大鼠神經(jīng)干細(xì)胞缺氧后的內(nèi)源性促紅細(xì)胞生成素表達(dá)規(guī)律

1、    大鼠神經(jīng)干細(xì)胞缺氧后的內(nèi)源性促紅細(xì)胞生成素表達(dá)規(guī)律             作者：孫崇毅，姚猛，陳立民，劉慶鵬，吉光榮，王巖松【關(guān)鍵詞】  缺氧     摘  要：目的觀察神經(jīng)干細(xì)胞缺氧后的內(nèi)源性促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）表達(dá)規(guī)律，初步探討缺氧預(yù)處理誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。方法測(cè)定大鼠神經(jīng)干細(xì)胞缺氧培養(yǎng)4 h后不同時(shí)間的內(nèi)源性EPO

2、表達(dá)情況，以及預(yù)處理后不同時(shí)間，再次遭受致死劑量缺氧傷害后的EPO表達(dá)情況。結(jié)果缺氧時(shí)間為4 h，EPO蛋白在處理后即刻出現(xiàn)表達(dá)，4 h達(dá)高峰，8 h仍有部分表達(dá)。再次遭受致死劑量缺氧傷害后，與預(yù)處理4 h組相比，預(yù)處理24 h組細(xì)胞的EPO表達(dá)量明顯增多。結(jié)論缺氧預(yù)處理能夠提高神經(jīng)干細(xì)胞應(yīng)對(duì)傷害刺激時(shí)內(nèi)源性EPO的表達(dá)，并降低再次缺氧時(shí)誘導(dǎo)EPO表達(dá)的閾值。    關(guān)鍵詞：缺氧；  預(yù)處理；  干細(xì)胞；  促紅細(xì)胞生成素    Abstract：ObjectiveTo investigate the e

3、ndogenous erythropoietin expression of neural stem cells(NSCs) of rats after hypoxia.MethodWe used a rat NSCs culture model. EPO expression after 4 hours of hypoxia was studied. It was examined again following 12 hours of hypoxic lethal insult which was applied various times after hypoxic preconditi

4、oning. EPO expression was studied by western blotting.ResultFollowing the preconditioning, expression of EPO increased immediately and reached a peak 4 hours later.It lasted till 8 hours later.While applied the lethal hypoxia,EPO expression of cells in preconditioning 24 hours group were was signifi

5、cantly increased than that in preconditioning 4 hours group.ConclusionThe hypoxic preconditioning can lead an increased endogenous EPO expression and decrease the threshold of EPO expression against subsequent lethal stimulation during a certain period.    Key words：Hypoxia;  Pre

6、conditioning;  Stem cells;  Erythropoietin   脊髓損傷是一種致殘率很高的疾病。神經(jīng)功能恢復(fù)多不理想。神經(jīng)干細(xì)胞是一類具有自我更新能力和多種分化潛能的細(xì)胞，體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞移植治療脊髓損傷成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一。但細(xì)胞絕對(duì)數(shù)量和移植后局部微環(huán)境所限，使移植后細(xì)胞存活率不高1，限制了其神經(jīng)功能修復(fù)作用，影響移植效果。最近研究表明，短時(shí)間缺氧處理可以有效提高各種組織應(yīng)對(duì)傷害性刺激的能力，稱之為缺氧預(yù)處理。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，探討大鼠神經(jīng)干細(xì)胞缺氧處理后內(nèi)源性促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）

7、表達(dá)的規(guī)律，以期為神經(jīng)干細(xì)胞缺氧預(yù)處理理論提供依據(jù)。    1  材料與方法    11  實(shí)驗(yàn)材料    111  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物    孕13天的SD（SpragueDawley）大鼠，由哈醫(yī)大二院動(dòng)物中心提供。    112  主要試劑  DMEM/ F12 (11) （Gibco）；B27（Gibco）；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF) 和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)（Pepro Tech）；Ant

8、iNestin兔抗多克隆抗體 (武漢博士德)；AntiEPO兔抗多克隆抗體 (武漢博士德)；SP羊抗兔二抗試劑盒及DAB顯色盒(北京中杉)。    12  實(shí)驗(yàn)方法    121  原代神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)  取孕13 d的SD大鼠脫頸椎處死，無(wú)菌條件下取出胎鼠大腦半球，冰浴下剝離腦膜及血管，將腦組織盡量剪碎，濾液離心（900 rmin，5 min），棄去上清液， 加入含20 g/L EGF、125 g/L bFGF和2B27的DMEM/F12（11）培養(yǎng)液中，吹散細(xì)胞后吸出，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)

9、胞密度至1×105ml。23 d半量換液。    122  神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定  行Nestin免疫組化，抗體工作濃度為1100，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。    123  缺氧預(yù)處理?xiàng)l件的應(yīng)用  無(wú)菌條件下,將95%N25% CO2的氣體通入DMEM/F12培養(yǎng)基中5 min，置換培養(yǎng)基及培養(yǎng)瓶中的氧氣，神經(jīng)干細(xì)胞用此培養(yǎng)基全量換液后，移入37 ，PO2為0條件的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)預(yù)定時(shí)間。以4 h為缺氧預(yù)處理?xiàng)l件，12 h為致死性缺氧處理?xiàng)l件。    124

