AD自噬改動(dòng)標(biāo)紅

1、二苯乙烯苷通過抑制的 Beclin-1、LC3-H表達(dá)改善APP695V717I轉(zhuǎn)基因鼠的行為學(xué)障礙羅紅波,石向群, 郭建魁,張志強(qiáng) , 汪泳,李蕓,尹榕（蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 , 甘肅省 蘭州市 730050）【摘要】目的 探討在APP695V717I轉(zhuǎn)基因鼠模型中，二苯乙烯苷（TSG）對(duì)大鼠行為學(xué)的保護(hù)作用及其對(duì)自噬分子 Beclin-1、LC3- U的表達(dá)影響。方法 選取10月齡APP695V717I 轉(zhuǎn)基因小鼠40只，隨機(jī)數(shù)字表法分為藥物組組、模型組，各20只,藥物組給予TSG灌胃1 個(gè)月,同背景同月齡C57BL/6J小鼠為正常對(duì)照組。行為學(xué)檢測(cè)應(yīng)用 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和丫

2、電迷宮實(shí)驗(yàn)。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及免疫印跡法檢測(cè)海馬神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白 Beclin-1 和 LC3- U的mRNA及蛋白表達(dá)變化。結(jié)果 在模型組中，大鼠丫電迷宮躲避所需的電刺激次 數(shù)增加， Morris 水迷宮測(cè)試中潛伏期延長 , 游泳路程增加及穿越平臺(tái)次數(shù)減少； Beclin-1 和 LC3- U的mRNA及蛋白的表達(dá)增高，與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P<0.05）; TSG藥物干預(yù) 后，大鼠躲避所需的電刺激次數(shù)減少，潛伏期縮短 , 游泳路程縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加； Beclin-1和LC3- U的mRNA及蛋白的表達(dá)較模型組下降（P<0.05）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 二苯乙烯

3、苷可通過下調(diào)自嗜通路中Beclin-1和LC3- U的表達(dá)，以抵抗 A B的神經(jīng)毒性作用對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的損害，從而改善大鼠的學(xué)習(xí)記憶、空間定向等行為學(xué)表現(xiàn)?！娟P(guān)鍵詞】 A PP轉(zhuǎn)基因小鼠；自噬；二苯乙烯苷；行為學(xué)阿爾茨海默病（Alzheimer' s disease AD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要的病理學(xué)特 征之一是腦組織中出現(xiàn)大量老年斑 。老年斑主要由B -淀粉樣蛋白（B -amyloid，A B ）形成, A B是通過淀粉樣樣前體蛋白（APP）的異常剪切、折疊后所形成，在細(xì)胞內(nèi)，對(duì)這種異常 折疊的蛋白質(zhì)，細(xì)胞可通過泛素蛋白酶體途徑（ubiquitin-proteasome pa

4、thway, UPP）和自噬溶酶體途徑來調(diào)控蛋白、細(xì)胞器的降解，從而保證蛋白質(zhì)的正常工作，維持細(xì)胞功能的正常運(yùn) 行。有學(xué)者早期研究發(fā)現(xiàn) AD 患者在病理上表現(xiàn)為大量囊泡的堆積， 但這種表現(xiàn)的機(jī)制及其 在 AD 發(fā)病機(jī)制中的作用卻沒有得到明確的闡述； 2006年，有學(xué)者建立自噬途徑的重要蛋 白 Apg5/Apg7 基因敲除的大鼠模型，發(fā)現(xiàn)該模型表現(xiàn)出神經(jīng)變性疾病的一些表型，使得自 噬途徑在神經(jīng)變性疾病得到了關(guān)注和重視 2-3。本實(shí)驗(yàn)采用 APP695V717I 轉(zhuǎn)基因 AD 動(dòng)物 模型觀察大鼠海馬神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3- U的表達(dá)情況并探討其意義。AD患者的學(xué)習(xí)記憶及工作能力

