細菌對四環(huán)素類抗生素的耐藥機制研究

1、細菌對四環(huán)素類抗生素的耐藥機制：四環(huán)素類藥物為廣譜抗生素,發(fā)現(xiàn)于20世紀40年代,是通過阻止氨酰與核糖體結(jié)合位點()的結(jié)合來阻止菌體蛋白合成的一類抗生素,具有廣泛的抗菌活性。在臨床中以其有效的殺菌作用及較小的副作用而被廣泛用于治療人和動物的細菌性感染。此外,在包括美國在內(nèi)的一些國家,四環(huán)素還被大量用作生長促進劑投喂給動物。近年來,耐藥性的出現(xiàn)限制了它們的使用。在20世紀50年代中期以前,主要的共生菌和病原菌都對四環(huán)素敏感,例如,19171954年分離到的433株不同的腸桿菌僅2%對四環(huán)素耐藥。而等的研究表明,19881993年間60%的.分離株對四環(huán)素、鏈霉素和氯霉素耐藥。1.四環(huán)素類抗生素家

2、族20世紀40年代發(fā)現(xiàn)了四環(huán)素家族的首批成員金霉素(,氯四環(huán)素)和土霉素( ,氧四環(huán)素),隨后又相繼發(fā)現(xiàn)其他四環(huán)素類藥物,其中有些為天然分子,如四環(huán)素();有些為半化學合成產(chǎn)品,如美他環(huán)素(,甲烯土霉素)、多西環(huán)素()和美滿霉素(,米諾環(huán)素)等。隨著研究的不斷深入,水溶性好或口服吸收率高的新型半合成藥物如羅利環(huán)素()和賴甲環(huán)素()相繼問世;最新研制出的甘氨酰環(huán)素已完成期臨床試驗,目前正在進行期臨床試驗。而一些早期的藥物,如氯莫環(huán)素()、羅利環(huán)素、賴甲環(huán)素和金霉素在各國都已不再使用。2.四環(huán)素類抗生素的作用機理四環(huán)素類藥物具有抗菌活性的最重要特征是每種藥物的分子中都包括一個線性熔合的四環(huán)素核。結(jié)

3、構(gòu)最簡單的具有抗菌活性的四環(huán)素分子是6-脫氧-6-去甲基四環(huán)素,此結(jié)構(gòu)被認為是最小的藥效基團。四環(huán)素類抗生素通過阻止氨酰與細菌核糖體結(jié)合來抑制細菌蛋白質(zhì)合成,四環(huán)素分子必須通過一個或多個膜系統(tǒng)(革蘭氏陽性菌和陰性菌各自具有不同的膜系統(tǒng))才能與它們的靶位結(jié)合,從而達到有效的殺菌作用。因此,在探討四環(huán)素作用方式時需考慮到跨膜吸收和核糖體結(jié)合這兩種機制。四環(huán)素穿越革蘭氏陰性腸道菌外膜是以被動轉(zhuǎn)運陽離子(可能是2+)-四環(huán)素復(fù)合物的形式經(jīng)、孔蛋白通道,并在道南()電位作用下穿過外膜進入細胞在胞外質(zhì)中積累。在胞外質(zhì)中四環(huán)素分子被分解釋放,并通過擴散作用穿過內(nèi)膜(細胞質(zhì)膜)的脂質(zhì)雙層最終進入細胞內(nèi)。四環(huán)素

4、類藥物穿越革蘭氏陽性菌細胞質(zhì)膜的方式則是形成電中性親脂分子,是能量依賴性的,并由細胞內(nèi)外的+濃度差所驅(qū)動。在細胞質(zhì)中+和二價陽離子濃度都高于細胞外,所以細胞質(zhì)內(nèi)的四環(huán)素分子可能被螯合,形成2+-四環(huán)素復(fù)合物與核糖體結(jié)合。3.四環(huán)素類抗生素耐藥的分子機制1980年等第1次研究腸桿菌科和假單胞菌質(zhì)粒的四環(huán)素耐藥決定子的基因機制,到現(xiàn)在已經(jīng)明確了29個不同的基因和3個基因,其中18種基因和1種基因編碼外輸泵,7種基因和1種基因即()編碼核糖體保護蛋白,1種基因即()編碼一種修飾或鈍化四環(huán)素的酶,但()基因的功能在天然宿主中并不能起作用。3.1外輸泵蛋白()在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中都有外輸泵基因

