實驗3培養(yǎng)基的配制及消毒滅菌

1、實驗3 培養(yǎng)基的配制及消毒滅菌第一講、培養(yǎng)基的配制一、實驗目的和內(nèi)容目的：學習和掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟。內(nèi)容：1牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基的配制。2高氏1號培養(yǎng)基的配制。3馬丁氏培養(yǎng)基的配制。二、實驗材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/L NaOH、lmol/L HCl、KNO3、NaCl、K2HPO43H2O、MgSO47H2O、FeSO47H2O。試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH試紙、棉花、牛皮紙、記號筆、線繩、紗布、漏斗、漏斗架、膠管、止水夾等。三、操作步驟（一）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和

2、最普通的細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl5g，瓊脂1520g，水1000mL，PH7.47.6 1稱藥品 按實際用量計算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏可放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯；也可放在稱量紙上稱量，隨后放入熱水中，牛肉膏使與稱量紙分離，立即取出紙片。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。2加熱溶解 在燒杯中加入少于所需要的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻棒攪拌，待藥品完全溶解后再補充水分至所需量。若配制固體培養(yǎng)基，則將稱好的瓊脂放入己溶解的藥品中，再加熱融化，此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補足所失的水分。3

3、調(diào)pH 檢測培養(yǎng)基的pH，若pH偏酸，可滴加lmol/L NaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙檢測，直至達到所需pH范圍。若偏堿，則用lmol/L HCl進行調(diào)節(jié)。pH的調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。應注意pH值不要調(diào)過頭，以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。4過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用4層紗布趁熱過濾，以利培養(yǎng)的觀察。但是供一般使用的培養(yǎng)基，這步可省略。5分裝 按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時可用漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。分裝量：固體培養(yǎng)基約為試管高度的l/5，滅菌后制成斜面。分裝入三角瓶內(nèi)以不超過其容積的一半為宜。半固體培養(yǎng)基以試管高

4、度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。6加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脫脂棉)制作的棉塞。棉塞的形狀、大小和松緊度要合適，四周緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞總長約3/5塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防棉塞脫落。有些微生物需要更好的通氣，則可用8層紗布制成通氣塞。有時也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。7包扎 加塞后，將三角瓶的棉塞外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防滅菌時冷凝水沾濕棉塞。若培養(yǎng)基分裝于試管中，則應以5支或7支在一起，再于棉塞外包一層牛皮紙，用繩扎好。然后用記號筆注明、培養(yǎng)基名稱、組別、日期。8滅菌 將上述培養(yǎng)基于121.3濕熱滅菌20min。如因特殊情況不

5、能及時滅菌，則應故人冰箱內(nèi)暫存。9擺斜面 滅菌后，如制斜面，則需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，并調(diào)整斜度，便斜面的長度不超過試管總長的1/2。10無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入37溫箱中培養(yǎng)2448h，無菌生長即可使用，或貯存于冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。（二）高氏l號培養(yǎng)基的配制高氏1號培養(yǎng)基是用于分離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。其配方如下：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO43H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，F(xiàn)eSO47H2O 0.01g，瓊脂1520g，水1000mL，pH7.47.6。 l稱量和溶解 先計算后稱量，按用量先稱取可溶性淀粉，放入小燒

6、杯中，并用少量冷水將其調(diào)成糊狀，再加至少于所需水量的水，繼續(xù)加熱，邊加熱邊攪拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。對微量成分FeSO47H2O可先配成高濃度的貯備液后再加入，方法是先在1000mL中加入1g的FeSO47H2O，配成濃度為0.01g/mL的貯備液，再在1000mL培養(yǎng)基中加入以上貯備液1mL即可。待所有藥品完全溶解后，補充水分到所需的總體積。如要配制固體培養(yǎng)基，其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。2pH調(diào)節(jié)、分裝、包扎及無菌檢查 同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。（三）馬丁氏培養(yǎng)基的配制馬丁氏培養(yǎng)基是用于分離真菌的選擇培養(yǎng)基。其配方如下：K2HPO4 1g，MgSO47H2O

