新藥的方法學(xué)考察

1、3.方法學(xué)考察新藥可以引用藥典或文獻(xiàn)收載的與其相同成分的測定方法，但因品種不同，與自行建立新方法一樣均要進(jìn)行方法學(xué)考察研究。一般考察項目如下：（1 ）提取條件的選定 優(yōu)選提取條件對測定結(jié)果有直接影響、特別對于制劑中含有藥材原粉的，即由組織細(xì)胞中提出有關(guān)成分，提取方法的選擇尤為關(guān)鍵，常見的提取方法有冷浸、熱浸回流、索氏提取器提取、超聲波提取等，濾除殘渣即得提取液。對提取液的取舍一 般有兩種方法，一種為取全量，即充分洗凈殘渣，并將洗滌液合并于提取液中；另一種為取 一定量，即在提取前精密加入定量溶劑，稱重，提取后再補充提取過程損失的溶劑，搖勻，過濾，精密吸取-定量的提取液進(jìn)行含量測定，最后結(jié)果按相當(dāng)

2、的樣品量計算，即得。提取條件的確定，一般要有不同溶劑、不同提取方式、不同時間以及不同溫度、PH值等條件比較而定，可參考文獻(xiàn)，重點對比某種條件也可用正交試驗全面優(yōu)選條件，再配合回收率試驗或與經(jīng)典方法比較，從而估計方法的可靠性。（2 ）分離純化 根據(jù)被測成分的性質(zhì)，采用一定方法，排除干擾物質(zhì)，使供試樣品達(dá) 到一定純凈度。特別是氣相、液相色譜分析更應(yīng)注意此點，以提高分析準(zhǔn)確性并可保護(hù)色譜 柱。（3 ）測定條件的選擇 如比色法、高效液相、薄層掃描法中最大吸收波長的選擇，液 相色譜法中固定相、流動相、內(nèi)標(biāo)物的選擇，薄層掃描法層析與掃描條件的選擇等。（4 ）空白試驗 在色譜法中常用陰陽對照法，即以被測成分

3、或藥材與除去該成分或該 藥材的成藥作對照， 可考察被測成分的斑點（或峰）位置是否與干擾組分重迭，以確證測定 指標(biāo)（如吸收度、蜂面積）是否僅為被測成分的響應(yīng)，防止假陽性的誤判。紫外分光光度法 或比色法中的空白對照液常見的有溶劑空白、試劑空白（溶劑加顯色劑），對復(fù)方制劑也須同色譜法做陰性對照確證吸收度僅為被測成分的響應(yīng)。對單一成分或大類成分測定，均須 做此試驗。（5 ）樣品濃度與響應(yīng)值樣品濃度與吸收度或色譜峰面積（或峰高）之間的線性關(guān)系考 察、即標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。紫外分光光度法或比色法須制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，用以確定取樣量并計算含量。色譜法一般均采用對照品比較法如外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法測定，但也必須進(jìn)行線性考察，目

4、的有三：a.確定樣品濃度與峰面積或峰高是否呈線性關(guān)系；b.確定線性范圍，即適用的樣品點樣或進(jìn)樣量的確定；c.直線是否通過原點，以確定是以一種或二種對照品量（即一點法或二點法）測定并計算。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)應(yīng)在 0.999以上，薄層掃描法可在 0.995以上。（6） 測定方法的穩(wěn)定性實驗 此項考察目的是選定最佳的測定時間范圍。用紫外分光 光度法、比色法或薄層掃描法等測定時， 應(yīng)對被測液或薄層色譜斑點的吸收度值穩(wěn)定性進(jìn)行 考察，即每隔一定時間測定一次，延續(xù) 3-4小時，視其是否穩(wěn)定，以確定適當(dāng)?shù)臏y定時間。（7）精密度試驗 如氣相、液相色譜法對同一供試液多次進(jìn)樣測定，簿層掃描法對同一薄層板及異板多個同

5、量斑點掃描測定，可考察其精密度，對同一薄層斑點連續(xù)進(jìn)行多次測定，則可考察儀器精密度。（ 8）重復(fù)性試驗 按擬定的含量測定方法，對同一批樣品進(jìn)行多次測定（平行試驗至 少 5 次以上，即 n>5 ），計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（ RSD ），一般要求低于 5% 。同一人測定多次 稱重復(fù)性，不同人或?qū)嶒炇覝y定稱再現(xiàn)性。（ 9）檢測靈敏度及檢測下限的測定， 分析方法的靈敏度一般以工作曲線的斜率表示。 其值越大 .方法的靈敏度就越高。 色譜法的靈敏度可以用峰高（ mm ）/ 對照品量（ mg ）表示。 最小檢出量即檢測下限， 一般按經(jīng)驗法設(shè)計數(shù)個不同進(jìn)樣量， 以目測估計最小儉出量。 有時 常把最小檢