5、的逐漸喪失給家庭及社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)，但目前其治 療尚無十分有效方法與藥物 。研究顯示何首烏的主要有效成分之一（ 2， 3， 5， 4-四羥基二 苯乙烯-2-0- B -D葡萄糖苷（2，3，5，4-tetrahydroxy-stilbene-2-glycoside,二苯乙烯苷，TSG） 能減少B -淀粉樣肽誘導(dǎo)的老年斑沉積，改善癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，降低淀粉樣前體 蛋白（APP）的表達(dá)水平。我們通過觀察APP695V717I轉(zhuǎn)基因鼠的行為學(xué)表現(xiàn)及自噬相關(guān)蛋白 Beclin-1、LC3- U在海馬的表達(dá)情況并探討其意義，進(jìn)一步揭示AD新的發(fā)病機(jī)制，以及何首烏提取物二苯乙烯苷治療AD的主要作用

6、機(jī)制及藥物靶點(diǎn)。材料和方法一、材料1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及干預(yù) ：10 月齡 APP695V717I 轉(zhuǎn)基因小鼠 40 只，雌雄各半 （許可證號(hào) 01-3001），及20只年齡匹配的同背景 C57BL/6J小鼠，雌雄各半（作為正常對(duì)照），均購自中 國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)數(shù)字表法分為 TSG組、模型組，各20只。 藥物組給予 TSG 灌胃 1 個(gè)月，每天 1 次，灌胃量按 5 ml/kg 計(jì)算。正常對(duì)照組給予生理鹽 水灌胃。2. 主要試劑和藥物：Beclin-1和LC3- U抗購于Stressge公司；引物自行設(shè)計(jì)，由上海華大基 因有限公司合成；Trizol、Taq酶、逆轉(zhuǎn)錄酶

7、購自MBI公司。二苯乙烯苷為從何首烏中提取分 離的干粉，含量為68% (湖南中醫(yī)藥研究所提供)，實(shí)驗(yàn)時(shí)用水溶解為100 mg/kg的濃縮液。二、方法刪掉“大鼠模型的建立、取材及干預(yù)”1.行為學(xué)檢測(cè)：(1)Y電迷宮電擊實(shí)驗(yàn)：電擊次數(shù)表示其學(xué)習(xí)記憶的獲得能力，記錄每只大鼠 學(xué)會(huì)逃避電刺激次數(shù)，以30次為最大值計(jì)數(shù)。(2)Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)(PNT ):每天 08 :00-11:00之間對(duì)每只大鼠進(jìn)行訓(xùn)練,不選平臺(tái)所在象限作為入水點(diǎn),按順時(shí)針方向把大鼠 面向池壁放入水中，檢測(cè)大鼠隱匿平臺(tái)潛伏期。如果在規(guī)定的最長時(shí)間 120s內(nèi)未到達(dá)平臺(tái)， 則由實(shí)驗(yàn)者將其引至平臺(tái),逃避潛伏期記為120s,

8、大鼠在平臺(tái)休息20s后進(jìn)行下一次測(cè)試。觀 察并記錄動(dòng)物找到并爬上平臺(tái)的潛伏期、游泳路程及游泳軌跡。3d訓(xùn)練結(jié)束后將大鼠按組別進(jìn)行造模。于制模后21 d進(jìn)行PNT0( 3)Morris水迷宮空間探索試驗(yàn)(SPT):各組大鼠最 后一次PNT后撤除平臺(tái)，將大鼠從最后1次入水點(diǎn)面向池壁放入水中，使大鼠在水迷宮中連 續(xù)游泳，記錄大鼠120 s內(nèi)穿越原平臺(tái)平面的次數(shù)。2 超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)：分離海馬組織后，磷酸鹽緩沖夜(PBS)洗滌2次，4%戊二醛固定，冷 卻后切塊，2%鋨酸固定，梯度丙酮脫水，浸泡，包埋，醋酸雙氧鈾 -檸檬酸鉛雙重染色，透 射電鏡觀察。3. 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)mRNA表達(dá)：依