7、0.5g，蛋白胨5g，葡萄糖l0g，瓊脂1520g，水1000mL，自然pH。1稱量和溶解 先計算后稱量，按用量稱取各成分，并將其溶解在少于所需的水中。待各成分完全溶解后，補充水分到所需體積。再將孟加拉紅配成1%的水溶液，在1000mL培養(yǎng)液中加入以上孟加拉紅溶液3.3mL，混勻后，加入瓊脂加熱融化，方法同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制。2分裝、包扎、滅菌及無菌檢查同牛肉膏蛋白膝培養(yǎng)基配制。 3鏈霉素的加入 鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時，將培養(yǎng)基融化后待溫度降至45左右時才能加入。可先將鏈霉素配成1%的溶液(配好的鏈霉素溶液保存于-20)，在100mL培養(yǎng)基中加1%鏈霉素0.3mL ，使每毫升培養(yǎng)基

8、中合鏈霉素30g。四、注意事項 稱藥品用的牛角匙不要混用，稱完藥品應及時蓋緊瓶蓋。調(diào)pH時要小心操作，避免回調(diào)。不同培養(yǎng)基各有配制特點，要注意具體操作。五、實驗報告記錄本實驗配制培養(yǎng)基的名稱、數(shù)量，并圖解說明其配制過程，指明要點。六、問題和思考l配制培養(yǎng)基有哪幾個步驟?在操作過程中應注意些什么問題?為什么?2培養(yǎng)基配制完成后，為什么必須立即滅菌?若不能及時滅菌應如何處理?已滅菌的培養(yǎng)基如何進行無菌檢查? 3試設(shè)計實驗對飲料進行無菌檢查。第二講 消毒與滅菌一、干熱滅菌（一）目的要求1了解干熱滅菌的原理和應用范圍。2學習干熱滅菌的操作技術(shù)。（二）基本原理干熱滅菌是利用高溫使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固

9、變性而達到滅菌的目的。細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固性與其本身的含水量有關(guān)，在菌體受熱時，當環(huán)境和細胞內(nèi)含水量越大，則蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固緩慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高（160170），時間要長（12h），但干熱滅菌溫度不能超過180，否則，包器皿的紙或棉塞就會燒焦，甚至引起燃燒。干熱滅菌使用的電烘箱的結(jié)構(gòu)如圖3-1。（三）器材培養(yǎng)皿、試管、吸管、電烘箱等。（四）操作步驟1裝入待滅菌物品將包好的待滅菌物品（培養(yǎng)皿、試管，吸管等）放入電烘箱內(nèi)，關(guān)好箱門。物品不要擺得太擠，以免妨礙空氣流通，滅菌物品不要接觸電烘箱內(nèi)壁的鐵板，以防包裝紙烤焦起火。2升溫接通電源，撥動開關(guān)，打開

10、電烘箱排氣孔，旋動恒溫調(diào)節(jié)器至綠燈亮，讓溫度逐漸上升。當溫度升至100時，關(guān)閉排氣孔。在升溫過程中，如果紅燈熄滅，綠燈亮，表示箱內(nèi)停止加溫，此時如果還未達到所需的160170溫度，則需轉(zhuǎn)動調(diào)節(jié)器使紅燈再亮，如此反復調(diào)節(jié)，直至達到所需溫度。3恒溫當溫度升達到160170時，恒溫調(diào)節(jié)器會自動控制調(diào)節(jié)溫度，保持此溫度2h。干熱火菌過程。嚴防恒溫調(diào)節(jié)的自動控制失靈而造成安全事故。4降溫切斷電源、自然降溫。5開箱取物待電烘箱內(nèi)溫度降到70以下后，打開箱門，取出滅菌物品。電烘箱內(nèi)溫度末降到70，切勿自行打開箱門以免驟然降溫導致玻璃器皿炸裂。（五）實驗報告思考題l在干熱滅菌操作過程中應注意哪些問題，為什么?

