糖化血紅蛋白檢測(cè)原理及意義

1、糖化血紅蛋白（HbA1c）測(cè)定的原理方法及臨床意義綜述2007年3月19日糖化血紅蛋白（HbA1c）測(cè)定的原理方法及臨床意義綜述馮念倫范衛(wèi)華劉捍東（山東省立醫(yī)院濟(jì)南250021）糖尿?。―M）,主要是2型糖尿病的發(fā)病率，目前在世界上無論發(fā)達(dá)國(guó)家還是發(fā)展中國(guó)家均明 顯增加，占免疫病的比率，在發(fā)達(dá)國(guó)家高達(dá)2-5%,而我國(guó)糖尿病的發(fā)病率亦達(dá) 2-3%,并且每年還以1%。的速度增長(zhǎng)。糖尿病是一種終生性疾病，其并發(fā)癥已經(jīng)成為病人至殘和早亡的主要原因，所以人們希望能盡早發(fā)現(xiàn)和治療糖尿病。有資料說美國(guó)用于糖尿病的治療費(fèi)約有 1000億美元，糖尿病已經(jīng)成為世界各國(guó)的主要保健 衛(wèi)生問題，對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥防治的

2、研究是 2 0世紀(jì)后2 0年國(guó)際衛(wèi)生保健研究的重點(diǎn)之O臨床上廣泛采用血糖參數(shù)來判定糖尿病，而血糖參數(shù)只代表抽血時(shí)的血糖水平，對(duì)確診有局限性。近年來的醫(yī)學(xué)研究證明：血液中的糖化血紅蛋白（HbA1c）濃度相對(duì)穩(wěn)定，其濃度值能準(zhǔn)確反映最近2-3個(gè)月期間的血糖水平， 便于醫(yī)生對(duì)糖尿病進(jìn)行早期診斷；也可用于糖尿病人的血糖監(jiān)控及慢性并發(fā)癥的判斷等，受到臨床的廣泛重視，目前我國(guó)各大、中型醫(yī)院正逐漸開展糖化血紅蛋白（HbA1c）占總血紅蛋白（Hb）的百分含量的測(cè)定項(xiàng)目。有些發(fā)達(dá)國(guó) 家已將HbA1c的測(cè)定列入中老年人的常規(guī)體檢項(xiàng)目。測(cè)定HbA1c有多種方法，目前臨床上比較常用的方法有兩種：乳膠凝集反應(yīng)法和離子交

3、換高壓液相色譜法；分別用生化分析儀和糖化血紅蛋白自分析儀進(jìn)行測(cè)定。1、糖化血紅蛋白（HbA1c）的形成及特點(diǎn)血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白Hb會(huì)在高糖的作用下發(fā)生緩慢的非酶促糖化反應(yīng)，血紅蛋白Hb的3鏈N末端繳氨酸上的氨基與葡萄糖的醛基發(fā)生可逆的加成反應(yīng)，形成不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物一醛亞胺（前GHbA1c）迅速重排成不可逆的酮胺，然后緩慢重構(gòu)形成HbA1c。糖化血紅蛋白HbA1c的特點(diǎn):1. 1糖化血紅蛋白HbA1c的百分比含量與即時(shí)所檢測(cè)到的血糖水平無關(guān)。1. 2由于紅細(xì)胞在外周血中的壽命是90 120天，所以糖化血紅蛋白 HbA1c百分比反映了測(cè)定前2 3個(gè)月的血糖平均水平。而GHbA1c的合成始終在

4、進(jìn)行，其糖化程度與血液中的葡萄糖濃度及持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)；病人用藥治療后，較血糖、尿糖含量下降晚3-4周，糖化血紅蛋白HbA1c的百分比含量是對(duì)糖尿病長(zhǎng)期控制有重要意義的一項(xiàng)指標(biāo)。2、測(cè)定糖化血紅蛋白 HbA1c的方法測(cè)定糖化血紅蛋白 HbA1c的方法有（1）離子交換高壓液相色譜法HPLC包括：離子交換色譜及親和色譜；（2）微柱法；（3）免疫分析法，包括：放射免疫法、酶免疫法和乳膠 免疫凝集法。（3）電泳法（4）電噴離子質(zhì)譜等。、離子交換色譜分析法的原理：用高效微粒離子交換劑作固定相，以具有一定pH值的緩沖溶液作流動(dòng)相，依據(jù)離子型化合物中各離子組分與離子交換劑上表面帶電荷基團(tuán)進(jìn)行可逆性 離子交換

