富士蘋(píng)果紅色芽變機(jī)理的研究

1、 青 島 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué)本 科 生 課 程 論 文論 文 題 目 富士蘋(píng)果紅色芽變機(jī)理研究 學(xué)生專(zhuān)業(yè)班級(jí) 園藝1002班 學(xué)生姓名（學(xué)號(hào)） 田佳興（20106188） 指 導(dǎo) 教 師 原永兵 完 成 時(shí) 間 2013年12月12日 富士蘋(píng)果紅色芽變機(jī)理研究 姓名：田佳興 指導(dǎo)老師:原永兵【摘要】富士蘋(píng)果因其具有質(zhì)優(yōu)，味美、耐貯等優(yōu)點(diǎn)，深受人們喜愛(ài)，但其色澤一直是發(fā)展的限制因素。芽變是種質(zhì)資源創(chuàng)新的重要途徑。本文主要介紹了果樹(shù)的芽變發(fā)生機(jī)理，果樹(shù)芽變機(jī)理的研究進(jìn)展。從生理方面介紹了花青苷的合成途徑及調(diào)控。通過(guò)這兩方面的研究進(jìn)展進(jìn)行富士蘋(píng)果的紅色芽變機(jī)理。 關(guān)鍵詞：富士，芽變，花青苷。 富士蘋(píng)果(

2、Malus domestica Borkh)是世界上最主要的鮮食果品之一,其果實(shí)色澤是重要的外觀品質(zhì),直接決定其商品價(jià)值。蘋(píng)果是很容易發(fā)生芽變的果樹(shù)種類(lèi)，現(xiàn)有蘋(píng)果品種中約有10%來(lái)源于芽變選種，世界蘋(píng)果總產(chǎn)量中約有50%源于芽變品種（束懷瑞.1999.107.）。表明芽變已成為蘋(píng)果重要的育種手段。遺傳的變異能夠引起富士蘋(píng)果芽變。芽變是植物產(chǎn)生變異的無(wú)限豐富的源泉，既可為雜交育種提供供新的的種質(zhì)資源，又可直接從中選育出優(yōu)良的新品種，是選育新品種的一種簡(jiǎn)易有效的方法。芽變大多在逆境條件下發(fā)生，一旦獲得則具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，可很快地在生產(chǎn)中應(yīng)用。目前，對(duì)蘋(píng)果品質(zhì)的研究主要集中在果形，色澤，糖酸，香氣等

3、方面。尤其是近年來(lái)隨著人們對(duì)健康的觀念越來(lái)越重視，色澤作為果實(shí)的重要外觀品質(zhì)，直接導(dǎo)致消費(fèi)者的購(gòu)買(mǎi)欲望。因此，如何培育著色好的優(yōu)良的品種，改善果實(shí)著色是育種家，農(nóng)藝師以及果農(nóng)亟待解決的問(wèn)題。1果樹(shù)芽變發(fā)生機(jī)理及研究進(jìn)展1.1果樹(shù)的芽變 當(dāng)今，果蔬生產(chǎn)中不少優(yōu)良品種都是從芽變中得到的芽變是體細(xì)胞突變的一種（王昆 等，2007）.芽變（sport）來(lái)源于體細(xì)胞中自然發(fā)生的變異，變異的體細(xì)胞發(fā)生于芽的分生組織或經(jīng)過(guò)分裂、發(fā)育進(jìn)入芽的分生組織，就形成變異芽。當(dāng)變異的芽萌發(fā)成枝，甚至開(kāi)花結(jié)果以后，直到表現(xiàn)出與原品種的性狀有明顯的差異時(shí)，才容易被發(fā)現(xiàn)。芽變包括染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)的變異，核內(nèi)基因突變和核外突變

4、等。芽變變異的性狀主要表現(xiàn)包括形態(tài)突變、色澤突變、風(fēng)味突變和成熟期突變。芽變的主要特點(diǎn)包括：芽變的重演性、芽變的嵌合性、芽變的穩(wěn)定性，芽變的局限性。1.2果樹(shù)芽變發(fā)生機(jī)理從細(xì)胞學(xué)來(lái)看，芽變是細(xì)胞中遺傳物質(zhì)的突變，只有頂端組織分生層的細(xì)胞發(fā)生突變時(shí)才有可能成為一個(gè)芽變。根據(jù)Santina和A.F.Blakdee等提出的組織發(fā)生層學(xué)說(shuō)來(lái)解釋果樹(shù)芽變機(jī)理 。以L1、L2、L3表示頂端分生組織的三個(gè)獨(dú)立層次，叫做組織發(fā)生層。L1一般是一層細(xì)胞，垂周分裂，分化成表皮。L2一般也是一層細(xì)胞，垂周分裂，分化為皮層外層，衍生孢原組織。L3有多層細(xì)胞，既有垂周分裂又有平周和斜向分裂，分化為皮層的中內(nèi)層、輸導(dǎo)組織