6、出量理解為靈敏度，實際上兩者概念不同。（ 10）回收率試驗 含測方法的建立，多以回收率估計分析的誤差和操作過程的損失， 以評價方法的可靠性?；厥章蕦嶒炘O(shè)計也有多種，在中成藥分析中常見的有以下幾種； 加樣回收 ，即于已知被測成分含量的成藥中再精密加入一定量的被測成分純品， 依法 測定。 用實測值與原樣品中含測成分之差， 除以加入純品量計算回收率 。此法不用制備空白 對照， 模擬真實性好。 對單味藥材的回收率測定， 因不易制備除去被測成分的藥材空白對照 品，只能用加樣回收法， 如用提凈被測成分的藥渣作空白，則意義不大，因為在除去被測成 分的同時，干擾成分也被除去了。在加樣回收實驗中首先須注意純品的

7、加人量與取樣量中被測成分之和必須在標(biāo)淮曲線 線性關(guān)系范圍之內(nèi)； 外加純品的量要適當(dāng)， 過小則引起較大的相對誤差， 過大則干擾成分相 對減少，真實性差。 一般加入量與所取樣品含量之比控制在1：1 左右 。對于加樣回收的計算方法， 也有用實測值除以理論總量 （樣品中所含被測成分量與加入 純品旦之和）計算的，但仍以前述計算方法為公認(rèn)。 以成藥空白（即除去欲測藥材后制成的成藥），精密加入被測化學(xué)成分純品，依法測定。以加入純品量為理論值，由實測值計算回收率。此法理論值較準(zhǔn)確，但其不足是缺少成 藥中被測藥材本身的雜質(zhì)干擾條件， 模擬真實性差， 特別是被測藥材組分復(fù)雜， 如人參被測 成分為人參皂苷 Re、因

8、與該成分共存的同系物或類同成分人參皂苷較多，其自身分離度重 現(xiàn)性差，而只以加入純品測定回收率，與人參皂苷 Re 的干擾情況則無從反映。故此種回收 率測定只能用于被測藥材成分較為單一者。 取成藥空白， 精密加人已知被測成分含量的藥材， 依法測定。 以加入藥材所相當(dāng)?shù)谋?測成分量為理論值， 再由實測值除以理論值計算回收率。 此法模擬真實性好， 能反映被測藥 材中其它成分的干擾情況， 但由于已知含量藥材也是同法測得的平均值， 故其理論值實際包 括正負(fù)誤差在內(nèi)，有時也能掩蓋系統(tǒng)誤差。特別是單味原料（藥材）制劑，仍以采用加樣回收法為宜。回收率試驗至少需進(jìn)行5次試驗（n = 5）,或三組平行試驗（n =

9、6）,在同一批樣品中加入相同或不同純品量，后者可進(jìn)一步驗證測定方法中取樣量多少更為合適?；厥章室话阋笤?95105%，些方法操作步驟繁復(fù)，可要求略低至少不小于90%。4 含量測定方法實驗設(shè)計中應(yīng)注意的幾個問題（ 1）提取問題 對含藥材原粉的制劑，如采用取部分提取液的測定方法，不宜將樣品 粉末直接置容量瓶中定容， 因為中藥含量測定的取樣量往往較大， 且藥粉不溶于水， 其固體 體積不可忽視。 例如將 0.5g 九分散于 10m1 容量瓶中， 以刻度吸管加入溶劑約 7mL 即已至 量瓶刻度?？蓪悠贩Q人具塞錐形瓶中，精密加入溶劑 10m1 計算全量。（2）測定大類成分如總黃酮、總皂苷等問題 如所測

10、總成分以某一單體成分為對照品制定標(biāo)推曲線并計算， 應(yīng)首先考慮對照品溶液 與供試品溶液最大吸收波長是否一致， 有的相差很大或供試品溶液根本無最大吸收， 方法則 不能成立。 陰性（空白）對照液即除去欲測成分的藥材原料制備的樣品液，依法測定其吸收圖譜，與基線吻合，或略有吸收，在無其它方法可循的情況下，其吸收值若低至樣品吸收值5% 以下可忽略不計。 因考察中藥多為天然藥物，含量幅度較大，又為大復(fù)方，不可認(rèn)為無吸收峰 即視為無干擾。 按上述方法制備背景空白以消除干擾是不可行的。例如樣品吸收值為0.6，而陰性對照液吸收值為0.2，即以0.6 0.2 = 0.4計算樣品含量。由于處方原料不相同，工藝未知，

11、配制出的背景空白不可能條件相同， 吸收值差異較大， 故此方法無推廣價值。 只有在原料來 源不變，工藝穩(wěn)定的情況下作為企業(yè)內(nèi)部的質(zhì)控方法暫時使用。 為了消除其它組分干擾， 采用導(dǎo)數(shù)光譜或二波長， 三波長等方法測定單一或大類成分， 僅可用于藥味較少的制劑， 其空白試驗取多批次樣品測定， 結(jié)果一致才可采用。 因中藥復(fù)方 與西藥不同， 后者所謂干擾組分均為結(jié)構(gòu)已知具有一定規(guī)格的成分， 而中藥則大部為未知成 分且不衡定，有些測定只有一次性的意義，不具重現(xiàn)性。（ 3）回收率測定問題 在一些實驗設(shè)計中，常見到所謂的加樣回收測定，不是在稱樣 開始時即加入純品， 而是將其加至制備好的供試品溶液中， 這樣不能考察

