檢測(cè)靈敏度及檢測(cè)下限的測(cè)定， 分析方法的靈敏度一般以工作曲線的斜率表示。 其值越大 .方法的靈敏度就越高。 色譜法的靈敏度可以用峰高（ mm ）/ 對(duì)照品量（ mg ）表示。 最小檢出量即檢測(cè)下限， 一般按經(jīng)驗(yàn)法設(shè)計(jì)數(shù)個(gè)不同進(jìn)樣量， 以目測(cè)估計(jì)最小儉出量。 有時(shí) 常把最小檢

6、出量理解為靈敏度，實(shí)際上兩者概念不同。（ 10）回收率試驗(yàn) 含測(cè)方法的建立，多以回收率估計(jì)分析的誤差和操作過程的損失， 以評(píng)價(jià)方法的可靠性?；厥章蕦?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)也有多種，在中成藥分析中常見的有以下幾種； 加樣回收 ，即于已知被測(cè)成分含量的成藥中再精密加入一定量的被測(cè)成分純品， 依法 測(cè)定。 用實(shí)測(cè)值與原樣品中含測(cè)成分之差， 除以加入純品量計(jì)算回收率 。此法不用制備空白 對(duì)照， 模擬真實(shí)性好。 對(duì)單味藥材的回收率測(cè)定， 因不易制備除去被測(cè)成分的藥材空白對(duì)照 品，只能用加樣回收法， 如用提凈被測(cè)成分的藥渣作空白，則意義不大，因?yàn)樵诔ケ粶y(cè)成 分的同時(shí)，干擾成分也被除去了。在加樣回收實(shí)驗(yàn)中首先須注意純品的

7、加人量與取樣量中被測(cè)成分之和必須在標(biāo)淮曲線 線性關(guān)系范圍之內(nèi)； 外加純品的量要適當(dāng)， 過小則引起較大的相對(duì)誤差， 過大則干擾成分相 對(duì)減少，真實(shí)性差。 一般加入量與所取樣品含量之比控制在1：1 左右 。對(duì)于加樣回收的計(jì)算方法， 也有用實(shí)測(cè)值除以理論總量 （樣品中所含被測(cè)成分量與加入 純品旦之和）計(jì)算的，但仍以前述計(jì)算方法為公認(rèn)。 以成藥空白（即除去欲測(cè)藥材后制成的成藥），精密加入被測(cè)化學(xué)成分純品，依法測(cè)定。以加入純品量為理論值，由實(shí)測(cè)值計(jì)算回收率。此法理論值較準(zhǔn)確，但其不足是缺少成 藥中被測(cè)藥材本身的雜質(zhì)干擾條件， 模擬真實(shí)性差， 特別是被測(cè)藥材組分復(fù)雜， 如人參被測(cè) 成分為人參皂苷 Re、因

8、與該成分共存的同系物或類同成分人參皂苷較多，其自身分離度重 現(xiàn)性差，而只以加入純品測(cè)定回收率，與人參皂苷 Re 的干擾情況則無從反映。故此種回收 率測(cè)定只能用于被測(cè)藥材成分較為單一者。 取成藥空白， 精密加人已知被測(cè)成分含量的藥材， 依法測(cè)定。 以加入藥材所相當(dāng)?shù)谋?測(cè)成分量為理論值， 再由實(shí)測(cè)值除以理論值計(jì)算回收率。 此法模擬真實(shí)性好， 能反映被測(cè)藥 材中其它成分的干擾情況， 但由于已知含量藥材也是同法測(cè)得的平均值， 故其理論值實(shí)際包 括正負(fù)誤差在內(nèi)，有時(shí)也能掩蓋系統(tǒng)誤差。特別是單味原料（藥材）制劑，仍以采用加樣回收法為宜?；厥章试囼?yàn)至少需進(jìn)行5次試驗(yàn)（n = 5）,或三組平行試驗(yàn)（n =