9、據(jù)Medline基因文庫自行設(shè)計(jì)引物，目 的基因 Beclin-1 (162 bp),上游弓I物：5' CCCTACAGGATGGATGTGGAGAAAG-3 '，下游弓I 物: 5' ATTGTGAGGACACCCAAGCAAGACC-3 ' 目的基因 LC3- II (136 bp),上游弓I物： 5' ACCAAGCCTTCTTCCTCC-3 ' 下游弓I物：5' TGTCCCGAATGTCTCCTG3-3 內(nèi)參照 B -actin( 100 bp)，上游引物：5'-CGTTGACATCCGTAAAGACCTCTA-3下游引

10、物：5'TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3 '。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，于紫外投射燈下觀察 結(jié)果并拍照。4免疫印跡法(Western blot)測(cè)蛋白表達(dá)：密度梯度離心法提取蛋白，將海馬組織轉(zhuǎn)移到勻 漿器中，加裂解液勻漿，離心10 min (2400 r/min,半徑13.5cm),取上清，繼續(xù)離心15 min(轉(zhuǎn)速 12000 r/min,半徑 13.5cm),取上清，再離心 30 min (15 000 r/min,半徑 13.5cm),加 入裂解液和蛋白酶抑制劑，用二奎琳甲酸(BCA)蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度；樣品與 等體積的上樣緩沖液混勻，煮沸變性

11、，用 10%十二烷基硫酸鈉聚-丙烯酰胺凝膠電泳(SDS- PAGE)分離，轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜，5 %脫脂奶粉封閉，與一抗孵育，加入辣根過氧化 物酶標(biāo)記二抗孵育，ECL試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，JS-300凝膠圖像儀掃描分析處理。三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)用SPSS12.0軟件處理。計(jì)量資料用x s表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組獨(dú)立樣 本比較用方差分析。結(jié)果刪掉“模型組大鼠腦組織切片染色結(jié)果”一、丫電迷宮檢測(cè)與對(duì)照組比較，模型組躲避電刺激數(shù)明顯增加(t =10.0884, P < 0.01),藥物組躲避電刺激數(shù)增加(t =2.7781, P < 0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與模型組比較，

12、經(jīng) TSG干預(yù)，藥 物組學(xué)會(huì)躲避所需的電刺激顯著減少(t =11.1755, P < 0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)o二、Morris水迷宮檢測(cè)與對(duì)照組相比，模型組和藥物組小鼠的 Morris水迷宮測(cè)試游泳潛伏期(t =14.4648, P < 0.01)及路程均增加(t =5.6550, P < 0.01),穿越平臺(tái)次數(shù)下降明顯(t =15.5895, P < 0.01), 差別隨時(shí)間的延長而加大；與模型組比較，藥物組的潛伏期縮短(t =5.5023, P < 0.01),游泳路程縮短(t =2.2341, P < 0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)增加(t

13、=4.8163, P < 0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1表1大鼠水迷宮行為學(xué)比較比較（xs）組別n潛伏期測(cè)試（秒）路程測(cè)試（米）穿越平臺(tái)測(cè)試（次）對(duì)照組2017.03 ± 1.233.96 ± 1.0518.13 ±4.15模型組2032.15 ± 4.51 a8.30 ± 3.02 a3.09 ± 1.18 a藥物組2025.26 ± 3.76 a b6.08 ± 3.26 a c4.82 ± 1.09 a c注：與對(duì)照組比較：a Pv 0.05;與模型組比較：cP V 0.05三、大鼠海

