化妝品生產(chǎn)用水標準[化妝品檢驗標準]

1、化妝品生產(chǎn)用水標準 化妝品檢驗標準 七分妝公司成品檢驗QA程序一、檢驗程序1 檢查重量使用電子稱稱凈重（必須先除皮） 2 檢查外觀產(chǎn)品外觀實施瓶瓶全檢， 查看包裝外表是否有臟點、 污點、 缺陷 3化妝品標簽標簽是否貼錯/ 反/ 漏，標簽是否有色差4 抽樣抽樣數(shù)量為5?，抽樣檢查為微生物查驗5 留樣檢驗合格后每批產(chǎn)品留樣數(shù)量應足夠兩次檢驗，并且在有效期內(nèi)不得轉(zhuǎn)移。二、微檢基本點1 范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品微生物學檢驗總則。本規(guī)范適用于化妝品樣品的采集、保存、供檢樣品制備。2 儀器和設(shè)備2.1 天平。 2.2 高壓滅菌器。 2.3 振蕩器。 2.4三角瓶。 2.5 玻璃珠。 2.6 玻璃棒。 2.7

2、 刻度吸管。 2.8 研缽。2.9 均質(zhì)器。 2.10 恒溫水浴箱。2.11 采樣用具：不銹鋼勺，剪刀，開罐器等。3 培養(yǎng)基和試劑 3.1 生理鹽水 成分：氯化鈉 蒸餾水加至8.5g 1000 mL溶解后，分裝到加玻璃珠的三角瓶內(nèi)，每瓶90mL， 103.43kPa(15lb)20min 高壓滅菌。3.2 SCDLP 液體培養(yǎng)基成分： 酪蛋白胨 大豆蛋白胨氯化鈉 磷酸氫二鉀 葡萄糖 卵磷脂 吐溫 80 蒸餾水17g 3g 5g 2.5g 2.5g 1g 7g 1000mL制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其它成分混合，加熱溶解，調(diào)pH為7.27.3,分裝，103.43kPa(15l

3、b)20min 高壓滅菌。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80 充分混合，冷卻至25左右使用。注：如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。 3.3 滅菌液體石蠟。 3.4 滅菌吐溫80。4 樣品的采集及注意事項4.1 所采集的樣品， 應具有代表性， 一般視每批化妝品數(shù)量大小，隨機抽取相應數(shù)量的包裝。 檢驗時， 應分別從兩個包裝單位以上的樣品中共取 10g 或 10mL。 包裝量小于20g 的樣品， 采樣量應適量增加，其總量應大于 16g。4.2 供檢驗樣品，應嚴格保持原有的包裝狀態(tài)，進口產(chǎn)品應為市售包裝。容器不應有破裂，在檢驗前不得打開，防止樣品被污染。4.3 接到樣品后，應立即登記，編寫檢驗序

4、號，并按檢驗要求盡快檢驗。如不能及時檢驗， 樣品應放在室溫陰涼干燥處，不要冷藏或 冷凍。4.4 若只有一份樣品而同時需做多種分析，如微生物、毒理、化學等，應先做微生物檢驗，再將剩余樣品做其它分析。4.5 在檢驗過程中，從打開包裝到全部檢驗操作結(jié)束，均須防止微生物的再污染和擴散，所用采樣用具、器皿及材料均應事先滅菌，全部操作應在無菌室內(nèi)進行， 或在相應條件下， 按無菌操作規(guī)定進行。5 供檢樣品的制備5.1 液體樣品5.1.1水溶性的液體樣品，量取10mLffl到90mLM菌生理鹽水中，混勻后，制成1:10檢液。5.1.2 油性液體樣品，取樣品10mL先加5mL滅菌液體石蠟混勻，再加10mL滅菌的

5、吐溫80,在40c44c 水浴中振蕩混合10min,加入滅菌的生理鹽水75mL在40c44c水 浴中預溫），在40c44c水浴中乳化，制成1:10的懸液。5.2膏、 霜、乳劑半固體狀樣品5.2.1 親水性的樣品，稱取10g,加到裝有玻璃珠及90mL滅菌生 理鹽水的三角瓶中，充分振蕩混勻，靜置15min。取其上清液作為1:10 的檢液。5.2.2 疏水性樣品，稱取10g,放到滅菌的研缽中，力口 10mL滅菌液體石蠟，研磨成粘稠狀，再加入10mL滅菌吐溫80,研磨待溶解后， 加70mL滅菌生理鹽水，在40c44c水浴中充分混合，制成1:10 檢液。5.3固體樣品，稱取10g,加到90mL滅菌生理鹽