5、和髓心組織。正常情況下，這三層細(xì)胞具有相同的遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)。如果層內(nèi)或?qū)娱g不同部分含有的遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，則經(jīng)細(xì)胞分裂、分化發(fā)育后，就會(huì)使某一器官表現(xiàn)出一種或多種不同形狀，稱(chēng)之為嵌合體。突變發(fā)生的時(shí)間較早，梢端正在分裂的細(xì)胞數(shù)較少，突變細(xì)胞又處于某一組織發(fā)生層的中心處，則形成周緣嵌合體；突變發(fā)生時(shí)期較晚，梢端正在分裂的細(xì)胞數(shù)較多，突變細(xì)胞又不處于某一組織發(fā)生層的中心處，則形成扇形嵌合體，或叫做部分周緣嵌合體（如圖1.1所示）。一般情況下，只有L1或L2或L3個(gè)別層中的個(gè)別細(xì)胞發(fā)生突變，三層同時(shí)發(fā)生芽變的可能性幾乎是不存在的（景士西，2000）。果樹(shù)上大部分形成周緣嵌合體的芽變是很穩(wěn)定的，形狀一經(jīng)

6、發(fā)生改變，在生命周期內(nèi)可通過(guò)無(wú)性繁殖長(zhǎng)期保持。只有極少數(shù)的芽變會(huì)在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中恢復(fù)成原有的類(lèi)型，這就是回歸突變。因此果樹(shù)的芽變有廣泛的多樣性，有包括花、果、枝和植株形態(tài)方面的變異，也有果實(shí)成熟期，果實(shí)品質(zhì)、抗性等生理特性的變異。1.3果樹(shù)芽變機(jī)理研究進(jìn)展目前果樹(shù)芽變的研究主要集中在染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目變異、反轉(zhuǎn)子的插入、DNA甲基化、基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)差異等方面（陶能?chē)?guó)，2006）。1.3.1反轉(zhuǎn)錄座子的插入植物基因組的主要成分是反轉(zhuǎn)錄座子，以多拷貝形式出現(xiàn)。其轉(zhuǎn)座過(guò)程是轉(zhuǎn)座因子的DNA先被轉(zhuǎn)錄成RNA，再借助反轉(zhuǎn)錄酶/RNase反轉(zhuǎn)錄成DNA，插入到新的染色體位點(diǎn)，反轉(zhuǎn)座子通過(guò)復(fù)制實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座，增加了

7、轉(zhuǎn)座元件的拷貝數(shù)，從而極大地增加了植物基因組的大小。反轉(zhuǎn)座子能通過(guò)插入基因附近或內(nèi)部而導(dǎo)致基因突變或重拍，引起基因表達(dá)的失活或改變，因其特有的復(fù)制模式，保留樂(lè)了插入位點(diǎn)的序列，引起突變的相對(duì)穩(wěn)定。目前基于反轉(zhuǎn)子的標(biāo)記有SSAP、IRAP、REMAP、RIVP、RBIP。研究發(fā)現(xiàn)，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子廣泛存在于果樹(shù)中。通用SSAP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)富士芽變材料和對(duì)照的色澤進(jìn)行遺傳鑒定，發(fā)現(xiàn)芽變材料中的國(guó)色變異很可能是由于反轉(zhuǎn)座子插入CHS基因啟動(dòng)子，導(dǎo)致CHS基因表達(dá)異常，從而引起整個(gè)花青素合成途徑的改變，果色變異（王江波，2013）。Kobayashi等研究發(fā)現(xiàn)兩個(gè)紅色葡萄品種均是逆轉(zhuǎn)座子誘導(dǎo)形成;Bre

8、to等在柑橘上也檢測(cè)到了因逆轉(zhuǎn)座子而導(dǎo)致的芽變現(xiàn)象。1.3.2DNA甲基化狀態(tài)的改變植物的生長(zhǎng)發(fā)育反應(yīng)是通過(guò)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)的，DNA的甲基化是這一類(lèi)調(diào)節(jié)的主要調(diào)控方式。DNA甲基化其作用是C導(dǎo)致基因失活，DNA甲基化程度越高，基因的表達(dá)活性越低，基因的5端和3端往往含有甲基化位點(diǎn)，啟動(dòng)子上的DNA甲基化密度與基因轉(zhuǎn)錄受抑制的程度密切相關(guān).（朱玉賢等，2007）DNA甲基化可以通過(guò)有絲分裂和減數(shù)分裂遺傳（Parketal,1996）。DNA甲基化在果樹(shù)中的現(xiàn)象也普遍存在，其狀態(tài)時(shí)產(chǎn)生壓扁的另一個(gè)原因（陶能?chē)?guó)，2006）。鄧秀新等（2005）應(yīng)用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性（MSAP）技術(shù)對(duì)24個(gè)臍