5、,而且大部分外輸泵基因都具有四環(huán)素抗性。四環(huán)素外輸泵蛋白屬于主要異化超家族(),是目前蛋白中研究最清楚的。所有外輸泵基因都編碼膜相關(guān)蛋白可將四環(huán)素泵出胞外,降低了細胞內(nèi)藥物濃度保護了胞內(nèi)的核糖體,從而產(chǎn)生耐藥性。每個外輸泵基因都編碼約46膜結(jié)合外輸泵蛋白,這些蛋白依據(jù)氨基酸的同源性可分為6個群:第1群蛋白包括()、()、()、()、()、()、()、(),還可能有()、()和(30)3。該群蛋白具有12個跨膜-螺旋,其四環(huán)素抗性蛋白具有41%78%的氨基酸同源性,而它們的四環(huán)素阻抑蛋白具有37%88%的氨基酸同源性。該群蛋白的基因大部分只存在于革蘭氏陰性菌中,只有()存在于革蘭氏陽性菌中。許多

6、外輸泵蛋白存在于雙分子脂膜中,以親水氨基酸環(huán)凸出到周質(zhì)和細胞質(zhì)空間,外輸泵蛋白逆濃度梯度將四環(huán)素-陽離子復(fù)合物泵出胞外。革蘭氏陰性菌外輸泵基因分布廣泛,通常與大質(zhì)粒相連,且大多為結(jié)合性質(zhì)粒。這些外輸泵基因大都來源于不同的不相容質(zhì)粒群5,這些質(zhì)粒通常也攜帶其他抗性基因(如抗金屬基因)和病原因子基因(如毒素基因)。因此,介導(dǎo)任何一種抗性因子就是傳遞攜帶多重抗性的質(zhì)粒,這一交叉選擇的現(xiàn)象可能是細菌多重耐藥現(xiàn)象日趨嚴重的重要原因之一。第2群蛋白包括()和()。該群蛋白具有14個跨膜-螺旋,它們具有58%59%的氨基酸同源性。這些蛋白主要存在于革蘭氏陽性菌中。()和()基因主要存在于小的傳遞性質(zhì)粒中,它

7、們偶爾會整合入葡萄球菌染色體、枯草桿菌染色體或金黃色葡萄球菌的大質(zhì)粒中。葡萄球菌的大質(zhì)粒攜帶()相對不常見,而小質(zhì)粒攜帶()基因則較普遍。小質(zhì)粒代表了一族密切相關(guān)的質(zhì)粒,其大小為4.44.7。181質(zhì)粒是這一族的代表,已測出全序。181還可攜帶除()外的其他抗藥基因。少數(shù)質(zhì)粒攜帶的()已被測序,相互之間具有98%99%的同源性。較為特殊的是枯草桿菌染色體上的(),該基因與其他()基因序列僅有87%的同源性。第3群蛋白包括()和3,發(fā)現(xiàn)于鏈霉菌屬,這些蛋白與第2群蛋白的拓撲結(jié)構(gòu)相似,具14個跨膜-螺旋。第4群蛋白包括(),分離于梭菌屬,具有12個跨膜-螺旋。第5群蛋白包括從恥垢分支桿菌分離到的(

8、)。第6群蛋白包括從紋帶棒狀桿菌分離到的未命名的蛋白,其被認為是利用而不是質(zhì)子泵作為能源的。3.2核糖體保護蛋白()已知9種核糖體保護蛋白,這些存在于細胞質(zhì)中的蛋白具有保護核糖體免受四環(huán)素作用,使細菌具有抵抗多西環(huán)素和美滿霉素的能力,且耐藥譜比攜帶不含()外輸泵基因的細菌廣泛。有資料說明核糖體保護蛋白與核糖體結(jié)合可引起核糖體構(gòu)型的改變,使四環(huán)素不能與其結(jié)合,但并不改變或阻止蛋白的合成。水解可提供核糖體構(gòu)型變化所需的能量。核糖體保護蛋白與延伸因子-和-有同源性,它們與核糖體的結(jié)合是競爭性的。核糖體保護蛋白和-在核糖體上有重疊的結(jié)合位點,核糖體保護蛋白需從核糖體上游離下來使-與核糖體結(jié)合6,7。(

