規(guī)?；⒓s化養(yǎng)殖禽病防控新技術(shù)

1、規(guī)模化、集約化養(yǎng)殖禽病防控新技術(shù)一、實(shí)施生物安全技術(shù) 做好生物安全是避免疾病發(fā)生的最佳方法。一個(gè)好的生物安全體系將發(fā)現(xiàn)并控制疾病侵入養(yǎng)殖場的各種最可能的途徑。（一）我國規(guī)模化養(yǎng)殖場生物安全問題1首先是養(yǎng)殖業(yè)本身存在的問題養(yǎng)殖模式多樣化；人畜混居、多種經(jīng)營、多品種、多批次、大而全/ 小而全飼養(yǎng)；活畜禽當(dāng)街宰殺；發(fā)病立即賣出去，或扔于糞堆、當(dāng)街或水體；病雞/ 死雞交易；糞便露天堆放；此外養(yǎng)殖企業(yè)自身的不規(guī)范生產(chǎn)、養(yǎng)殖條件差、營養(yǎng)差（什么行情用什么料）、管理粗放等。2種禽群存在的問題存在蛋傳疫?。ò琢　⒅гw、白血病、貧血等）影響后代的健康和生產(chǎn)性能；種雞、商品雞使用的活疫苗帶來的外源性病原微生物污

2、染問題；非SPF 蛋生產(chǎn)的活毒疫苗攜帶的蛋傳性病原造成的人工感染，普通雞胚生產(chǎn)的滅活疫苗，由于卵黃抗體的存在，導(dǎo)致的抗原量不足，造成免疫失敗。3疫苗存在的問題我國明確規(guī)定，從2008 年7月1日起，家禽的活毒疫苗必須用SPD生產(chǎn)，我國SPF 蛋的數(shù)量存在嚴(yán)重不足，其次質(zhì)量也存在很多問題。監(jiān)測表明，SPF 雞群也存在著病原微生物的污染。存在著用普通雞胚或雞胚成纖維細(xì)胞制備的活疫苗，且污染支原體、雞傳染性支氣管炎病毒、雞淋巴白血病病毒、傳染性貧血因子、網(wǎng)狀內(nèi)皮增生癥病毒、呼腸弧病毒、雞傳染性法氏囊病病毒等。雞胚中的母源抗體可干擾接種疫苗病毒的繁殖，直接影響疫苗的質(zhì)量。如免疫含甲醛濃度過高的滅活疫苗

3、后，高峰期產(chǎn)蛋率僅維持在65%74%。甲醛超過國際規(guī)定的1.48倍，致使產(chǎn)蛋雞體內(nèi)雌二醇減量，由此影響卵子及子宮發(fā)育，產(chǎn)蛋率下降21%22.5%，免疫8倍甲醛含量超標(biāo)的疫苗的雞可見雞冠萎縮、蒼白，剖檢見成熟卵泡數(shù)量減少，卵子體積萎縮，卵泡顏色由黃色變成墨綠色，子宮腔體積萎縮、嚴(yán)重出現(xiàn)卵黃破裂，形成卵黃性腹膜炎。（二）實(shí)施生物安全技術(shù)1嚴(yán)格控制進(jìn)入養(yǎng)殖場的人員2嚴(yán)格控制養(yǎng)殖場的器械使用養(yǎng)殖場自己的工作人員或器械進(jìn)行接種疫苗、轉(zhuǎn)群、斷喙，每個(gè)雞舍的工作人員都不交叉。為了將生物安全的風(fēng)險(xiǎn)降到最低， 制定關(guān)于外出人員和器械進(jìn)行接種疫苗，分籠和斷喙的規(guī)程。3防止在老母雞、淘汰病死雞時(shí)將疾病引入雞舍運(yùn)輸老

4、母雞、死淘雞的的工作人員和貨車往往會去過其它養(yǎng)殖場， 這樣就很容易攜帶病原菌，必須嚴(yán)格消毒，走專門的通道。4嚴(yán)格實(shí)施全進(jìn)全出制養(yǎng)殖場只養(yǎng)殖單一日齡的雞群。雞舍在設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)是封閉的，避免將雞群暴露給野禽從而傳播疾病。另外對于死雞要進(jìn)行及時(shí)無害化處理。5避免嚙齒類進(jìn)入雞舍雞舍的周邊應(yīng)該鋪設(shè)有寬度為1m的碎石或鵝卵石，以避免嚙齒類進(jìn)入雞舍。飼料和雞蛋應(yīng)該儲藏在不受嚙齒類動物影響處， 在儲藏地的周圍應(yīng)設(shè)置大量的餌毒室，并放置有效的滅鼠藥。二、病毒疾病防控新技術(shù) -RNA干擾技術(shù)1RNA干擾的概念 RNA干擾是指當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)同源的雙鏈時(shí)，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象，這