14、馬CA1區(qū)電鏡下自噬現(xiàn)象對(duì)照組：神經(jīng)細(xì)胞胞膜完整，胞漿基質(zhì)電子密度均勻，胞漿內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)清晰可見，細(xì)胞質(zhì) 內(nèi)線粒體及粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，結(jié)構(gòu)大致正常，線粒體嵴清楚、完整，核圓、核膜完整清晰， 高爾基體無改變。模型組：胞漿內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)欠清楚，嵴消失，少數(shù)呈空泡樣變，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)欠清晰，部 分?jǐn)U張，核膜較模糊不清，高爾基體大致正常，見圖 2;胞內(nèi)可見大量自嗜泡形成，見圖3 藥物組：胞漿內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)尚清楚，少數(shù)可見嵴消失，空泡樣變很少見，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)尚 清晰，少數(shù)見輕度擴(kuò)張，偶見個(gè)別胞漿水腫，核膜尚完整，高爾基體正常，見圖4。圖2電鏡X 6000倍圖3電鏡X 6000 倍圖4電鏡X 6000倍四、自

15、噬相關(guān)蛋白 Beclin-1、LC3- U的mRNA及蛋白表達(dá)如圖5/6/7所示，將RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳并采用蛋白質(zhì)印跡方法分析， 可見模型組的Beclin-1、LC3- n mRNA與其蛋白的表達(dá)趨勢(shì)一致，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義（P=0.00<0.05）; TSG組在Beclin-1、LC3- n蛋白表達(dá)明顯降低，與模型組比較有顯 著性差異（P=0.00<0.05）;假手術(shù)組與對(duì)照組比較無顯著性差異（P=0.2041>0.05）,排除手術(shù)因 素干擾。見圖&表2大鼠Beclin-1、LC3- n的mRNA及蛋白相對(duì)表達(dá)（X s,%）組別

16、例數(shù)mRNA的相對(duì)表達(dá)蛋白的相對(duì)表達(dá)（%）Becli n-1LC3- nBecli n-1LC3- n對(duì)照組200.25 ± 0.010.23 ± 0.030.20 ± 0.01 0.26± 0.02模型組20a0.58 ± 0.01a0.42 ± 0.01a0.63 ± 0.01a0.52 ± 0.01藥物組20,a b0.41 ± 0.02,ab0.34 ± 0.01,ab0.49 ± 0.02,a b0.36 ± 0.02ab注：與對(duì)照組比較：PV 0.05;與模型組比

17、較：Pv 0.05;ABCDABCD圖 5: Beclin-1/ B -actin 的 mRNA 表達(dá)圖6: LC3- n / B -actin 的 mRNA 表達(dá)A:對(duì)照組B:藥物組C:模型組A:對(duì)照組B:藥物組 C:模型組圖 7: Beclin-1、LC3- n / B -actin 的蛋白表達(dá)A:對(duì)照組B:藥物組C:模型組老年斑是阿爾茨海默病(Alzheimer ',AD)的主要組織病理變化，而B -淀粉樣肽(B -amyloid, A B)是老年斑的主要成分，因此，A B的神經(jīng)毒性是AD形成和發(fā)展的關(guān)鍵因素。A B由3943個(gè)氨基酸組成，來源于淀粉樣前體蛋白(Amyloid p

18、recursor protein,APP),如果 各種危險(xiǎn)因素導(dǎo)致APP的異常剪切，A B的空間構(gòu)象發(fā)生改變，就會(huì)導(dǎo)致 A B異常聚集而產(chǎn) 生神經(jīng)毒性作用4。正常情況下A B的空間二級(jí)結(jié)構(gòu)以a螺旋為主，聚集性較弱，可被蛋白 酶水解；如果A B構(gòu)象發(fā)生錯(cuò)誤折疊，轉(zhuǎn)變?yōu)锽折疊時(shí)，聚集性較弱，不易被蛋白酶水解， 進(jìn)而形成組織沉淀并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。因此，在分子水平上，AD勺疾病本質(zhì)是一種神經(jīng)變性構(gòu)象病，一種蛋白錯(cuò)誤折疊并聚集的“蛋白構(gòu)象病”。蛋白構(gòu)象病的相同點(diǎn)是異常蛋白在 細(xì)胞內(nèi)蓄積，而這些蛋白主要是依賴自噬途徑被降解，提示自噬障礙可能參與了神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病。自噬溶酶體途徑可能通過清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的