11、2為什么干熱火菌比濕熱滅菌所需要的溫度要高，時間要長?請設(shè)計干熱滅菌和濕熱滅菌效果比較實驗方案。圖3-1 電烘箱的外觀和結(jié)構(gòu)A.外觀 B.結(jié)構(gòu)1.溫度計; 2.排氣閥; 3.箱體; 4.控溫器旋鈕; 5.箱門; 6.指示燈; 7.加熱開關(guān); 8.溫度控制閥; 9.控制室; 10.側(cè)門; 11.工作室; 12. 保溫室; 13.電熱器; 14. 散熱板; 15.擱板二 高壓蒸氣滅菌（一）目的要求1了解高壓蒸氣滅菌的基本原理及應用范圍。2學習高壓蒸氣滅菌的操作方法。（二）基本原理高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)

12、的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點增高，得到高于100的溫度。導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低（表3-1），二是濕熱的穿透力比干熱大（表3-2），三是濕熱的蒸氣有潛熱存在。1g水在100時，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時可放出2.26kJ(千焦)的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸氣的

13、膨脹壓，所以，當水蒸氣中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。滅菌鍋內(nèi)留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關(guān)系見（表3-3）表3-1 蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系卵白蛋白含水量/%30分鐘內(nèi)凝固所需溫度/505625748018809061450160170表3-2 干熱溫熱穿透力及滅菌效果比較溫度/時間/h透過布層的溫度/滅菌20層10層100層干熱130-1404867270.5不完全濕熱105.33101101101完全表3-3 滅菌鍋留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關(guān)系壓力數(shù)全部空氣排出時的溫度/2/3空氣排出時的溫度/1/2空氣排出時的溫度/1/3空氣排出時的

14、溫度/空氣全不排出時的溫度/MpaKg/cm2Ib/in20.030.355108.81009490720.070.7010115.6109105100900.1010.515121.31151121091000.141.4020126.21211181151090.171.7525130.01261241211150.212.1030134.6130128126121現(xiàn)在法定壓力單位己不用磅和kg/cm2表示，而是用Pa或bar表示，其換算關(guān)系為：1kg/cm2=98066.5Pa；1Ib/in2=6894.76Pa.一般培養(yǎng)基用0.1Mpa（相當于15 Ib/in2或1.05kg/cm2）

15、，121.5,1530min可達到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。例如含糖培養(yǎng)基用0.06Mpa（8Ib/in2或0.59kg/cm2）112.6滅菌，然后以無菌操作手續(xù)加入滅菌的糖溶液。又如盛于試管內(nèi)的培養(yǎng)基以0.1Mpa,121.5滅菌20min即可，而盛于大瓶內(nèi)的培養(yǎng)基最好以0.1Mpa，122滅菌30min。實驗中常用的非自控高壓蒸氣滅菌鍋有臥式（圖3-2，A）和手提式（圖3-2，B）二種，其結(jié)構(gòu)和工作原理相同，本實驗以手提式高壓蒸氣滅菌鍋為例，介紹其使用方法，有關(guān)自控高壓蒸氣滅菌鍋（autoclave）的使用可參照廠家說明書。（三）器

16、材牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿(6套一包)，手提式高壓蒸氣滅菌鍋等。（四）操作步驟1首先將內(nèi)層鍋取出，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。 切勿忘記加水，同時水量不可過少，以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。2放回內(nèi)層鍋，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸氣流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與鍋壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。3加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。4用電爐或煤氣加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣

17、壓力增加到逐漸上升。當鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用0.1Mpa，121.5，20min滅菌。滅菌的主要因素是溫度而不是壓力。因此鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后，才能關(guān)上排氣閥，維持所需壓力。5滅菌所需時間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當壓力表的壓力降至“0”時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。壓力一定要降到“0”時，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)基由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養(yǎng)基而發(fā)生污染，甚至灼傷操作者。6將取出的滅菌培養(yǎng)基，需擺斜面的則擺成斜面，然后放入37溫箱培養(yǎng)