9、6）,在同一批樣品中加入相同或不同純品量，后者可進(jìn)一步驗(yàn)證測(cè)定方法中取樣量多少更為合適?；厥章室话阋笤?95105%，些方法操作步驟繁復(fù)，可要求略低至少不小于90%。4 含量測(cè)定方法實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)注意的幾個(gè)問題（ 1）提取問題 對(duì)含藥材原粉的制劑，如采用取部分提取液的測(cè)定方法，不宜將樣品 粉末直接置容量瓶中定容， 因?yàn)橹兴幒繙y(cè)定的取樣量往往較大， 且藥粉不溶于水， 其固體 體積不可忽視。 例如將 0.5g 九分散于 10m1 容量瓶中， 以刻度吸管加入溶劑約 7mL 即已至 量瓶刻度?？蓪悠贩Q人具塞錐形瓶中，精密加入溶劑 10m1 計(jì)算全量。（2）測(cè)定大類成分如總黃酮、總皂苷等問題 如所測(cè)

10、總成分以某一單體成分為對(duì)照品制定標(biāo)推曲線并計(jì)算， 應(yīng)首先考慮對(duì)照品溶液 與供試品溶液最大吸收波長(zhǎng)是否一致， 有的相差很大或供試品溶液根本無最大吸收， 方法則 不能成立。 陰性（空白）對(duì)照液即除去欲測(cè)成分的藥材原料制備的樣品液，依法測(cè)定其吸收?qǐng)D譜，與基線吻合，或略有吸收，在無其它方法可循的情況下，其吸收值若低至樣品吸收值5% 以下可忽略不計(jì)。 因考察中藥多為天然藥物，含量幅度較大，又為大復(fù)方，不可認(rèn)為無吸收峰 即視為無干擾。 按上述方法制備背景空白以消除干擾是不可行的。例如樣品吸收值為0.6，而陰性對(duì)照液吸收值為0.2，即以0.6 0.2 = 0.4計(jì)算樣品含量。由于處方原料不相同，工藝未知，

11、配制出的背景空白不可能條件相同， 吸收值差異較大， 故此方法無推廣價(jià)值。 只有在原料來 源不變，工藝穩(wěn)定的情況下作為企業(yè)內(nèi)部的質(zhì)控方法暫時(shí)使用。 為了消除其它組分干擾， 采用導(dǎo)數(shù)光譜或二波長(zhǎng)， 三波長(zhǎng)等方法測(cè)定單一或大類成分， 僅可用于藥味較少的制劑， 其空白試驗(yàn)取多批次樣品測(cè)定， 結(jié)果一致才可采用。 因中藥復(fù)方 與西藥不同， 后者所謂干擾組分均為結(jié)構(gòu)已知具有一定規(guī)格的成分， 而中藥則大部為未知成 分且不衡定，有些測(cè)定只有一次性的意義，不具重現(xiàn)性。（ 3）回收率測(cè)定問題 在一些實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，常見到所謂的加樣回收測(cè)定，不是在稱樣 開始時(shí)即加入純品， 而是將其加至制備好的供試品溶液中， 這樣不能考察

12、提取、 純化過程中 被測(cè)成分是否損失； 也有在薄層掃描試驗(yàn)中， 于薄層板上依次點(diǎn)對(duì)照品溶液、 供試品溶液及 對(duì)照品與供試品重疊點(diǎn)于同一原點(diǎn)上， 測(cè)定后計(jì)算， 這只能反映板上的回收率， 而不能代表 全部含量測(cè)定方法的回收率。（ 4）對(duì)照品問題 含量測(cè)定用對(duì)照品只能用化學(xué)純品，不可用藥材對(duì)照品，因?yàn)椴豢?能得到所含成分含量同一的樣品。測(cè)定大類成分如皂苷也不宜采用總皂苷為對(duì)照品， 因總皂苷組分復(fù)雜， 各成分比例不穩(wěn) 定，不同批次的皂苷難于保持一致， 從而使含量測(cè)定結(jié)果不穩(wěn)定。 測(cè)定總皂苷時(shí)， 采用同系 物之一的化學(xué)單體并以其計(jì)算，定出限度是可行的。如測(cè)定人參總皂苷，以人參皂苷Rbl、Re 等作對(duì)照品