6、水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為 1:10 的檢液。如有均質(zhì)器， 上述水溶性膏、 霜、 粉劑等， 可稱 10g 樣品加入 90mL滅菌生理鹽水，均質(zhì)1min2min;疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱10g樣品，加10mL滅菌液體石蠟，10mL滅菌吐溫80, 70mL滅菌生理鹽水，均質(zhì) 3min5min。三、菌落總數(shù)Aerobic Bacterial Count1 范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中菌落總數(shù)的檢驗方法。 本規(guī)范適用于化妝2 定義本規(guī)范采用下列定義菌落總數(shù) (aerobic bacterial count) 是指化妝品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫

7、度、培養(yǎng)時間、 pH值、 需氧性質(zhì)等)，1g(1mL)檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果只包括一群 本方法規(guī)定的條件下生長的嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。測定菌落總數(shù)便于判明樣品被細菌污染的程度，是對樣品進行衛(wèi)生學總評價的綜合依據(jù)。3 儀器和設(shè)備3.1 三角瓶。 3.2 量筒。3.3 pH計或精密pH試紙。3.4高壓滅茵器。3.5試管。3.6 平皿： 直徑 9cm。3.7 刻度吸管：10mL、 2mL、 1mL。 3.8 酒精燈。 3.9 恒溫培養(yǎng)箱。 3.10 放大鏡。4 培養(yǎng)基和試劑4.1 生理鹽水：見總則中 3.1 。 4.2 卵磷脂、吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 4.2.1 成分： 蛋白胨 牛肉膏 氯

8、化鈉 瓊脂 卵磷脂 吐溫 80蒸餾水20g 3g 5g 15g 1g 7g 1000mL4.2.2 制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解，加入吐溫 80，將其他成分( 除瓊脂外 ) 加到其余的蒸餾水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐溫80,混勻，調(diào)pH值為7.17.4,加入瓊脂，103.43kPa(15 lb)20min 高壓滅菌，儲存于冷暗處備用。 4.3 0.5%氯化三苯四氮唑(2,3,5-triphenyl terazolium chloride,TTC) 成分：TTC 0.5g蒸餾水 100mL溶解后過濾， 103.43kPa(15 lb)20min 高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶，置4

9、 冰箱備用。5 操作步驟5.1 用滅菌吸管吸取1:10稀釋的檢液2mL分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL另取1mL注入到9mL滅菌生理鹽水試管中(注意勿使吸管接觸液面) ， 更換一支吸管， 并充分混勻， 制成 1:100 檢液。吸取2mL， 分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)， 每皿 1mL。 如樣品含菌量高，還可再稀釋成1:1000 ， 1:10000 ， ?等，每種稀釋度應換1 支吸管。5.2 將融化并冷至45c50c的卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi)，每皿約15mL隨即轉(zhuǎn)動平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置37培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)h 。另取一個不加樣品的滅菌空平皿，加入

10、約15mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置 37c培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h,為空白 對照。5.3 為便于區(qū)別化妝品中的顆粒與菌落，可在每100mL卵磷脂吐溫80營養(yǎng)瓊脂中加入1mL0.5%TTC溶液，如有細菌存在，培養(yǎng)后 菌落呈紅色，而化妝品的顆粒顏色無變化。6 菌落計數(shù)方法先用肉眼觀察，點數(shù)菌落數(shù)，然后再用放大510倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一稀釋度各平皿生長的平均菌落數(shù)。若平皿中有連成片狀的菌落或花點樣菌落蔓延生長時，該平皿不宜計數(shù)。 若片狀菌落不到平皿中的一半， 而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，則可將此半個平皿菌落計數(shù)后乘以2，以代表全皿菌落

