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1、基于PCR信號(hào)放大的微量蛋白檢測(cè)技術(shù)主要內(nèi)容鄰位連接分析技術(shù)(proximity ligation assay)鄰位延伸分析技術(shù)(proximity extension assay)CytoploRare 技術(shù)一、PLA技術(shù)(鄰位連接分析技術(shù))背景:瑞典ULF Landegren 研究小組2002年提出了一種新的蛋白體外分析方法-鄰位連接技術(shù)(proximity ligation assay , PLA),通過(guò)一對(duì)親和探針對(duì)目的分子雙識(shí)別,繼而產(chǎn)生可擴(kuò)增的檢測(cè)信號(hào),從而將對(duì)蛋白質(zhì)的檢測(cè)轉(zhuǎn)變成為對(duì)DNA 的檢測(cè),實(shí)現(xiàn)了微量蛋白的分析。是一種研究蛋白定量、定位、相互作用、修飾以及功能的新蛋白分析技
2、術(shù)。PLA反應(yīng)原理1.當(dāng)識(shí)別同一抗原上的兩個(gè)抗體結(jié)合到抗原,則抗體上偶聯(lián)寡核苷酸序列彼此靠近。2.溶液中可以與這兩個(gè)探針末端互補(bǔ)的連接片段的作用下,形成有一個(gè)斷裂點(diǎn)的dsDNA片段。3.在DNA連接酶的作用下形成完整的dsDNA。4.以連接完整的DNA作為模板,進(jìn)行定量PCR的檢測(cè);靶抗原的濃度與DNA模板的量成比例,進(jìn)行蛋白定量轉(zhuǎn)化。PLA基本過(guò)程共分為3步:孵育:孵育:樣品與靶特異性抗體的一對(duì)鄰位探針共孵育連接:連接:結(jié)合到同一蛋白上的鄰位探針與連接片段雜交并發(fā)生鄰位連接反應(yīng),形成一個(gè)環(huán)狀的蛋白質(zhì)一蛋白識(shí)別分子一單鏈DNA復(fù)合物擴(kuò)增:擴(kuò)增:qPCR擴(kuò)增復(fù)合物中的單鏈DNA部分PLA類型PL
3、A可分為三種:均相(液相)、固相和原位均相(液相)、固相和原位。 均相(液相)均相(液相),待測(cè)樣品、探針、熒光PCR引物以及連接試劑加入同一管中進(jìn)行熒光定量PCR,適用于微量蛋白質(zhì)的快速檢測(cè)。 固相固相,待測(cè)蛋白預(yù)先固定于微孔板上,洗滌去除未結(jié)合分子,去除游離探針,檢測(cè)含量過(guò)低的蛋白。原位原位,鄰位探針與待測(cè)的2個(gè)具有相互作用的蛋白質(zhì)分子分別結(jié)合,反應(yīng)體系中加入的DNA短序列與探針上的DNA鏈互補(bǔ),在連接酶的作用下形成環(huán)狀DNA,RCA擴(kuò)增。蛋白互作、細(xì)胞或組織內(nèi)定位的PLA方法。 PLAPLA類型根據(jù)抗體類型:直接直接PLA與間接間接PLAA圖直接PLA,B圖間接PLA,區(qū)別在于間接法用到
4、的探針為二抗連接的親和探針,一抗為捕獲抗體。PLA技術(shù)檢測(cè)蛋白的核心鄰位探針鄰位探針:不同的DNA單鏈與一對(duì)蛋白識(shí)別分子相結(jié)合形成,使其通過(guò)免疫吸附的方式結(jié)合到待測(cè)蛋白上。為什么說(shuō)PLA的核心是一對(duì)鄰位探針?1.DNA與蛋白結(jié)合效率低。2.通過(guò)篩選(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)SELEX)技術(shù),難以得到與蛋白分子高特異性、高親和力的核酸適體。3.核酸適體的種類有限,難以滿足PLA實(shí)驗(yàn)要求。以上三個(gè)原因,限制了PLA的發(fā)展應(yīng)用PLA探針的發(fā)展探針的發(fā)展: 核酸適體:從一個(gè)體外合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選出與靶分子特異性結(jié)合的小分子DNA。缺點(diǎn):盲目、過(guò)程繁瑣,核酸適配體種類有限。 化學(xué)法:多功能交換