5、種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默（一）RNA干擾過程主要有兩個(gè)步驟：1長雙鏈RNA被細(xì)胞源性的雙鏈RNA特異的核酸酶切成21-23個(gè)堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（small interfering RNA）。2小干擾性RNA與細(xì)胞源性的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC），該復(fù)合體可識別與小干擾性RNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點(diǎn)將該mRNA切斷。3RNA干擾抗病毒感染RNA干擾的優(yōu)點(diǎn)效果好：只要抑制病毒蛋白的合成，病毒就不可能存活和繁殖；特異性強(qiáng)：只針對病毒蛋白，對哺乳動物的蛋白合無抑制作用；使用方便：注射一次，有效期至少半年，長至

6、終身；無副作用：擬使用一種改造的質(zhì)粒載體，這種質(zhì)粒載體的安全性已經(jīng)得到了廣泛認(rèn)可；易于設(shè)計(jì)、構(gòu)建、建造，且成本低廉，適于規(guī)?；a(chǎn)，一旦具有干擾作用的質(zhì)粒載體構(gòu)建成功，就可以無限制的增殖。具有預(yù)防和治療雙重效果。化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不怕高溫，具有良好的耐熱性，便于保存和運(yùn)輸。 RNA干擾抗禽病毒感染RNA干擾抗禽流感病毒感染 核蛋白(NP)基因、核酸聚合酶(PA)是AIV轉(zhuǎn)錄與復(fù)制所必需的基因,且在各型流感病毒中的序列都相當(dāng)保守。在體內(nèi)外試驗(yàn)中,聯(lián)合使用針對NP與PA的siRNA的抗AIV效應(yīng)均已得到驗(yàn)證,并已有向臨床發(fā)展的可能。在體外試驗(yàn)中,采用來自香港、波多黎克4株高致病H5、H7亞型的AIV,

7、針對NP與PA的siRNA均能抑制這些AIV的復(fù)制及降低病毒滴度,并被證實(shí)抗病毒機(jī)制屬于特異的RNAi而非IFN效應(yīng)。RNA干擾抗雞傳染性支氣管炎病毒感染 雞傳染性支氣管炎病毒（IBV）可引起雞急性呼吸道病變、腎臟病變、生殖道等病變。IBV血清型眾多,而且不同血清型之間的交叉保護(hù)很小,給預(yù)防和控制帶來了很大難度。 篩選并設(shè)計(jì)IBV的N基因的小干擾RNA，進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，N基因的小干擾RNA均能抑制IBV的增殖，產(chǎn)生明顯的干擾作用。三、新型檢測技術(shù)（一）實(shí)時(shí)熒光定量PCR/RT-PCR技術(shù)1概念實(shí)時(shí)熒光定量PCR/RT-PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的累積實(shí)

8、時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。2實(shí)時(shí)熒光定量PCR/RT-PCR技術(shù)特點(diǎn)特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的檢測方法類型探針類Taqman 探針該探針是長度為20 24 bp 的寡核苷酸，在其5'末端標(biāo)記1 個(gè)熒光報(bào)告基團(tuán)，3'末端標(biāo)記1 個(gè)熒光淬滅基團(tuán)，其序列與2 個(gè)引物包含序列內(nèi)的1 段DNA模板完全互補(bǔ)。TaqmanMGB 探針TaqmanMGB 探針是在Taqman 探針的基礎(chǔ)上改進(jìn)的，在探針的3端增加了小槽黏結(jié)劑( MGB) 分子，這種物質(zhì)能夠結(jié)合在雙鏈DNA 小溝部位，使識別性高，

9、無無背景熒光。分子信標(biāo)分子信標(biāo)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，環(huán)部大小為1535 bp，能與靶DNA 序列互補(bǔ)，莖部由GC 含量較高的與靶DNA 無序列同源性的互補(bǔ)序列構(gòu)成，探針的5端與3端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)。特點(diǎn)：探針可循環(huán)利用，適用于檢測點(diǎn)突變，特異性更明顯。雙雜交探針該技術(shù)是將2條探針中的1條在5端標(biāo)記熒光，1 條在3端標(biāo)記熒光，其中一個(gè)為受體熒光基團(tuán)，另一個(gè)為供體熒光基團(tuán)，2個(gè)探針可與模板同1條鏈相鄰的序列雜交。特點(diǎn)：提高特異性，淬滅效率高。復(fù)合探針復(fù)合探針結(jié)合了分子信標(biāo)和雜交探針的優(yōu)點(diǎn)，由熒光探針和淬滅探針組成，熒光探針長25個(gè)堿基左右，5端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3