11、數(shù)。7 菌落計數(shù)及報告方法7.1 首先選取平均菌落數(shù)在30300個之間的平皿，作為菌落總數(shù)測定的范圍。 當只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時， 即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)（見表 1 中例 1） 。 7.2 若有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30300個之間，則應求出兩菌落總數(shù)之比值來決定，若其比值小于或等于2，應報告其平均數(shù)，若大于2 則報告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)（見表 1 中例 2 及例 3） 。7.3 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300個，則應按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（ 見表 1 中例 4） 。7.4 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30個， 則應按稀釋度最低的

12、平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（ 見表 1 例 5） 。7.5 若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300個之間，其中一個稀釋度大于 300 個，而相鄰的另一稀釋度小于 30 個時，則以接近30 或 300 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之（ 見表 1 中例 6） 。7.6 若所有的稀釋度均無菌生長，報告數(shù)為每g或每mL、于10CFU7.7 菌落計數(shù)的報告，菌落數(shù)在10 以內(nèi)時，按實有數(shù)值報告之，大于 100 時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應以 四舍五入法計算。為了縮短數(shù)字后面零的個數(shù)，可用 10 的指數(shù)來表示(見表 1 報告方式欄) 。在報告菌落數(shù)為“不可計”時，應注明樣品的稀釋

13、度。表 1 菌落計數(shù)結(jié)果及報告方式四、糞大腸菌群Fecal Coliforms1 范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中糞大腸菌群的檢驗方法。 本規(guī)范適用于化妝品中糞大腸菌群的檢驗。 2 定義本規(guī)范采用下列定義糞大腸菌群(Fecal coliforms) 系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌，在44.5C培養(yǎng)24h48h能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。該菌人和溫血動物糞便，是重要的衛(wèi)生指示菌。3 儀器3.1 恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱：44 0.5 。 3.2 溫度計。3.3 顯微鏡。 3.4 載玻片。 3.5 接種環(huán)。 3.6 電爐。 3.7 三角瓶。3.8 試管。 3.9 小倒管。3.10 pH 計或pH試紙。

14、3.11高壓滅茵器。3.12 刻度吸管：10mL、 2mL、 1mL。 3.13 平皿。4 培養(yǎng)基和試劑 4.1 雙倍乳糖膽鹽培養(yǎng)基成分： 蛋白胨 豬膽鹽 乳糖0.4% 溴甲酚紫水溶液蒸餾水40g 10g 10g 5mL 1000mL制法：將蛋白月東、膽鹽及乳糖溶解于蒸儲水中，調(diào) pH到7.4 ,加 入0.4%澳甲酚紫水溶液5mL混勻，分裝試管（每支試管中加一個小 倒管）。68.95kPa （10 lb）20min 滅菌。4.2 伊紅美蘭（EMB原脂成 分： 蛋白胨 乳糖 磷酸氫二鉀10g 10g 2g瓊脂2% 伊紅水溶液0.5%美藍水溶液蒸餾水20g 20mL 13mL 1000mL制法：先

15、將瓊脂加到900mL蒸儲水中，加熱溶解，然后加入磷酸氫二鉀、蛋白月東，混勻，使之溶解。再以蒸儲水補足至1000mL校正pH值為7.27.4 ,分裝于三角瓶內(nèi)，103.43kPa（15 lb）15min 高壓滅菌備用。臨用時加入乳糖并加熱融化瓊脂。冷至60左右無菌操作加入滅菌的伊紅美藍溶液，搖勻。傾注平皿備用。 4.3 蛋白胨水（作靛基質(zhì)試驗用 ） 成分： 蛋白胨 （或胰蛋白胨） 氯化鈉 蒸餾水高壓滅菌。 4.4 靛基質(zhì)試劑柯凡克試劑：將5g對二甲氨基苯甲醛溶解于75mUt醇中，然后緩慢加入濃鹽酸25mL。 試驗方法：接種細菌于蛋白胨水中，于 440.5C培養(yǎng)24h。沿管壁加柯凡克試劑0.30.