9、)和()蛋白是研究得最多的核糖體保護蛋白,它們具有核糖體依賴的水解酶活性。無論是()還是()蛋白,當有而不是存在時就會使四環(huán)素與核糖體的結(jié)合能力減弱3,8。盡管在這一群中只有兩個蛋白被廣泛研究,但其他核糖體保護蛋白()、()、()、()、()和()的氨基酸序列與()和()具有相似性,因此也可能具有水解酶活性,以同樣的方式與四環(huán)素和核糖體相互作用。核糖體保護蛋白可根據(jù)氨基酸的同源性分類。第一類包括()、()、()和新發(fā)現(xiàn)的()蛋白,第二類包括()和()蛋白,第三類包括()和()蛋白。3.3滅活或鈍化四環(huán)素的酶()()基因是唯一通過產(chǎn)生滅活四環(huán)素的酶而耐藥的。已報道兩株厭氧擬桿菌轉(zhuǎn)座子上攜帶有()

10、基因。()產(chǎn)生44胞漿蛋白,它在氧和存在時可化學修飾四環(huán)素,序列分析表明這個酶與其他需要的氧化還原酶有同源性。3.4其他(未知)耐藥機制(/)()蛋白有低水平的耐四環(huán)素能力。其基因編碼的11.8蛋白包括105個氨基酸,比外輸泵蛋白(45)和核糖體保護蛋白(72)小。鏈霉菌()基因序列尚未見報道,推測()基因并不編碼外輸泵和核糖體保護蛋白,但()是否與()類似編碼鈍化酶,或與()類似具有一種新的耐藥機制尚不明確。4四環(huán)素類抗生素耐藥基因的發(fā)生率4.1病原菌或條件致病菌( )病原菌或條件致病菌中的大部分基因與轉(zhuǎn)移質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、結(jié)合轉(zhuǎn)座子相連,這些轉(zhuǎn)移單位可使基因在種間傳遞或通過結(jié)合在更大范圍的屬間

11、傳遞10。最初在腸桿菌科和假單胞菌中發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陰性菌基因現(xiàn)也在奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬、密螺旋體和弧菌屬中相繼發(fā)現(xiàn)。()基因在革蘭氏陰性菌基因中具有最為廣泛的宿主,現(xiàn)已在20種革蘭氏陰性菌屬中被檢測到11。然而,()已在26個革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中檢測到。一些基因如()的宿主范圍可能較為有限,因為它們定位于不可轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒上,由此減少了向其他種屬轉(zhuǎn)移的機會。一些種屬中的基因僅表現(xiàn)較低的耐藥水平,不能保護存在于臨床和環(huán)境四環(huán)素濃度下的細菌。革蘭氏陽性菌也可獲得四環(huán)素抗性質(zhì)粒,特別是在多重耐藥中更為普遍。1994年的研究資料顯示,大約90%耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、70%無乳鏈球菌、70%多藥耐

12、藥糞腸球菌都具四環(huán)素抗性?！案锾m氏陰性菌基因”是指那些只在革蘭氏陰性菌中被發(fā)現(xiàn)的基因。這些基因的+含量(40%)高于來源于革蘭氏陽性菌的基因。所有革蘭氏陰性菌基因都編碼外輸泵蛋白,但如果轉(zhuǎn)入革蘭氏陽性菌宿主中則不能高效表達。很多革蘭氏陰性菌基因受阻抑子調(diào)控,與結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄方向相反。“革蘭氏陽性菌基因”通常是指發(fā)現(xiàn)于革蘭氏陽性菌中,具有相對較低的+含量(35%)的基因,但目前在越來越多的革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)具有該基因,尤以()基因最為突出,現(xiàn)已從臨床分離的8種革蘭氏陰性菌、18種革蘭氏陽性菌中被檢出。此外,實驗室中可將()基因轉(zhuǎn)入更多的菌屬中12。嚴格胞內(nèi)寄生的病原體如衣原體和立克次氏體還未獲得四

13、環(huán)素抗性,因為這些病原體存在于細胞內(nèi),只有細胞同時被兩種病原體感染才可能發(fā)生基因交換。但突變導(dǎo)致的耐藥性上升則更可能發(fā)生在這些胞內(nèi)寄生的病原體中13。4.2共生菌()共生菌與機會致病菌及病原菌具有相同的基因、質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和結(jié)合性轉(zhuǎn)座子,如肺炎鏈球菌和化膿鏈球菌及許多口腔草綠色鏈球菌都可獲得的()、()、()和()基因。此外,在長期藥物壓力選擇下,革蘭氏陽性菌具有從攜帶一個基因轉(zhuǎn)為攜帶多重基因的趨勢。在個別革蘭氏陽性菌中可找到不同種類的多重基因盒,如分枝桿菌和鏈球菌,但在革蘭氏陰性菌中特別是腸道菌中則不常見14?？傊?已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多致病性的革蘭氏陰性菌屬攜帶的四環(huán)素抗性基因與同屬的共生菌相同。革蘭