10、  神經(jīng)干細(xì)胞缺氧處理后的EPO蛋白表達(dá)  以缺氧4 h為處理?xiàng)l件，檢測(cè)處理后不同時(shí)間EPO蛋白的表達(dá)。缺氧預(yù)處理后，分別繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)4、24 h，給與致死性缺氧12 h處理，于處理后即刻、4 h檢測(cè)EPO蛋白的表達(dá)。未經(jīng)預(yù)處理的細(xì)胞做對(duì)照組。    檢測(cè)方法采用Western blot法，將待檢測(cè)細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS) 漂洗后，裂解緩沖液,作用30 min 后離心。凝膠電泳分離,轉(zhuǎn)膜后, TTBS封閉。加入兔抗大鼠EPO抗體,4 孵育過(guò)夜,漂洗后加入相應(yīng)的特異性HRP二抗,37 作用60 min ,洗膜后ECL試劑盒顯色。以actin做

11、內(nèi)參照，用Total Lab v 201軟件定量檢測(cè)蛋白表達(dá)。    13  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    數(shù)據(jù)用SPSS 100軟件分析，t檢驗(yàn)，P<001時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2  結(jié)  果    21  細(xì)胞培養(yǎng)    原代取材，鏡下觀察可見(jiàn)大量細(xì)胞，胞體光滑圓潤(rùn)，胞質(zhì)透亮，折光性強(qiáng)。24 h內(nèi)細(xì)胞開(kāi)始聚集、分裂；57 d時(shí)，細(xì)胞聚集生長(zhǎng)呈神經(jīng)球，懸浮生長(zhǎng)。對(duì)所獲神經(jīng)球檢測(cè)顯示，球內(nèi)幾乎所有的細(xì)胞都呈Ne

12、stin陽(yáng)性，說(shuō)明培養(yǎng)所獲得的神經(jīng)球?yàn)樯窠?jīng)干細(xì)胞球。    22  神經(jīng)干細(xì)胞缺氧處理后的EPO表達(dá)    Western blot法顯示，未經(jīng)缺氧處理，NSCs幾乎無(wú)EPO表達(dá)；EPO蛋白的表達(dá)于處理后即刻開(kāi)始出現(xiàn)，4 h最為明顯，8 h仍有少量表達(dá)（圖1）。 圖1  缺氧預(yù)處理后不同時(shí)間EPO的表達(dá)  1對(duì)照組（無(wú)缺氧）；2預(yù)處理后即刻；3預(yù)處理后2 h；4預(yù)處理后4 h；5預(yù)處理后6 h；6預(yù)處理后8 h致死性缺氧處理后，各組細(xì)胞EPO的表達(dá)見(jiàn)圖2，經(jīng)Total Lab軟件處理后的蛋白表達(dá)相對(duì)光密度

13、值見(jiàn)圖3。致死性缺氧處理后1 h，預(yù)處理4 h組和24 h組的EPO蛋白表達(dá)相對(duì)光密度值均明顯高于對(duì)照組，4 h組和24 h組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。致死性缺氧處理后4 h，對(duì)照組相對(duì)光密度較處理后1 h下降；預(yù)處理4 h組相對(duì)光密度較處理后1 h有所增加，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；預(yù)處理24 h組相對(duì)光密度較處理后1小時(shí)明顯增加，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<001，說(shuō)明該組細(xì)胞再次經(jīng)受致死性缺氧處理后4 h，其EPO蛋白表達(dá)明顯增多。 圖2  致死劑量缺氧處理后各組細(xì)胞EPO的表達(dá)  LH：致死劑量組  LH4：致死劑量后4 h組  PH4LH：預(yù)處理后4 h加致死劑量組

14、PH4LH4：預(yù)處理后4 h加致死劑量后4 h組  PH24LH：預(yù)處理后24 h加致死劑量組  PH24LH4：預(yù)處理后24 h加致死劑量后4 h組  圖3  缺氧預(yù)處理對(duì)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞EPO表達(dá)相對(duì)光密度值的影響  1LH  2LH4  3PH4LH  4PH4LH4  5PH24LH  6PH24LH4  P<001  P>001    3  討  論    脊髓損傷后的神經(jīng)功能

15、修復(fù)一直是困擾臨床醫(yī)師的難題之一。長(zhǎng)期以來(lái)認(rèn)為，成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)是不可能再生的，即神經(jīng)元是終末細(xì)胞，不能通過(guò)分裂增殖產(chǎn)生新神經(jīng)元以替換死亡的神經(jīng)元。因此，脊髓損傷的治療更多著眼于繼發(fā)性損傷的處理，神經(jīng)組織受損導(dǎo)致的功能喪失成為不可逆的過(guò)程。神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)提供了重要的途徑，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)2，這一發(fā)現(xiàn)改變了神經(jīng)系統(tǒng)損傷后不能“再生”的傳統(tǒng)概念。由于干細(xì)胞的多潛能分化特性，體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的神經(jīng)干細(xì)胞重新移植至體內(nèi)，他們不但能生長(zhǎng)、存活，而且能遷移分化并發(fā)揮功能。這些過(guò)程是受局部環(huán)境中的特異性信號(hào)調(diào)控3，同時(shí)受到移植區(qū)局部環(huán)境內(nèi)各種有害因素的影響4，使得存活的神經(jīng)干