5、能力的差別而實(shí)現(xiàn)分離。離子交換劑可以分成兩種：陽離子交換劑和陰離子交換劑。親和色譜法是利用生物高分子能與相應(yīng)的專一配基分子可逆結(jié)合的原理將配基通過共價(jià) 鍵牢固地結(jié)合于固相載體上制得親和吸附系統(tǒng)。帶有雜質(zhì)的高分子分離目的物在一定條件 下，能以某種次級(jí)鍵與已固相化的配基結(jié)合，而雜質(zhì)則不吸附，除去雜質(zhì)后變換條件，又可以使待分離的高分子物質(zhì)重新解離，獲得純化?；茄t蛋白被一種牢固的但可逆的五環(huán)絡(luò)合物所結(jié)合，通過它們的順-乙二醇基被硼酸固定住。首先洗脫的是非糖化血紅蛋白，隨后用含有山梨醇的緩沖液將糖化組分洗脫下來，此緩沖液與結(jié)合在柱上的糖化血紅蛋白競(jìng)爭(zhēng)硼酸結(jié)合位點(diǎn)。、免疫分析法使用單克隆或多克隆抗體直

6、接測(cè)定血紅蛋白3鏈上糖基化的N末端的4-8個(gè)氨基酸，因此對(duì) HbA1c上的糖基特異性好。但是許多同源的糖化血紅蛋白變體也有相同的N末端結(jié)構(gòu)，從而對(duì)結(jié)果造成干擾。、電泳法的分析原理是：非糖化血紅蛋白游離的氨基末端能與硫酸根反應(yīng)，改變分子的電泳遷移率。而化糖血紅蛋白不能與硫酸根反應(yīng)，電泳遷移率不變。血紅蛋白容易受到瓊脂板介質(zhì)中磺酸鹽基團(tuán)或以醋酸纖維膜作支持物的緩沖液中的硫酸右旋糖的硫酸鹽基團(tuán)作用，經(jīng)過電泳分離，可以將糖化血紅蛋白從血紅蛋白中分離出來。、電噴離子質(zhì)譜 (electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS) 法研究證明，ESI-MS法測(cè)出

7、的是真正的 HbA1c,而目前臨床上使用的各種方法測(cè)出的實(shí)際上 是一系列混合物，包括糖化的a鏈、a鏈和b鏈雙糖化及b鏈其他部位被糖化的產(chǎn)物。因此,用ESI-MS法測(cè)出的數(shù)值要低于目前臨床習(xí)用的各種方法。由于ESI-MS法對(duì)儀器設(shè)備的要求較高，目前尚難廣泛用于臨床。3、臨床常用的測(cè)定糖化血紅蛋白HbA1c的方法、乳膠凝集反應(yīng)法乳膠凝集反應(yīng)法是利用抗原抗體直接測(cè)定總血紅蛋白Hb中的糖化血紅蛋白 HbA1c的百分含量。目前有國(guó)內(nèi)外幾家廠商可以提供HbA1c測(cè)定的試劑盒。這種免疫反應(yīng)是由被測(cè)血樣品中的總Hb和HbA1c與試劑中的抗體結(jié)合而形成凝集，凝集量隨HbA1c濃度的大小而變化。使用生化分析儀器來