19、細(xì)胞毒性物質(zhì)、失活的細(xì)胞器，再 循環(huán)利用細(xì)胞中的氨基酸、核普酸等成分，減少對(duì)細(xì)胞的損害，從而有利于挽救瀕臨死亡的 細(xì)胞。LC3和Beclin-1是參與自噬體形成的特異性的重要基因5。LC3- n定位于前自噬體和自噬 體，使之成為自噬體的標(biāo)志分子。 一旦自噬體與溶酶體融合，自噬體內(nèi)的LC3- n即被溶酶體 中的水解酶降解。LC3- n含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少成正比，可通過檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3-n的含量變化，來判斷細(xì)胞狀態(tài)，判斷其自噬是被誘導(dǎo)還是被抑制。而Becli n-1還是參與自噬調(diào)控的重要基因，它可以通過提高細(xì)胞自噬來抑制腫瘤的生長，是候選的腫瘤抑制基因，其不僅與自噬調(diào)控通路有關(guān)，而且涉及細(xì)

20、胞凋亡的調(diào)控，可能同時(shí)參與兩種程序性細(xì)胞死亡 過程。因此，本研究用LC3- n和Beclin-1作為細(xì)胞發(fā)生自吞噬的標(biāo)志分子。在實(shí)驗(yàn)中，Western® RT-PCR的結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠的模型組海馬部位 LC3、Beclin-1 的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯增高，說明APP轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的A B啟動(dòng)自噬通路；推測(cè)A B在 形成纖維化的過程中產(chǎn)生的神經(jīng)毒性可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，細(xì)胞通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自穩(wěn)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)自噬來平衡應(yīng)激狀態(tài)。也有觀點(diǎn)認(rèn)為自噬溶酶體途徑是產(chǎn)生毒性 A B的一個(gè)重要過程。在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中， Yu等和LeBlanc等9發(fā)現(xiàn)在自噬體內(nèi)存在 A B,其前體B CTF

21、、APP及丫分泌酶。用 rapamycin或去血清等方法來增強(qiáng)自噬功能后，丫分泌酶能從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中轉(zhuǎn)移至自噬體中，而A B的產(chǎn)生也大大增加。Haass等10研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)A B對(duì)細(xì)胞的損傷遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于細(xì)胞外 A B 的作用。此外，通過自噬溶酶體途徑產(chǎn)生的 A B,可以通過溶酶體降解，也可以被分泌到細(xì) 胞外形成不可溶的異常聚集體。這些提示自噬溶酶體途徑障礙可能導(dǎo)致毒性A B的產(chǎn)生增多，導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷和細(xì)胞外老年斑的形成。在前期的實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn) A B誘發(fā)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及相關(guān)的凋亡通路參與A B神經(jīng)毒性對(duì)腦的神經(jīng)元損傷機(jī)理11。而目前的研究也發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí) PERK信號(hào)通路促使某些蛋白 質(zhì)如多聚谷氨酰胺

22、 polyQ72 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中大量堆積，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解系統(tǒng)；同時(shí)磷酸化 elF2a,上調(diào) Atg12(autophagy protein12形成 Atg5-Atg12-Atg16 復(fù)合物，引起 LC3 蛋白質(zhì)的 膜轉(zhuǎn)位誘發(fā)自噬12。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果并回顧文獻(xiàn)，我們認(rèn)為在 AD的發(fā)病中，當(dāng)A B被細(xì)胞 分泌至細(xì)胞外，形成纖維化的過程中，所表現(xiàn)的神經(jīng)毒性開始起作用，AB可破壞細(xì)胞膜誘發(fā)氧化應(yīng)激， 氧化應(yīng)激又會(huì)破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能， 引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在短時(shí)間內(nèi)通過啟動(dòng)未折疊 蛋白保護(hù)通路如 PERK 等來保護(hù)對(duì)大腦造成的損傷， 同時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激也使細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的蛋 白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中錯(cuò)誤折疊的幾率增加， 導(dǎo)致了錯(cuò)