13、并計(jì)算。 但如處方中含有的不同藥味皂苷成分結(jié)構(gòu)差異較大，有的甚至不是 皂苷而是其它各種苷類，例如處方中有黃芪、人參、地黃、知母、赤芍等，而以黃芪甲苷或 人參皂苷 Re 為對(duì)照品測(cè)定并計(jì)算含量，科學(xué)根據(jù)不足，不能成立。5 含量限度的制定含量限度是在檢驗(yàn)方法確定的基礎(chǔ)上， 積累足夠的數(shù)據(jù)后總結(jié)提出的。 成藥的合格是建 立在藥材原料的質(zhì)量保證上的。 日本對(duì)栽培藥材常收集上百件樣品進(jìn)行測(cè)定， 對(duì)結(jié)果做分布 分析，有的下限取在去除約 5% 樣品的數(shù)值上，即將占總量 5% 的質(zhì)量最差、分布極小的樣 品判為不合格。 我國(guó)則根據(jù)寶貴的傳統(tǒng)鑒別經(jīng)驗(yàn)， 將藥材樣品依質(zhì)量?jī)?yōu)劣順序排列， 如所測(cè) 成分含量高低與之相應(yīng)

14、， 則將質(zhì)次但仍可藥用者取為下限。 必須強(qiáng)調(diào)的是， 含量限度的制定 應(yīng)有足夠的、 具代表性的樣品數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)。 否則就不能反映實(shí)際情況， 實(shí)踐中勢(shì)必會(huì)遇到種 種問題。新藥申報(bào)生產(chǎn)時(shí)應(yīng)積累 10 批以上的含量數(shù)據(jù)，提出限度。中藥制劑含量限度規(guī)定的方式， 根據(jù)現(xiàn)行各級(jí)標(biāo)準(zhǔn)有以下幾種。 一種是規(guī)定下限， 如藥 典中收載戊己九，對(duì)所測(cè)成分如黃連中總生物堿以鹽酸小劈堿計(jì)不得少于 3.0% ，六味地黃 丸，山茱萸中熊果酸、丹皮中丹皮酚分別為不得少于0.020% 、 0.070% （大蜜九）；一種是規(guī)定幅度，如部頒標(biāo)推進(jìn)口西洋參藥材含人參總皂為510% ,含西洋參制劑則應(yīng)根據(jù)處方量及工藝制相關(guān)數(shù)值規(guī)定制劑含量

15、幅度；另一種為規(guī)定標(biāo)示量，如2005 版藥典中收載華山參片，規(guī)格為 0.12mg/ 片，規(guī)定含生物堿以其莨菪堿計(jì)應(yīng)為標(biāo)示量的 80.0 120.0% 。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)指出中成藥與某些制劑不同， 如甘草流浸膏類可根據(jù)甘草酸的含量調(diào)節(jié)甘草浸 膏的投料量， 而中藥則必須保證處方不變， 成品率穩(wěn)定。 因此只有投入合格的原料才能保證 成藥的質(zhì)量。關(guān)于中成藥的含量表示方法，有 %、mg/片、g/丸、mg/m1 （液體制劑）等。凡藥品中 規(guī)定有含量測(cè)定項(xiàng)的， 其原料藥材必須對(duì)成品中所測(cè)成分規(guī)定含量限度，防止盲目投料， 可限定為本制劑專用的原料藥材規(guī)格， 暫不要求代表全國(guó)各地藥材的質(zhì)量，達(dá)不到要求者可以不進(jìn)貨，不投料，以保證產(chǎn)品質(zhì)量。六、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草說明起草說明是質(zhì)量標(biāo)淮制定的詳盡的技術(shù)資料。 對(duì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中各項(xiàng)均應(yīng)作逐項(xiàng)說明。 名稱、 處方、制法、功能主治、用法用量等，在申報(bào)資料中各有要求，故在起草說明中可以簡(jiǎn)要概 述，但不可從略。而有關(guān)檢定該藥真?zhèn)蝺?yōu)劣各項(xiàng)均應(yīng)重點(diǎn)詳細(xì)說明。對(duì)鑒別、 含量測(cè)定藥味各測(cè)定成分的選擇依據(jù)，方法原理， 實(shí)驗(yàn)條件的選擇和方法學(xué)考察資料和數(shù)據(jù)， 空白試驗(yàn)說明雜質(zhì)干擾及排除情況，附有關(guān)圖譜如最大吸收波長(zhǎng)選擇圖、 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，色譜圖包括空白試驗(yàn)圖，薄層色