18、24h，經(jīng)檢查若無雜菌生長，即可待用。 圖3-2A 臥式滅菌鍋 圖3-2B 手提式滅菌鍋1. 安全閥; 2.壓力表; 3.放氣閥; 4.軟管; 5.緊固螺栓; 6.滅菌桶; 7. 篩架; 8.水 （五）實驗報告l結(jié)果檢查培養(yǎng)基滅菌是否徹底。 2思考題（1）高壓蒸氣滅菌開始之前，為什么要將鍋內(nèi)冷空氣排盡?滅菌完畢后，為什么待壓力降低“0”時才能打開排氣閥，開蓋取物？（2）在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時，怎樣杜絕一切不安全的因素?（3）滅菌在微生物實驗操作中有何重要意義?（4）黑曲霉的孢子與芽孢桿菌的孢子對熱的抗性哪個最強?為什么? 三、紫外線滅菌（一）目的要求了解紫外線滅菌的原理和方法（二）基本原理

19、紫外線滅菌是用紫外線燈進行的。波長為200300nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強。在波長一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強度和時間的乘積成正比。紫外線殺菌機理主要是因為它誘導了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成O，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成過氧化氫（H2O2）。O3和H2O2均有殺菌作用。紫外線穿透力不大，所以，只適用于無菌室，接種箱，手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。紫外線燈距照射物以不超過1.2m為宜。此外，為了加強紫外線滅菌效果，在打開紫外燈以前；可在無菌室內(nèi)(或接種箱內(nèi))噴灑

20、3%5%石炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，另一方面也可以殺死一部分細菌。無菌室內(nèi)的桌面、凳子可用2%3%的來蘇爾擦洗，然后再開紫外燈照射，即可增強殺菌效果，達到滅菌目的。（三）器材1培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨平板。2溶液或試劑 3%5%石炭酸或2%3%來蘇爾溶液。3儀器或其他用具 紫外線燈。（四）操作步驟l單用紫外線照射（1）在無菌室內(nèi)或在接種箱內(nèi)打開紫外線燈開關(guān)，照射30min，將開關(guān)關(guān)閉。（2）將牛肉膏蛋白胨平板蓋打開15min，然后蓋上皿蓋。置37培養(yǎng)24h。共做三套。 （3）檢查每個平板上生長的菌落數(shù)。如果不超過4個，說明滅菌效果良好，否則，需延長照射時間或同時加強其他措施。

21、 2化學消毒劑與紫外線照射結(jié)合使用（1）在無菌室內(nèi)，先噴灑3%5%的石炭酸溶液，再用紫外線燈照射15imn。 （2）無菌室內(nèi)的桌面，凳子用2%3%來蘇爾擦洗，再打開紫外線燈照射15min。 （3）檢查滅菌效果方法同“單用紫外線照射”(3)。 因紫外線對眼結(jié)膜及視神經(jīng)有損傷作用，對皮膚有刺激作用，故不能直視紫外線燈光下工作。（五）實驗報告1結(jié)果記錄兩種滅菌效果于下表中處理方法平板菌落數(shù)1 2 3滅菌效果比較紫外線照射3%5%石炭酸+紫外線照射2%3%來蘇爾+紫外線照射2思考題。（1）細菌營養(yǎng)體細胞和細菌芽孢對紫外線和的抵抗力會一樣嗎，為什么？（2）你知道紫外線燈管是用什么玻璃制作的？為什么不用普通燈用玻璃？（3）在紫外燈下觀察實驗結(jié)果時，為什么要隔一塊普通玻璃？四 微孔濾膜過濾除菌（一）目的要求1了解過濾除菌的原理。2掌握微孔濾膜過濾除菌的方法。（二）基本原理過濾除菌是通過機械作用濾去液體或氣體中細菌的方法。根據(jù)不同的需要選用不同的濾器和濾板材料。微孔濾膜過濾器是由上下二個分別具有出口和入口連接裝置的塑料蓋盒組成，出口處可連接針頭，人口