與抗體的結(jié)合

1、Protein A 、Protein G 與抗體的結(jié)合1 Protein A Sepharose 、rProtein A Sepharose 親和層析介質(zhì)與抗體的結(jié)合目前，約70-80%的抗體純化使用Protein A、Protein G 親和層析。蛋白A (Protein A) 來(lái)源于金黃色葡萄球菌的一個(gè)株系，它含有5個(gè)可以和抗體IgG分子的Fc段特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。蛋白A作為親和配基被偶聯(lián)到瓊脂糖基質(zhì)上，可以特異性的和樣品中的抗體分子結(jié)合，而使其他雜蛋白流穿，具有極高的選擇性，一步親和層析就可達(dá)到超過(guò)95%的純度。1個(gè)蛋白A分子至少可以結(jié)合2個(gè)IgG

2、。蛋白A也可以結(jié)合另一些免疫球蛋白，如用于某些種屬的IgA、IgM的純化。天然 (Native Protein A) 和重組的蛋白A (rProtein A) 對(duì)于IgG的Fc段有著相似的特異結(jié)合。重組的蛋白A經(jīng)改造后含有一個(gè)C末端半胱氨酸，可以單一位點(diǎn)偶聯(lián)于瓊脂糖上，降低了空間位阻，增加了與IgG 的結(jié)合能力。蛋白A 與IgG的結(jié)合強(qiáng)度很大成度上依賴(lài)于該抗體的種屬和亞型，而其動(dòng)態(tài)結(jié)合能力則決定于結(jié)合強(qiáng)度 (解離常數(shù)) 及傳質(zhì)阻力等多種因素(例如上樣時(shí)樣品在柱內(nèi)的停留時(shí)間)。2 Protein G Sepharose 親和層析介質(zhì)與抗體的結(jié)合蛋白G是一種源自鏈球菌G族的細(xì)胞表面蛋白，為三型Fc

3、受體。其通過(guò)類(lèi)似于蛋白A 的非免疫機(jī)制與抗體的Fc段結(jié)合。像蛋白A 一樣，蛋白G可以與IgG的Fc 區(qū)域特異性結(jié)合，不同的是，Protein G Sepharose 可以廣泛、更強(qiáng)地結(jié)合更多類(lèi)型的IgG, 多克隆IgG及人IgG，同時(shí)血清蛋白結(jié)合水平更低，純度更高，配基脫落也相對(duì)更低。此外，蛋白G還可以和某些抗體的Fab 和F (ab)2 段結(jié)合。Protein G是從G類(lèi)Streptococci細(xì)菌中分離出來(lái)的胞壁蛋白，與多數(shù)哺乳動(dòng)物的IgG Fc段結(jié)合(包括：人、山羊、綿羊、兔、豚鼠、馬、豬、猴、小鼠等)，分子量：25kDa。Protein G可用于純化不能與Protein A很好結(jié)合的哺

4、乳動(dòng)物單抗和多抗IgG的純化。相對(duì)于Protein A，Protein G對(duì)于大多數(shù)哺乳動(dòng)物的IgG有著更高的親和力，尤其是對(duì)于IgG的亞基，如人 IgG3，小鼠IgG1和鼠 IgG2a。與Protein A不同，Protein G不與狗IgG結(jié)合、不結(jié)合人IgM，IgD，或IgA。  重組蛋白G(Recomb Protein G)已經(jīng)除去了與白蛋白及細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)，減少了交叉反應(yīng)和非特異性結(jié)合。因此，它比天然蛋白G和蛋白A有更大的親和力?？梢源娑梗瑥V泛應(yīng)用于免疫化學(xué)等領(lǐng)域。在親和力、穩(wěn)定性等方面好。本產(chǎn)品將我公司自主設(shè)計(jì)和生產(chǎn)的新型重組蛋白G偶聯(lián)到環(huán)氧活化的瓊脂糖凝膠6B上，

5、成為用于抗體分離純化的親和層析介質(zhì)本產(chǎn)品穩(wěn)定性好，基團(tuán)脫落少，使用壽命長(zhǎng)，使用方便，可從腹水或培養(yǎng)液中直接分離純化抗體。由于采用了環(huán)氧活化的方法，與溴化氰活化方法相比，可獲得長(zhǎng)短更適合的結(jié)合臂，使抗體純化獲得更好的效果。并且這種方法活化的瓊脂糖凝膠沒(méi)有離子交換的作用，因而其死吸附少。二、 親和介質(zhì)特性： 特點(diǎn)基團(tuán)脫落少，結(jié)合特異性強(qiáng)基質(zhì)6% 的交聯(lián)瓊脂糖凝膠配基重組蛋白G配基密度6mg 重組蛋白G/ml吸附載量3-7mg 鼠IgG2a/ml親和介質(zhì)的顆粒大小50-160m最大流速200cm/hpH 范圍3-10 ，在位清洗時(shí)pH 范圍可到2-11使用溫度常溫保存溫度+48保存液體20

6、% 乙醇 三、 適用范圍Protein A和Protein G的相對(duì)結(jié)合強(qiáng)度 物種物種亞類(lèi)亞類(lèi)protein A 結(jié)合protein G 結(jié)合人lgA可變- lgD- lgD- lgG1+ lgG2+ lgG3-+ lgG4+ lgM可變-雞蛋黃lgY-牛 +狗 +山羊 -+豚鼠lgG1+ lgG2+倉(cāng)鼠 +馬 +考拉 -+駱駝 -+猴(恒河) +小鼠lgG1+ lgG2a+ lgG2b+