16、5mL,輕搖試管。陽 性者于試劑層顯深玫瑰紅色。注：蛋白胨應含有豐富的色氨酸，每批蛋白胨買來后，應先用已知菌種后方可使用。 4.5 革蘭氏染色液： 4.5.1 染液制備 4.5.1.1結(jié)晶紫染色液： 結(jié)晶紫95%乙醇1%草酸銨水溶液4.5.1.2 革蘭氏碘液： 碘 碘化鉀 蒸餾水加至300mL。4.5.1.3 脫色液：95%乙醇。4.5.1.4 復染液： a. 沙黃復染液：沙黃95%乙醇蒸餾水將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。b. 稀石碳酸復紅液：稱取堿性復紅10g,研細，加95濃醇100mL 放置過夜，濾紙過濾。取該液10mL加5陽碳酸水溶液90mL混合, 即為石碳酸復紅液。再取此液10

17、mdm水90mL即為稀石碳酸復紅液。20g 5g 1000mL制法：將上述成分加熱融化，調(diào)pH值為7.07.2 ,分裝小試管， 103.43kPa(15 lb)15min1g 20mL 80mL將結(jié)晶紫溶于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。1g 2g 300mL將碘與碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至0.25g 10mL 90mL4.5.2 染色法4.5.2.1 將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染 1min,水洗。4.5.2.2滴加革蘭氏碘液，作用1min,水洗。4.5.2.3 滴加95濃醇脫色，約30s,或?qū)⒁掖嫉螡M整個涂片，立 即傾去，再用乙醇滴滿整個

18、涂片，脫色 10s,水洗。4.5.2.4 滴加復染液，復染1min， 水洗，待干， 鏡檢。 4.5.3 染色結(jié)果革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。注： 如用 1:10 稀釋石碳酸復紅染色液作復染， 復染時間僅需10s5 操作步驟5.1 取10mL1:10稀釋的檢液，加到10mLM倍濃度的乳糖膽鹽培 養(yǎng)基中，置44c 0.5 C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h48h,如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣， 則為糞大腸菌群陰性。5.2 如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍瓊脂平板上，置37培養(yǎng)18 h24 ho同時取該培養(yǎng)液12滴接種到蛋白月東水中，置44c 士 0.5 培養(yǎng) 24h。經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上有無典型菌落生長。糞大腸

19、菌群在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，亦常為糞大腸菌群，應注意挑選。 5.3 挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。5.4 在蛋白月東水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5mL,觀察靛基質(zhì)反應。陽性者液面呈玫瑰紅色；陰性反應液面呈試劑本色。6 檢驗結(jié)果報告根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實為革蘭氏陰性短桿菌， 靛基質(zhì)試驗陽性， 則可報告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。五、綠膿桿菌Pseudomonas Aeruginosa1 范圍本規(guī)范規(guī)定了化妝品中綠膿桿菌的檢驗方法。

20、本規(guī)范適用于化妝品中綠膿桿菌的檢驗。 2 定義本規(guī)范采用下列定義。綠膿桿菌 (Pseudomonas aeruginosa) 屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42條件下能生長。該菌對人有致病力，可使傷處化膿，引起敗血癥等。 3 儀器1.1 恒溫培養(yǎng)箱： 37、 42。 3.2 三角瓶。 3.3 試管。 3.4 平皿。3.5 刻度吸管：10mL、 2mL、 1mL。 3.6 顯微鏡。 3.7 載玻片。 3.8接種針、接種環(huán)。 3.9 電爐。 3.10 高壓滅茵器。4 培養(yǎng)基和試劑 4.1 SCDLP 液體培養(yǎng)基見總則中 3.

21、2 。4.2 十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基成分： 牛肉膏 蛋白胨 氯化鈉十六烷基三甲基溴化銨瓊脂 蒸餾水lb)20min 滅菌后， 制成平板備用。 4.3 乙酰胺培養(yǎng)基成分： 乙酰胺 氯化鈉 無水磷酸氫二鉀10g 5g 1.39g 3g 10g 5g 0.3g 20g 1000mL制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調(diào)pH為7.47.6,加入瓊脂， 68.95kPa (10無水磷酸二氫鉀 硫酸鎂(MgSO4 7H2O)瓊脂 蒸儲水0.73g 0.5g 20g 1000mL酚紅 0.012g （ 1.2%溶液 1mL）制法：除瓊脂和酚紅外，將其它成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH為7.2，加入