23、誤蛋白的異常剪切和積聚， 這些異常剪切的蛋 白可啟動(dòng)細(xì)胞的 LC3、Beclin-1 自噬通路，但當(dāng)自噬無法降解過多的蛋白質(zhì)時(shí)，這部分細(xì)胞 可能因?yàn)檫@種過度的應(yīng)激導(dǎo)致通過特異性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Caspase12凋亡途徑發(fā)生死亡。因此可見，分泌至細(xì)胞外的A B可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生更多的異常剪切和積聚的蛋白，這些錯(cuò)誤折疊的蛋白即可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡， 也可以通過自噬途徑使細(xì)胞程序性死亡， 出現(xiàn) AD 的病理學(xué)改 變及進(jìn)行性加重的行為學(xué)障礙。對(duì)中藥何首烏的相關(guān)研究表明， 何首烏能改善 AD 模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力， 對(duì)膽堿能神 經(jīng)投射纖維有保護(hù)作用，可提高乙酰膽堿酯酶活性，可通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因 Bax /Bc

24、l-2 通 路抑制細(xì)胞凋亡 13-16。因此，對(duì)何首烏的主要有效成分二苯乙烯苷進(jìn)行研究，進(jìn)一步揭示其 治療 AD 的主要作用機(jī)理及藥物靶點(diǎn)。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，PNT主要考察大鼠的空間分辨學(xué)習(xí)能力，SPT主要測(cè)量大鼠的 工作記憶能力，通過本實(shí)驗(yàn)可以看出，在A B毒性作用下，轉(zhuǎn)基因鼠的學(xué)習(xí)記憶、空間定向、 工作記憶能力明顯下降 , 表現(xiàn)為 Y 電迷宮躲避所需的電刺激次數(shù)增加， Morris 水迷宮測(cè)試 中潛伏期延長，游泳路程增加及穿越平臺(tái)次數(shù)減少；從時(shí)間上來看，這種損害隨著A B暴露時(shí)間的延長而加重，說明AB對(duì)小鼠的學(xué)習(xí)記憶、空間記憶及工作記憶的損害呈逐漸增強(qiáng)的 累加效應(yīng)；經(jīng) TSG 干

25、預(yù)后，小鼠躲潛伏期縮短 , 游泳路程縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，說明 TSG 可改善模型小鼠學(xué)習(xí)記憶、空間定向、工作學(xué)習(xí)能力，具有腦保護(hù)作用。Western 和RT-PCR的結(jié)果顯示，藥物組經(jīng)TSG干預(yù)后，海馬部位LC3、Beclin-1的mRNA及蛋白表達(dá) 均降低。有研究提示TSG可以下調(diào)APP的表達(dá)，我們的前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)TSG可以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 程度，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子伴侶 GRP78的表達(dá)和Caspase12誘導(dǎo)的凋亡11。因此，中藥何 首烏提取物 TSG 可以明顯改善 AD 鼠的學(xué)習(xí)記憶、空間定向等行為學(xué)功能，其作用機(jī)制可 能通過抑制淀粉樣前體蛋白的表達(dá)， 減輕A B的神經(jīng)毒性對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的

26、損害， 緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 應(yīng)激程度，從而使自嗜通路中 Beclin-1、LC3- U的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞的自嗜和凋亡等減少，從 而起到改善 AD 鼠行為學(xué)障礙的腦保護(hù)作用。參考文獻(xiàn)1 Querfurth HW,LaFerla FM.Alzheimer's disease.N Engl J Med.2010; 362(4):329-344.2 Komatsu M,Waguri S,Chiba T,et al.Loss of autophagy in the central nervous system causes neurodegeneration in mice.Nature,2006,441

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