5、試劑SMPB:抗體與巰基修飾的單鏈DNA結(jié)合。 生物法:streptavidin與biotin高親和力。PLA探針已經(jīng)走向商業(yè)化,Solulink公司可定做抗體DNA復(fù)合探針,可直接用于PLA反應(yīng)。PLA國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀國(guó)外:國(guó)外:Olink公司在PLA方面做了較多基礎(chǔ)研究,并對(duì)PLA技術(shù)申請(qǐng)了專利。相關(guān)產(chǎn)品:Dolink(13000RMB)該技術(shù)平臺(tái)于2015年12月被sigma-Aldrich公司收購(gòu),目前該產(chǎn)品正是該公司網(wǎng)站上的主推產(chǎn)品。國(guó)內(nèi):國(guó)內(nèi):目前處于實(shí)驗(yàn)室研究階段,無(wú)相關(guān)產(chǎn)品從2010年到2014年鄰位連接技術(shù)的文獻(xiàn)引用次數(shù)從41次到156次,到2015年關(guān)于PLA技術(shù)的報(bào)道為55
6、篇。Olink公司PLA技術(shù)Olink公司PLA技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域蛋白質(zhì)互作及其修飾的檢測(cè)細(xì)胞蛋白定位分析數(shù)字化定量采用熒光染色,沒(méi)有復(fù)雜判讀標(biāo)準(zhǔn),極有可能取代免疫組化Olink公司PLA 檢測(cè)原理蛋白In Situ (原位)檢測(cè)抗體偶聯(lián)親和探針為正負(fù)鏈,再加入與正負(fù)鏈兩端同時(shí)互補(bǔ)的寡核苷酸序列(a,b),而這兩條鏈在探針鏈上存在一個(gè)斷裂點(diǎn),在連接酶的作用,連接成為一個(gè)環(huán)狀DNA。以正鏈探針為引物,以環(huán)狀DNA為模板,進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增(RCA),得到單鏈的串聯(lián)PCR。定量方法Olink 采用了終點(diǎn)定量的方法,加入熒光雜交探針,在熒光顯微鏡下檢測(cè)。PLA的應(yīng)用舉例1. 檢測(cè)穩(wěn)定、瞬時(shí)和微弱的蛋白互作(可視
7、化)Fig. 1 培養(yǎng)48 h的大鼠胚胎海馬神經(jīng)元,原位顯示ER (雌激素受體)與DYX1C1在神經(jīng)突觸中的互作。紅色:ER alpha/DYX1C1復(fù)合物;綠色:actin蛋白;藍(lán)色:細(xì)胞核PLA的應(yīng)用舉例2.檢測(cè)蛋白的翻譯后修飾Fig. 2 EGF(表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)刺激前后,用免疫熒光染色和PLA方法檢測(cè)U343細(xì)胞中EGFR磷酸化水平的變化。PLA方法可以檢測(cè)到EGFR的激活,而IF方法則不能。紅色:磷酸化的EGFR蛋白;藍(lán)色:細(xì)胞核傳統(tǒng)分析方法需要:凝膠電泳、質(zhì)譜、高效液相色譜法和免疫組化結(jié)合。PLA的應(yīng)用舉例3.高靈敏度的檢測(cè)低豐度蛋白的表達(dá)Fig. 3 分別用免疫熒光和PLA方法
8、檢測(cè)A431細(xì)胞中EGFR的表達(dá)。與IF方法相比,PLA方法的信噪比高出100倍。紅色:EGFR蛋白;藍(lán)色:細(xì)胞核如果需要在天然狀態(tài)下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究,必需對(duì)目的蛋白質(zhì)進(jìn)行過(guò)表達(dá)、標(biāo)記或遺傳修飾。PLA的應(yīng)用舉例4.數(shù)字化定量 在定量過(guò)程中,可以對(duì)細(xì)胞和組織的圖像進(jìn)行分析。通過(guò)細(xì)胞核的自動(dòng)檢測(cè),以及細(xì)胞質(zhì)大小的估算,研究者能夠?qū)M織或細(xì)胞群中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平進(jìn)行單細(xì)胞統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。Stadler, Charlotte, et al. (2012) Immunofluorescence and fluorescent-protein tagging show high correlation fo