16、細(xì)胞比例過(guò)低。細(xì)胞密度低于一定水平時(shí)，細(xì)胞間各種因子、分子的濃度就達(dá)不到神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)的要求，從而又進(jìn)一步不利于其生長(zhǎng)分化，形成惡性循環(huán)，這也正是影響移植效果的重要原因1。因此，提高植入的神經(jīng)干細(xì)胞抵御周?chē)鷤π砸蛩氐挠绊?，提高存活率，是取得移植成功的關(guān)鍵之一。    近年來(lái)，有學(xué)者提出了“預(yù)處理”的概念，這是細(xì)胞的一種內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，是指亞致死性傷害性刺激作為預(yù)處理，可以對(duì)繼之而來(lái)的致死性傷害提供一種保護(hù)作用。國(guó)內(nèi)外的大量研究表明，這一保護(hù)性機(jī)制廣泛存在于器官、組織、細(xì)胞水平，在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)也有發(fā)生5。因此，作者可以大膽地假設(shè)，這種預(yù)處理效應(yīng)對(duì)體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞

17、同樣存在。缺氧是細(xì)胞移植后最普遍的傷害刺激之一，因此，作者將缺氧作為刺激條件。而且相對(duì)于一些在體研究，在移植前進(jìn)行離體細(xì)胞預(yù)處理，可以更有效保證受體的安全，使這項(xiàng)技術(shù)具有可操作性。    許多學(xué)者認(rèn)為，機(jī)體組織缺氧后會(huì)提高缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）1亞型的表達(dá)，HIF1通過(guò)作用其下游靶基因介導(dǎo)了缺氧后的一系列病理生理變化，而EPO基因正是HIF1最為重要的下游基因之一。 EPO是一種調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的糖蛋白，近年來(lái)的研究表明，它同時(shí)還具有內(nèi)源性的神經(jīng)保護(hù)作用，可應(yīng)用于各種神經(jīng)組織損傷的治療。在各類神經(jīng)組織的缺氧預(yù)處理過(guò)程中，EPO也發(fā)揮了重要的作用，如神經(jīng)元6、視網(wǎng)膜7

18、等。有關(guān)神經(jīng)干細(xì)胞缺氧預(yù)處理的研究雖無(wú)報(bào)道，但Tetsuro8證實(shí)，一定強(qiáng)度的缺氧可以促進(jìn)體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞EPO mRNA產(chǎn)物的增多以及細(xì)胞增殖。    本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western Blot法，在蛋白水平上進(jìn)一步證實(shí)了神經(jīng)干細(xì)胞缺氧后EPO表達(dá)的變化。EPO蛋白的表達(dá)于缺氧后即刻開(kāi)始出現(xiàn)， 4 h最為明顯，持續(xù)約8 h，和Tetsuro等在EPO基因水平上得出的結(jié)論基本一致8。但同時(shí)也說(shuō)明預(yù)處理劑量的缺氧尚不足以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生持久穩(wěn)定的EPO濃度。但再次經(jīng)受致死劑量的缺氧后，預(yù)處理后24 h的神經(jīng)干細(xì)胞的EPO表達(dá)明顯多于其它組細(xì)胞。因此，我們有理由認(rèn)為，缺氧預(yù)處理

19、可以提高神經(jīng)干細(xì)胞再次遭受致死劑量缺氧時(shí)的內(nèi)源性保護(hù)能力，其原因不完全是因?yàn)轭A(yù)處理提高了細(xì)胞本身EPO的表達(dá)量，更重要的是降低了再次應(yīng)激時(shí)誘導(dǎo)EPO表達(dá)的閾值。這種閾值的降低出現(xiàn)在預(yù)處理后24 h，而不是4 h，說(shuō)明神經(jīng)保護(hù)作用需要一個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程，誘導(dǎo)時(shí)間和持續(xù)時(shí)間在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中都是不同的，同時(shí)和實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物的種屬差異也有關(guān)系。另一個(gè)值得提出的問(wèn)題是，這種保護(hù)作用具有普遍性。Eisen等9認(rèn)為，缺氧預(yù)處理不僅僅針對(duì)進(jìn)一步的缺氧損傷，而對(duì)于其他形式的傷害方式也同樣具有保護(hù)作用。這體現(xiàn)了缺氧預(yù)處理的廣泛性和非特異性，使其更具有應(yīng)用價(jià)值。有關(guān)大鼠神經(jīng)干細(xì)胞缺氧預(yù)處理的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)尚需進(jìn)一步的研究

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