8、進(jìn)行比濁測(cè)定HbA1c的濃度，采用終點(diǎn)法，生化儀通過測(cè)定反應(yīng)液的吸光度值，可直接反映出凝集量的多少；推算出 HbA1c占Hb的百分含量，測(cè)定時(shí)，儀器多 采用660nm單色光做主波長(zhǎng)，800nm單色光做副波長(zhǎng)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得出實(shí)測(cè)值。由于這 種試驗(yàn)其標(biāo)準(zhǔn)曲線是非線性的，所以在測(cè)定前，首先用隨試劑盒一起帶有的5種不同濃度的定標(biāo)液，做出5點(diǎn)非線性標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線和數(shù)值存在生化儀的貯存器中，測(cè)定樣品時(shí)，實(shí)測(cè)出的吸光度值 A與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，由儀器 CPU求出實(shí)測(cè)樣品中的 HbA1c百分含量。乳膠凝 集反應(yīng)法測(cè)定HbA1c簡(jiǎn)便、不用增加儀器，可直接用自動(dòng)生化分析對(duì)樣品進(jìn)行快速測(cè)定。該方法也可以用手工的方法，

9、在酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，是目前使用較多的方法。但是許多同源的 糖化血紅蛋白變體也有相同的N末端結(jié)構(gòu)，所以乳膠凝集反應(yīng)法其準(zhǔn)確性和重復(fù)性均有欠缺。、離子交換高壓液相色譜法HPLC使用離子交換高壓液相色譜HPLC (high pressure liquid chromatography )來測(cè)定 HbA1c的百分含量目前被認(rèn)為是分析 HbA1c的金標(biāo)準(zhǔn)。采用HPLC方法工作的全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀器，以其快速、簡(jiǎn)便、精巧、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，受到越來越多用戶的歡迎。3.2.1、高壓液相色譜分析的基本原理及發(fā)展史色譜分析是一類利用混合物的各組分在不同相上的分配差別，在兩相物質(zhì)相對(duì)運(yùn)動(dòng)過程中， 將混合物中的各種成

10、份分離開的一種分析技術(shù)。液相色譜是以液體或固體為固定相，以液體為液動(dòng)相的色譜法的總稱。色譜法又叫色層或?qū)游?，這一技術(shù)在生命科學(xué)研究中用于生物活 性物質(zhì)的分析；生物活性物質(zhì)是以混合物形式存在，人類血液中的蛋白質(zhì)有上千種，只有把混在一起的被測(cè)蛋白分離出來，才能準(zhǔn)確測(cè)定；在HbA1c的測(cè)定時(shí)，可以通過高精度 HPLG將HbA1c從Hb中分離出來，才能得到準(zhǔn)確的數(shù)值。在生命科學(xué)研究中，活性物質(zhì)的分離主 要應(yīng)用的是液相柱色譜。這種技術(shù)誕生于20世紀(jì)初葉，俄國(guó)化學(xué)家茨維特把植物色素混合液置于裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管頂端，用石油醒洗脫后，在玻璃柱上出現(xiàn)了幾組顏色不同的色帶，這些色帶隨著不斷的洗脫，越分越開，

11、先后從玻璃柱下端流出，茨維特把這樣一種用流體洗脫色素混合液，使之通過碳酸鈣做固定相從而實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)，起名叫色譜法”。這種方法被推廣用于分離許多混合物中的各種物質(zhì)，被分離物質(zhì)已和顏色無關(guān)了，但 色譜”分析的名稱仍沿用至今。當(dāng)然更貼切的名稱應(yīng)該叫層析法”。早期的 色譜柱”體積大，做固定相的物質(zhì)顆粒大， 分離時(shí)需要大量的洗脫液。并且洗脫液靠重力流動(dòng)，分離時(shí)間長(zhǎng)， 效率 低。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，20世紀(jì)60年代，人們研制出新型液相柱，同時(shí)采用高壓輸液泵自柱上端為洗脫液加壓，大大加速了洗脫液的流速，開發(fā)出相應(yīng)的高靈敏度的檢測(cè)器，新的分析儀器一高壓液相色譜儀在 70年代誕生，很快就占領(lǐng)了分析化學(xué)的舞臺(tái)。