14、氏陰性菌如嗜血桿菌、奈瑟氏菌和擬桿菌,革蘭氏陽性菌屬如鏈球菌都攜帶與條件致病菌相同的基因。因此,共生菌具有作為病原菌基因或其他抗性基因儲藏庫的作用,并有助于說明細菌菌群保持和傳播抗生素抗性基因的機理。5基因的分布和轉(zhuǎn)移基因廣泛存在于從人、動物和環(huán)境中分離的細菌中,大多數(shù)基因都與結(jié)合或移動元素相連,這可以部分解釋為什么它們在細菌中能廣泛分布。革蘭氏陰性菌中外輸泵基因發(fā)現(xiàn)于轉(zhuǎn)座子,并可插入到不同的不相容質(zhì)粒中。革蘭氏陽性菌外輸泵基因與小質(zhì)粒相連,核糖體保護蛋白基因()和()可以存在于結(jié)合質(zhì)粒或染色體上,在染色體上它們不能自己移動。()和()基因主要與結(jié)合染色體元素相連,并編碼它們自己的轉(zhuǎn)移。這些結(jié)

15、合轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)移可將質(zhì)粒移動到其他菌屬中5。5.1革蘭氏陰性細菌目前39個革蘭氏陰性菌屬、23個革蘭氏陽性菌屬及相關(guān)菌屬的耐四環(huán)素機制已經(jīng)被闡明。其他尚未明確的基因可能存在,因為已檢測出不攜帶現(xiàn)有基因的四環(huán)素耐藥株。新的抗四環(huán)素基因不斷被發(fā)現(xiàn),新的菌屬也被檢出攜帶基因。()、()、()、()、()、()、()、()、()、()、(30)和(31)基因在革蘭氏陰性菌屬中廣泛存在,這些菌屬中大部分屬腸道菌群。()基因在革蘭氏陰性菌中最為廣泛,已在不同細菌中檢出,如放線共生放線桿菌、流感嗜血桿菌、莫拉桿菌和齒垢密螺旋體16。革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)的基因的數(shù)量是不同的,既有攜帶一種基因,如()、()或(),也

16、有發(fā)現(xiàn)于埃希氏菌屬中多達七條外輸泵基因。然而,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌質(zhì)粒攜帶不超過一種類型的基因。相反,鏈霉菌屬和革蘭氏陽性菌屬個別分離株常攜帶多個基因,編碼相同的抗生素抗性,包括四環(huán)素抗性。()、()和()基因在革蘭氏陰性菌中很少檢出?？茖W家們?nèi)栽谘芯磕承┚鷮僦粩y帶一種基因,而另一些菌屬則可攜帶一系列不同的基因的原因。對革蘭氏陰性菌質(zhì)粒不相容群的研究發(fā)現(xiàn),它們決定其細菌宿主的范圍,質(zhì)粒宿主的變化范圍非常嚴格,如嗜血桿菌攜帶的結(jié)合性大-質(zhì)粒,在本菌屬外其他宿主中就不能存在。這些質(zhì)粒宿主范圍可能影響到與它們相連的部分基因的傳播5。目前,8種革蘭氏陰性菌屬攜帶()基因,7種攜帶(),5種攜帶(),2種攜

17、帶(),2種攜帶(),各有1種攜帶()、()、()、()、(30)、(31)。根據(jù)它們較低+含量,()、()、()、()、()、()、()、()、()17,可能還有()被認為來源于革蘭氏陽性菌中。這證明了來源于革蘭氏陽性菌的抗生素抗性基因,特別是核糖體保護蛋白基因可以通過細菌污染在種、屬間進行交換,并可成功的整合和表達于一系列不同背景的宿主中的假說。5.2革蘭氏陽性細菌目前,已知17種革蘭氏陽性菌及霉形體屬、脲原體屬、放線菌屬、諾卡氏菌屬、分枝桿菌和鏈霉菌屬等都攜帶已知的耐四環(huán)素基因。但并不是所有耐四環(huán)素革蘭氏陽性菌都有確切的基因14。共計有18個屬攜帶()、11個屬攜帶()、10個屬攜帶()、7個屬攜帶()、5個屬攜帶()、2個屬攜帶()、1個屬攜帶()基因。近年來發(fā)現(xiàn)雙