22、瓊脂、酚紅，103.43kPa(15 lb)20min高壓滅菌后，制成平板備用。 4.4 綠膿菌素測定用培養(yǎng)基成分： 蛋白胨 氯化鎂硫酸鉀 瓊脂 甘油 (化學純) 蒸餾水20g 1.4g 10g 18g 10g 1000mL制法： 將蛋白胨、 氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中， 加溫使其溶解，調(diào)pH至7.4,加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內(nèi)，68.95kPa(10 lb)20min 高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩?4.5 明膠培養(yǎng)基成分： 牛肉膏 蛋白胨 明膠 蒸餾水3g 5g 120g 1000mL制法：取各成分加到蒸儲水中浸泡20min,隨時攪拌加溫使之溶解，調(diào)pH至7.4 ,分裝于試管內(nèi)，經(jīng)

23、68.95kPa(10 lb)20min滅菌后， 直立制成高層備用。 4.6 硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基成分： 蛋白胨 酵母浸膏 硝酸鉀 亞硝酸鈉 蒸餾水10g 3g 2g 0.5g 1000mL制法：將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中，加熱使之溶解，調(diào) pH為 7.2 ，煮沸過濾后補足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中， 68.95kPa(10 lb)20min 滅菌后備用。4.7 普通瓊脂斜面培養(yǎng)基成分： 蛋白胨 牛肉膏 氯化鈉 瓊脂蒸餾水10g 3g 5g15g 1000mL制法：除瓊脂外，將其余成分溶解于蒸儲水中，調(diào)pH為7.27.4 ,加入瓊脂，加熱溶解，分裝試管，

24、 103.43kPa(15 lb)20min 高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩? 操作步驟5.1 增菌培養(yǎng)：取1:10樣品稀釋液10mLffl到90mLSCDLp夜體培養(yǎng)基中，置37c培養(yǎng)18h24h。如有綠膿桿菌生長，培養(yǎng)液表面多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍綠色。 5.2 分離培養(yǎng)：從培養(yǎng)液的薄膜處挑取培養(yǎng)物， 劃線接種在十六烷基三甲基溴化銨瓊脂平板上，置37c培養(yǎng)18h24h。凡綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無定型，向周邊擴散或略有蔓延，表面濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴散有水溶性色素， 此培養(yǎng)基選擇性強， 大腸艾希氏菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長較差。在缺乏十六烷基三甲基溴化銨培

25、養(yǎng)基時也可用乙酰胺培養(yǎng)基進行分離，將菌液劃線接種于平板上，放37c培養(yǎng)24h,綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長良好， 菌落扁平， 邊緣不整， 菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色， 其它菌不生長。5.3 染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應進行氧化酶試驗。5.4 氧化酶試驗：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒挑取綠膿桿菌可疑菌落涂在濾紙片上， 然后在其上滴加一滴新配制的1%：甲基對苯二胺試液，在15s30s之內(nèi)，出現(xiàn)粉紅 色或紫紅色時，為氧化酶試驗陽性；若培養(yǎng)物不變色，為氧化酶試驗陰性。5.5綠膿菌素試驗：取可疑菌落23個，分別接種在綠膿菌 素測定培養(yǎng)基上，置37 c

26、培養(yǎng)24h,加入氯仿3mL-5mL充分振蕩 使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液內(nèi)， 待氯仿提取液呈藍色時， 用 吸管將氯仿移到另一試管中并加入1mol/L的鹽酸1mz右，振蕩后, 靜置片刻。 如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時為陽性， 表示被檢 物中有綠膿菌素存在。5.6 硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗：挑取可疑的綠膿桿菌純培養(yǎng)物，接種在硝酸鹽蛋白月東水培養(yǎng)基中，置 37c培養(yǎng)24h,觀察結(jié)果。凡在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體者， 即為陽性， 表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮氣。5.7 明膠液化試驗，取綠膿桿菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置37c培養(yǎng)24h,取出放冰箱1

27、0min30min,如仍呈溶解狀時即為明膠液化試驗陽性；如凝固不溶者為陰性。5.8 42 生長試驗：挑取可疑的綠膿桿菌純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，放在4142c培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h48h,綠膿 桿菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌則不能生長。6 檢驗結(jié)果報告被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，在分離平板上有典型或可疑菌落生長，經(jīng)證實為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即可報告被檢樣品中檢出綠膿桿菌； 如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42生長試驗三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。六、金黃色葡萄球菌Staphylocous Aureus1 范圍本規(guī)范規(guī)