12、特別是在生命 科學(xué)的研究中，HPLC技術(shù)由于對(duì)被測(cè)物活性影響小，幾乎可以測(cè)定生物醫(yī)學(xué)中所有的非發(fā) 揮性物質(zhì)，如近年來利用離子交換 HPLC法測(cè)定血液中的 HbA1c的百分含量，被認(rèn)為是糖尿 病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。、離子交換HPLC法測(cè)定HbA1c離子交換HPLC法，是利用能交換離子的材料為固定相來分離離子型化合物的方法。HbA1c的百分比測(cè)定使用陽離子交換柱；當(dāng)一定量的全血樣品被取樣針吸入到進(jìn)樣裝置內(nèi)，在稀釋部分被溶血，釋放出紅細(xì)胞中的血紅蛋白 Hb,并由稀釋液稀釋，稀釋好的已經(jīng)溶血的樣品， 由高壓泵注入離子交換柱。柱內(nèi)的固定相是最新開發(fā)的非多孔性，不溶和可滲透的交聯(lián)高聚物，上面分布固定的帶電荷基團(tuán)

13、和能游動(dòng)的配衡離子；樣品通過過濾器從交換柱頂端加入后，由三種不同濃度的鹽洗脫緩沖液（流動(dòng)相）洗脫，使樣品向下移動(dòng)。此時(shí)溶液中所含血紅蛋白（Hb）的各種組份即與固定相上能移動(dòng)的離子進(jìn)行交換，樣品中的血紅蛋白多種組份在 固定相上連續(xù)進(jìn)行可逆的交換吸著和解吸作用，而3種不同離子濃度的鹽液，形成線性梯度洗脫，洗脫液No1叫起始緩沖液，含低離子濃度的鹽，洗脫液No2、No3緩沖液，其離子濃度依次增高很多，這種流動(dòng)相離子濃度的改變對(duì)分離效果的影響非常明顯，前面洗脫出來的組分分離效果好， 色譜峰很窄，后面組分也能在很短時(shí)間內(nèi)洗脫出來，大大縮短了分離時(shí)間；所以全自動(dòng)血紅蛋白分析儀，在1分多鐘內(nèi)、Hb中的多種成

14、份被分離成 6個(gè)部分，其中的HbA1c、HbF、HbA1被有效、精確的分離；由交換柱流出的Hb成分到達(dá)儀器的檢測(cè)器， 檢測(cè)器內(nèi)裝有發(fā)射單色光的發(fā)光二極管，通過雙波長(zhǎng)可見光比色法測(cè)定HbA1c、HbF、HbA1三個(gè)參數(shù)。儀器的檢測(cè)器檢測(cè)出分離后HbA1c、HbF、HbA1組分的吸光度值，與 HbA1c標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值比較，分析計(jì)算出結(jié)果，最后以百分率表示的Hb組分結(jié)果與色譜圖一起打印出來。離子交換柱HPLC法對(duì)全血直接測(cè)定 HbA1c,其批內(nèi)和批間變異系數(shù) CV均可以小于1%(CV10 8- 10 8 7- 8 9%時(shí)，說明患者存在著持續(xù)性高血糖，可以出現(xiàn)糖尿病腎病、動(dòng)脈硬化、白內(nèi)障等并發(fā)癥。臨床

15、經(jīng)常以糖化血紅蛋白作為監(jiān)測(cè)指標(biāo)來了解患者近階段的血糖情況，以及估價(jià)糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展情況。、對(duì)預(yù)防糖尿病孕婦的巨大胎兒、畸形胎、死胎，以及急、慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的監(jiān)督具有 重要意義。、對(duì)于病因尚未明確的昏迷或正在輸注葡萄糖（測(cè)血糖當(dāng)然增高）搶救者，急查糖化血紅蛋白具有鑒別診斷的價(jià)值；如果HbA1c%升高，則是尿糖性昏迷。、對(duì)于糖化血紅蛋白特別增高的糖尿病患者，應(yīng)警惕如酮癥酸中毒等急性合并癥的發(fā)生。參考文獻(xiàn)：1、Krishnamuriti U,Stekfes MW,Glycohemoglbin:a primary predictor of the development or reve

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