7、0;lgG3+ lgM可變-豬 +兔 +大鼠lgG1-+ lgG2a-+ lgG2b-+ lgG3-+綿羊 +/-+ =強(qiáng)結(jié)合，+ =中等結(jié)合，- =弱或不結(jié) 四、 緩沖液配制建議采用磷酸緩沖液，洗脫后不影響下游的標(biāo)記。A緩沖液   1mol/L  Na2HPO4.12H2O(MW358.14) 358.14g 1500 mM NaCl l(MW68.08g/mol) 87.7g        &

8、#160;  溶于1升水，濾膜過(guò)濾 B緩沖液    1mol/L NaH2P04 (MW156.01) 156.01g    1500 mM NaCl l(MW68.08g/mol) 87.7g溶于1升水，濾膜過(guò)濾C 吸附和洗滌緩沖液   根據(jù)所需PH值，按下表3配制。按照所列比例量取后混合，然后再加9倍體積的水，稀釋成應(yīng)用溶液。如果洗脫下的抗體有些雜帶，可加吐溫-20至終濃度0.05%D 中和緩沖液:A液77.4ml 、B液22.6ml；兩液混合成PH7.4的中和

9、緩沖液E 洗脫液   0.1mol/L NaH2P04 (MW156.01) 15.601g   150 mM NaCl l(MW68.08g/mol) 8.77g  溶于1升水，濾膜過(guò)濾，HCl調(diào)整PH至3.0 五、應(yīng)用舉例   A 實(shí)驗(yàn)名稱(chēng)：從小鼠腹水中分離純化IgG2a1、 重組蛋白G 瓊脂糖凝膠裝柱，柱床體積為1ml，流盡20%乙醇溶液；2、以緩沖液C平衡5-10個(gè)床體積，流速為1ml/min；（緩沖液C配制方法：取A液35.2ml、B液64.8ml，再加900ml水，混合后P

10、H6.5）.3、 將0.2ml小鼠腹水用緩沖液C稀釋到2ml，0.45m 濾膜過(guò)濾，上樣。流速為1ml/min；4、 用緩沖液C再洗5-10 個(gè)床體積，流速為1ml/min；5、 用洗脫液E,洗脫3體積。6、在洗脫液加入0.2體積中和緩沖液，以PH試紙確認(rèn)溶液為中性。溶液太酸，會(huì)損傷抗體活性（中和緩沖液配制方法：A液77.4ml 、B液22.6ml；兩液混合成PH7.4的中和緩沖液7、 將分離純化的IgG2a 與對(duì)照品同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析。8、 用純水流洗10個(gè)柱床體積，再用20%的乙醇流洗10 個(gè)柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于+48環(huán)境中保存 表三，25下0

11、.1mol/L磷酸鈉緩沖液的配制 pHA液1mol/L Na2HPO4(ml)B液1mol/L NaH2PO4(ml)5.87.992.16.012.088.06.217.882.26.425.574.56.635.264.86.846.353.77.057.742.37.268.431.67.477.422.67.684.515.57.889.610.48.093.26.8     根據(jù)比例量取混合，然后在加9倍體積的水，稀釋成應(yīng)用溶液。 B 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：（1）蛋白

12、樣品的準(zhǔn)備：1）對(duì)于10厘米細(xì)胞培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌一次，然后加入500微升至2毫升細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞。3） 對(duì)于組織樣品參考貼壁細(xì)胞使用裂解液的比例進(jìn)行裂解。4）對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞后，PBS洗滌一次，然后參考貼壁細(xì)胞的裂解方法進(jìn)行裂解。注： 詳細(xì)的裂解方法參考不同裂解液的詳細(xì)使用方法。對(duì)于不同的培養(yǎng)器材，參考10厘米培養(yǎng)皿的裂解液的用量進(jìn)行裂解。如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過(guò)高，可以用裂解液或PBS適當(dāng)稀釋?zhuān)绻鞍讟悠窛舛冗^(guò)低，在以后的裂解過(guò)程中宜適當(dāng)減少裂解液的用量。 （2）. 去除非特異性結(jié)合(可選做)：1）. 取200微升

13、至1毫升蛋白樣品，蛋白量約為200微克至1毫克，加入約1微克和免疫沉淀時(shí)使用的IgG種屬相同的普通IgG和20微升充分重懸的Protein A+G Agarose，4緩慢搖動(dòng)30分鐘至2小時(shí)。2）. 2500rpm(約1000g)離心5分鐘，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀。注： 所謂種屬相同的IgG是指，例如后續(xù)免疫沉淀時(shí)用的是小鼠IgG，則在本步驟中可以加入normal mouse IgG，如無(wú)normal IgG可以加入其它不影響后續(xù)檢測(cè)的其它mouse IgG類(lèi)型的抗體。通過(guò)和normal IgG和Protein A+GAgarose的孵育，可以充分降低非特異性的結(jié)合，降低背景。（3）. 免疫沉淀：1）. 加入0.2-2微克用于免疫沉淀的一抗，4緩慢搖動(dòng)過(guò)夜。2）. 再加入20微升充分重懸的Protein A+G Agarose，4緩慢搖動(dòng)1-3個(gè)小時(shí)。(為方便后續(xù)的洗滌操作可以把加入充分重懸的Protein A+G Agarose的量調(diào)整為40微升。)3）. 2500rpm(約1000g)離心5分鐘，或瞬時(shí)高速離心，小心吸除上清，注意寧可留下少量上清也不能吸掉Pr