12、提取、 純化過程中 被測成分是否損失； 也有在薄層掃描試驗中， 于薄層板上依次點對照品溶液、 供試品溶液及 對照品與供試品重疊點于同一原點上， 測定后計算， 這只能反映板上的回收率， 而不能代表 全部含量測定方法的回收率。（ 4）對照品問題 含量測定用對照品只能用化學(xué)純品，不可用藥材對照品，因為不可 能得到所含成分含量同一的樣品。測定大類成分如皂苷也不宜采用總皂苷為對照品， 因總皂苷組分復(fù)雜， 各成分比例不穩(wěn) 定，不同批次的皂苷難于保持一致， 從而使含量測定結(jié)果不穩(wěn)定。 測定總皂苷時， 采用同系 物之一的化學(xué)單體并以其計算，定出限度是可行的。如測定人參總皂苷，以人參皂苷Rbl、Re 等作對照品

13、并計算。 但如處方中含有的不同藥味皂苷成分結(jié)構(gòu)差異較大，有的甚至不是 皂苷而是其它各種苷類，例如處方中有黃芪、人參、地黃、知母、赤芍等，而以黃芪甲苷或 人參皂苷 Re 為對照品測定并計算含量，科學(xué)根據(jù)不足，不能成立。5 含量限度的制定含量限度是在檢驗方法確定的基礎(chǔ)上， 積累足夠的數(shù)據(jù)后總結(jié)提出的。 成藥的合格是建 立在藥材原料的質(zhì)量保證上的。 日本對栽培藥材常收集上百件樣品進(jìn)行測定， 對結(jié)果做分布 分析，有的下限取在去除約 5% 樣品的數(shù)值上，即將占總量 5% 的質(zhì)量最差、分布極小的樣 品判為不合格。 我國則根據(jù)寶貴的傳統(tǒng)鑒別經(jīng)驗， 將藥材樣品依質(zhì)量優(yōu)劣順序排列， 如所測 成分含量高低與之相應(yīng)

14、， 則將質(zhì)次但仍可藥用者取為下限。 必須強調(diào)的是， 含量限度的制定 應(yīng)有足夠的、 具代表性的樣品數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)。 否則就不能反映實際情況， 實踐中勢必會遇到種 種問題。新藥申報生產(chǎn)時應(yīng)積累 10 批以上的含量數(shù)據(jù)，提出限度。中藥制劑含量限度規(guī)定的方式， 根據(jù)現(xiàn)行各級標(biāo)準(zhǔn)有以下幾種。 一種是規(guī)定下限， 如藥 典中收載戊己九，對所測成分如黃連中總生物堿以鹽酸小劈堿計不得少于 3.0% ，六味地黃 丸，山茱萸中熊果酸、丹皮中丹皮酚分別為不得少于0.020% 、 0.070% （大蜜九）；一種是規(guī)定幅度，如部頒標(biāo)推進(jìn)口西洋參藥材含人參總皂為510% ,含西洋參制劑則應(yīng)根據(jù)處方量及工藝制相關(guān)數(shù)值規(guī)定制劑含量

15、幅度；另一種為規(guī)定標(biāo)示量，如2005 版藥典中收載華山參片，規(guī)格為 0.12mg/ 片，規(guī)定含生物堿以其莨菪堿計應(yīng)為標(biāo)示量的 80.0 120.0% 。應(yīng)該強調(diào)指出中成藥與某些制劑不同， 如甘草流浸膏類可根據(jù)甘草酸的含量調(diào)節(jié)甘草浸 膏的投料量， 而中藥則必須保證處方不變， 成品率穩(wěn)定。 因此只有投入合格的原料才能保證 成藥的質(zhì)量。關(guān)于中成藥的含量表示方法，有 %、mg/片、g/丸、mg/m1 （液體制劑）等。凡藥品中 規(guī)定有含量測定項的， 其原料藥材必須對成品中所測成分規(guī)定含量限度，防止盲目投料， 可限定為本制劑專用的原料藥材規(guī)格， 暫不要求代表全國各地藥材的質(zhì)量，達(dá)不到要求者可以不進(jìn)貨，不投料，以保證產(chǎn)品質(zhì)量。六、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草說明起草說明是質(zhì)量標(biāo)淮制定的詳盡的技術(shù)資料。 對質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中各項均應(yīng)作逐項說明。 名稱、 處方、制法、功能主治、用法用量等，在申報資料中各有要求，故在起草說明中可以簡要概 述，但不可從略。而有關(guān)檢定該藥真?zhèn)蝺?yōu)劣各項均應(yīng)重點詳細(xì)說明。對鑒別、 含量測定藥味各測定成分的選擇依據(jù)，方法原理， 實驗條件的選擇和方法學(xué)考察資料和數(shù)據(jù)， 空白試驗說明雜質(zhì)干擾及排除情況，附有關(guān)圖譜如最大吸收波長選擇圖、 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，色譜圖包括空白試驗圖，薄層色