9、橙品種胞嘧啶甲基化模式和程度進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化在臍橙中發(fā)生頻繁，且品種之間的甲基化存在較大差異。1.3.3基因結(jié)構(gòu)的突變 基因結(jié)構(gòu)的突變可以根據(jù)發(fā)生突變的基因的不同分為以下兩種類(lèi)型：一類(lèi)是編碼代謝途徑中的酶結(jié)構(gòu)基因的突變，導(dǎo)致酶活性的改變或喪失。王江波（2013）。發(fā)現(xiàn)富士蘋(píng)果芽變材料中的紅色變異是花青素合成途徑中的關(guān)鍵酶CHS比對(duì)照多出一個(gè)片段。另一類(lèi)突變的發(fā)生是由于在編碼轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因中，調(diào)節(jié)編碼區(qū)的差異能夠引起轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)的微小變化，可使植物性狀表現(xiàn)出明顯不同（Schwinn etal，2006）.基因的調(diào)控區(qū)突變能夠引起調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平的改變進(jìn)而造成性狀的變化。紅肉蘋(píng)果Md

10、MYB10啟動(dòng)子中有多個(gè)重復(fù)序列，重復(fù)序列的個(gè)數(shù)決定了MdMYB10的表達(dá)強(qiáng)度，進(jìn)而影響紅肉蘋(píng)果的紅色程度（Espley etal,2009）,而白肉品種中不存在該重復(fù)序列。1.4果樹(shù)芽變的鑒定果樹(shù)“芽變”鑒定的方法主要形態(tài)學(xué)鑒定，孢粉學(xué)鑒定，同工酶鑒定、分子標(biāo)記鑒定等。形態(tài)學(xué)鑒定，一般的芽變鑒定方法有細(xì)胞體積和器官形態(tài)的鑒定，通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)形態(tài)發(fā)生改變后，才能進(jìn)一步進(jìn)行嫁接鑒定或者移動(dòng)栽培鑒定。孢粉學(xué)鑒定，通過(guò)觀察花粉的形態(tài)來(lái)鑒定。同一類(lèi)型或品種的基本形態(tài)特征是比較穩(wěn)定的，因此該種鑒定方法應(yīng)用于不同品種的的鑒定。同工酶鑒定，同工酶可以成為生物品種鑒別，性狀早期預(yù)測(cè)和遺傳分析的確切天然標(biāo)記。同工

11、酶是基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，可以很直觀的反映出品種間的基因差異。分子標(biāo)記技術(shù)，是對(duì)生物體的遺傳物質(zhì)的多態(tài)性為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記。分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)芽變材料進(jìn)行檢測(cè)可不受環(huán)境，取材部位，發(fā)育時(shí)間的影響，甚至可檢出單基因的變異。目前應(yīng)用于果樹(shù)芽變鑒定的DNA分子標(biāo)記技術(shù)有RFLP、AFLP、RAPD等。2.花青苷的生物合成和調(diào)控 蘋(píng)果果實(shí)果皮的著色與花青苷含量和成分密切相關(guān)；蘋(píng)果果皮中主要含有的花青苷是花青苷-3-半乳糖苷，也含有少部分的花青苷-3-阿拉伯糖苷和花青素-7-阿拉伯糖苷。因此，要研究富士蘋(píng)果的紅色芽變，就必須深入對(duì)花青苷的合成途徑和調(diào)控因子的研究。2.1花青苷生物合成途徑花青苷對(duì)果實(shí)、花和種子的

12、顏色起重要作用（Regan et al，2001;Schaefer et al,2004）。它是由酶催化產(chǎn)生的此生代謝產(chǎn)物，統(tǒng)稱(chēng)為類(lèi)黃酮。蘋(píng)果果實(shí)著色與花青苷的含量和成分密切相關(guān)(Honda et al.2002）。花青苷的生物合成途徑已經(jīng)研究得比較清楚。花青苷是由植物的次生代謝途徑苯丙烷類(lèi)代謝產(chǎn)生。苯丙氨酸是花青素生物合成的直接前體，苯丙氨酸到花青素要經(jīng)歷三個(gè)階段：第一階段由苯丙氨酸解氨酶（PAL）催化苯丙氨酸肉桂酸的反應(yīng)，而后又在肉桂酸羥化酶（C4H）和香豆酞CoA連接酶（4CL）的催化下形成香豆素-CoA；第二階段由香豆素-CoA與丙二酰-CoA在查爾酮合成酶(CHS)的催化下形成黃色的