28、定了化妝品中金黃金色葡萄球菌的檢驗方法。 本規(guī)范適用于化妝品中金黃色葡萄球菌的檢驗。 2 定義本規(guī)范采用下列定義金黃色葡萄球菌 (Staphylocous aureus) 為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀排列，無芽胞，無莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽性。該菌是葡萄球菌中對人類致病力最強的一種，能引起人體局部化膿性病灶，嚴重時可導致敗血癥。3.3 離心機。3 儀器和設(shè)備3.1 顯微鏡。 3.2 恒溫培養(yǎng)箱。3.4 刻度吸管：1mL、 5mL、 10mL。 3.5 試管。 3.6 載玻片。 3.7酒精燈。4 培養(yǎng)基和試劑 4.1 SCDLP 液體培養(yǎng)基見總則中 3.2 。 4.2Baird Parke

29、r 氏培養(yǎng)基 成分： 胰蛋白胨 牛肉膏 酵母浸膏 丙酮酸 鈉 甘氨酸氯化鋰(LiCl 6H2O)瓊脂蒸儲水增菌劑的配制：30%!黃鹽水50mL與除菌過濾的1%E硫酸鉀溶液 10mL混合，保存于冰箱內(nèi)。制法： 將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，校正pH。分裝每瓶95mL 103.43kPa高壓滅菌15min。臨用時加熱溶化瓊脂培 養(yǎng)基，每95mLi口入預熱至50c的卵黃亞硫酸鉀增菌10g 5g 1g 10g 12g 5g 20g 950mL pH 7.0 0.2劑5mL搖勻后制成平板。培養(yǎng)基應是致密不透明的。使用前在冰箱貯存不得超過48h。 4.3 血瓊脂培養(yǎng)基成分： 營養(yǎng)瓊脂 100mL

30、 脫纖維羊血(或兔血 ) 10mL制法：將營養(yǎng)瓊脂加熱融化，待冷至50 左右無菌操作加入脫纖 維羊血，搖勻，制成平板，置冰箱內(nèi)備用。 4.4 甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基成分： 蛋白胨 10g 氯化鈉 5g 甘露醇 10g 牛肉膏 5g 0.2%麝香草酚藍溶液12mL 蒸餾水 1000mL制法： 將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH7.4,加入甘露醇和指示劑，混勻后分裝試管中，68.95kPa(10 lb)20min滅菌備用。4.5 兔(人)血漿制備取 3.8% 酸鈉溶液， 103.43kPa(15 lb) 30min 高壓滅菌， 1 份加兔(人)全血4份，混勻靜置；2000rpm300

31、0 rpm離心3min5min。血球下沉，取上面血漿。 4.6 無菌液體石蠟。5 操作步驟5.1 增菌：取1:10稀釋的樣品10mL接種到90mL SCDLP夜體培養(yǎng)基中，置37培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h。5.2 分離：自上述增菌培養(yǎng)液中，取12接種環(huán)，劃線接種在Baird Parker 平板，如無此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板，置37 c培養(yǎng)24h48h。在血瓊脂平板上菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird Parker 平板上為圓形，光滑，凸起，濕潤，直徑為2mnr3mm顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油

32、樹膠的軟度。 偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落， 但無混濁帶及透明帶。挑取單個菌落分純在血瓊脂平板上，置37培養(yǎng)24h。5.3 染色鏡檢：挑取分純菌落，涂片，進行革蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，排列成葡萄狀，無芽胞，無夾膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為0.5 m- 1mi 5.4甘露醇發(fā)酵試驗： 取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中， 在培養(yǎng)基液面上加入2mnr3mm的滅菌液體石蠟，置37c培養(yǎng)24h,金黃色葡萄球菌應能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸。 5.5 血漿凝固酶試驗：吸取1:4 新鮮血漿0.5mL,放入滅菌小試管中，加入待檢菌24h肉湯培養(yǎng)物0.5mL?；靹?，放37恒溫箱或恒溫水浴中，每半小時觀察一次，6h 之內(nèi)如呈現(xiàn)凝塊即為陽性。 同時以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物及肉湯培養(yǎng)基各0.5mL,分別加入滅菌1:4血漿0.5mL,混勻，作 為對照。6 檢驗結(jié)果報告經(jīng)增菌培養(yǎng)后，在分離平板上