9、r protein localization in mammalian cells. Nature. doi:10.1038/nmeth.2377二、PEA(鄰位延伸技術(shù)) 鄰位延伸分析技術(shù)(PEA), 不需要額外的寡核苷酸將探針拉近連接,其兩條探針末端含有5bp配對(duì)堿基,在延伸酶的作用下形成雙鏈模板,利用qPCR進(jìn)行檢測(cè),有效的避免探針的損失。PEA相關(guān)的產(chǎn)品國(guó)外:國(guó)外:Olink擁有該技術(shù)的相關(guān)專利,并推出了相關(guān)產(chǎn)品 產(chǎn)品品牌:Proseek Multiplex 蛋白高通量檢測(cè)國(guó)內(nèi):國(guó)內(nèi):未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道左圖:抗體識(shí)別正確且鄰位探針可以形成互補(bǔ)結(jié)構(gòu) 中圖:抗體交叉反應(yīng),但鄰位探針無(wú)法形成互補(bǔ)結(jié)
10、構(gòu) 右圖:PEA反應(yīng)過(guò)程,采用微流控芯片qPCR系統(tǒng)檢測(cè)Olink公司PEA技術(shù)特點(diǎn)Olink 公司 PEA 特點(diǎn):1.qPCR定量采用微流控芯片,實(shí)現(xiàn)了蛋白高通量的定量檢測(cè)(96樣本x96種抗體探針對(duì)):可以同時(shí)檢測(cè)96個(gè)樣本,和96組引物(探針);實(shí)現(xiàn)了多個(gè)指標(biāo)的高通量檢測(cè)。2.樣本加樣可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化3.樣本加樣量少:體積1uL、血清、血漿等4.檢測(cè)靈敏度 優(yōu)于ELSA ,檢測(cè)濃度可到達(dá)fg/mL(10-15),較寬檢測(cè)線性范圍(105)反應(yīng)區(qū)引物(探針)孔引物(探針)孔樣本孔樣本孔PEA技術(shù)的應(yīng)用左圖:PEA 檢測(cè)IL-18線性范圍:0.24-31250pg/mL右圖:ELISA 檢測(cè)IL
11、-18 線性范圍:78-5000pg/mL細(xì)胞因子IL-18的檢測(cè)Olink公司基于PLA與PEA的服務(wù)Olink 公司提供下面幾個(gè)方面的服務(wù): 心血管疾病標(biāo)志物物的檢測(cè) 神經(jīng)疾病方面標(biāo)志物物的檢測(cè) 腫瘤相關(guān)標(biāo)志物(92種腫瘤相關(guān)蛋白)的研究服務(wù) 主要是用于科研服務(wù),尚未發(fā)現(xiàn)臨床試驗(yàn)報(bào)道三、國(guó)內(nèi)基于PCR信號(hào)放大技術(shù)-CytoploRare CFDA 2016年01月11日批準(zhǔn)了國(guó)內(nèi)首個(gè)通過(guò)PCR信號(hào)放大檢測(cè)肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞試劑盒-CytoploRare (靶向PCR CTC)格諾思博生物科技有限公司(南通)格諾思博生物科技有限公司(南通)用途:定量檢測(cè)肺癌血清中葉酸受體陽(yáng)性循環(huán)腫瘤細(xì)胞,用于
12、肺癌的輔助診斷與療效評(píng)估。CytoploRare 技術(shù)特點(diǎn) 免疫磁珠反向富集循環(huán)細(xì)胞 循環(huán)細(xì)胞與偶聯(lián)寡核苷酸探針的葉酸分子結(jié)合;3.洗滌;4.將與細(xì)胞結(jié)合的葉酸-寡核苷酸探針從細(xì)胞上解離下來(lái);5.含有寡核苷酸探針的洗脫液加入25uL的PCR mix 溶液中;6. 進(jìn)行qPCR (Taqman 探針?lè)ǎ?,?jì)算樣本中寡核苷酸的濃度;并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換為CTC units相對(duì)單位。免疫磁珠反向富集CTC檢測(cè)示意圖CytoploRare 用于臨床上圖:肺癌CTC 檢測(cè)在臨床應(yīng)用方面,靈敏度73.2%、特異性84.1%,優(yōu)于其他常用標(biāo)志物。不同檢測(cè)技術(shù)的比較優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)PLA高靈敏度探針存在損失PEA高靈敏度探針不存在損失免疫PCR高靈敏度非特異性吸附、檢測(cè)背景信號(hào)高ELISA技術(shù)平臺(tái)成熟樣品量大、手工操作,干擾因素多WB技術(shù)平臺(tái)成熟操作復(fù)雜,難以做成商品化總結(jié)基于PCR信號(hào)放大檢測(cè)方法,
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