13、4-羥查爾酮，4-羥查爾酮異構(gòu)酶（CHI）催化4-羥查爾酮形成4,5,7-三羥黃烷酮，第三步在黃烷酮-3-氫化酶（F3H）的作用下柚苷配基轉(zhuǎn)化成DHK，DHK又在類(lèi)黃烷酮-3-氫化酶（F3H）的作用下形成DHQ，DHQ經(jīng)二氫黃酮醇-4-還原酶（DFR）還原成無(wú)色花青素雙加氧酶（LDOX）,合成有色的花青素。最后，由UFGT進(jìn)行糖基化反應(yīng)，花青素與單糖通過(guò)糖配基結(jié)合形成穩(wěn)定的花青苷，最后通過(guò)轉(zhuǎn)移酶運(yùn)送到液泡中。2.2光照對(duì)花青素生物合成的影響在影響花青苷合成的環(huán)境因子中，光照的影響能力尤為突出?；ㄇ嘬盏暮铣墒芄庹盏墓鈴?qiáng)和光質(zhì)影響。用160µmol.m-2.s-1的光照強(qiáng)度連續(xù)24小時(shí)對(duì)

14、離體富士蘋(píng)果進(jìn)行光照，發(fā)現(xiàn)果皮花青素的含量有所增加（王中華 等，2004）。在蘋(píng)果中，對(duì)花青苷合成起作用的光質(zhì)有紫外光A，紫外光B、藍(lán)光、紅光和遠(yuǎn)紅（原永兵等，1995）。2.3溫度對(duì)花青苷生物合成的影響溫度是影響花青苷合成的另一重要環(huán)境因子。主要影響花青苷合成和積累。在一定范圍內(nèi)，花青苷濃度與溫度呈正相關(guān)（李躍等，2007）。在開(kāi)始著色后的7-21天在20的條件下葡萄果皮花青素的積累和VvmybAL基因的表達(dá)水平，進(jìn)而促進(jìn)果皮中的花青素積累（Takos et al；2006）。2.4套袋對(duì)花青苷生物合成的影響 套袋是影響果實(shí)著色的另一措施。蘋(píng)果的色澤主要是由葉綠素、胡蘿卜素、花青苷及可溶性桃

15、水化合物的含量影響。在果實(shí)生長(zhǎng)前期，套袋能夠抑制富士蘋(píng)果果皮中葉綠素的合成速度；在后期，套袋又促進(jìn)葉綠素的降解。套袋蘋(píng)果果皮的花青苷含量和葉綠素含量的變化有助于著色（程存剛等，2002）。2.5花青苷合成的調(diào)控植物花青苷生物合成受兩類(lèi)基因的共同控制：一類(lèi)是結(jié)構(gòu)基因，編碼生物合成途徑追蹤所需的酶，不同種植物中具有較強(qiáng)的序列同源性。另一類(lèi)是調(diào)節(jié)基因，決定花青苷積累的時(shí)間和分布?；ㄇ嘬丈锖铣赏緩街兴璧拿笧椋罕奖彼峤獍泵福≒AL）查爾酮合成酶（CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（CHI）、黃烷酮-3-羥化酶（F3H）。調(diào)控花青苷合成的轉(zhuǎn)錄因子一般包括四個(gè)功能域：轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，寡聚化位點(diǎn)、核定位信號(hào)和DNA結(jié)合

16、區(qū)。目前已分離和鑒定的參與花青苷合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子主要包括bHLH、MYB、和WD40三類(lèi)（Ramsay and Glover，2005）。3.本研究的目的意義蘋(píng)果果皮的顏色主要是果皮的花青苷含量決定的，花青苷生物合成是是一系列的酶促反應(yīng)。因同種酶在不同物種中的表現(xiàn)不同導(dǎo)致不同植物的紅色調(diào)控發(fā)育生理機(jī)制也有所不同，蘋(píng)果上花青苷和成與相關(guān)酶的關(guān)系有待進(jìn)一步明確。自然界中有許多芽變?yōu)槲覀兲峁┴S富的研究材料。本研究能夠深入揭示“富士蘋(píng)果”紅色芽變的機(jī)理，從而能夠加深我們對(duì)蘋(píng)果果皮中的花青苷合成調(diào)控的認(rèn)識(shí)，為我們以后培育出著色優(yōu)良的蘋(píng)果新品種提供了理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)1.程存剛, 劉鳳之, 魏長(zhǎng)存, 等

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