10、端磷酸化防止被延伸，淬滅探針長15個(gè)堿基左右，3端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。優(yōu)點(diǎn)：使用非熒光淬滅劑，本底低，對擴(kuò)增效率影響小，探針設(shè)計(jì)、合成、標(biāo)記、純化方便，而且探針特異性較強(qiáng)、靈敏度較高，可以用來鑒別單堿基變異。染料類SYBR Green 熒光染料SYBR Green 是一種非飽和菁類熒光素，可以嵌合于DNA 雙鏈結(jié)構(gòu)的小溝中，非特異地與dsDNA分子結(jié)合。優(yōu)點(diǎn)：簡便，降低了檢測成本，可定量。LC Green TM 熒光染料LC Green TM 熒光染料是新出現(xiàn)的一種dsDNA結(jié)合染料，能夠與dsDNA 分子完全結(jié)合直接加入PCR 反應(yīng)體系中，高濃度的LC Green TM 不會抑制PCR 反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)

11、：可得到更強(qiáng)的熒光信號。法簡便、快速、準(zhǔn)確性高、成本低，優(yōu)于SYBR Green染料法。4應(yīng)用細(xì)胞因子的表達(dá)分析應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)分析細(xì)胞因子的mRNA的表達(dá)，對其進(jìn)行定量，來估算其蛋白表達(dá)量，一是可以對疾病進(jìn)行診斷，二是闡明許多炎癥反應(yīng)、自身免疫性疾病、器官移植排異中的免疫致病機(jī)。病原體的分子檢測該技術(shù)不僅能對病原體定性，而且還能對病原體DNA 或RNA 序列準(zhǔn)確定量，同時(shí)對整個(gè)病程中潛在病原體的復(fù)活等進(jìn)行動態(tài)研究，從而對疾病進(jìn)行早期診斷、藥物療效觀察、病情判斷及預(yù)后觀察等。謝永平等應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，以鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白( OmpA) 基因保守區(qū)序列, 設(shè)計(jì)引物和探針

12、, 建立了直接檢測鴨疫里默氏桿菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 快速方法。適用于RA 的快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查、種鴨引進(jìn)隔離檢疫、活鴨及其產(chǎn)品國內(nèi)市場和進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫。（二）量子點(diǎn)技術(shù)由于量子點(diǎn)技術(shù)具有吸收光譜寬、發(fā)射光譜窄且發(fā)射光波長不受激發(fā)光波長影響等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛地應(yīng)用于生物成像、生物檢測及病毒檢測及病毒分型等領(lǐng)域。1量子點(diǎn)的組成量子點(diǎn)是一種新型的納米材料。量子點(diǎn)或半導(dǎo)體納米晶體目前多由II一VI (CdS，CdSe，CdTe等)或者III一V族(GaAs，InGaAS，InP等)等化學(xué)元素構(gòu)成的納米顆粒。其中CdX(X=Se，S，Te等)為目前研究較多及應(yīng)用較廣的量子點(diǎn)。由于光譜禁阻作用，當(dāng)

13、這些單一或者核一殼結(jié)構(gòu)納米顆粒的直徑小于其波爾直徑時(shí)，它們便能表現(xiàn)出其特有的光譜特性及理化性質(zhì)。2量子點(diǎn)的結(jié)構(gòu)將一層半導(dǎo)體材料覆蓋于量子點(diǎn)表面，形成一種核一殼結(jié)構(gòu)。外面的半導(dǎo)體覆蓋材料能起到保護(hù)核心量子點(diǎn)的作用，并且使得消光系數(shù)顯著增加，增強(qiáng)熒光的發(fā)射。3量子點(diǎn)的優(yōu)越性量子點(diǎn)具有廣泛的激發(fā)光譜量子點(diǎn)的激發(fā)光波長范圍很寬，只要激發(fā)光能量大于量子點(diǎn)的最小激發(fā)光能量，都能激發(fā)量子點(diǎn)發(fā)射熒光。狹窄對稱的量子點(diǎn)熒光譜峰在不同光譜特征量子點(diǎn)同時(shí)使用時(shí)，能夠避免熒光發(fā)射光譜的重疊 (overlaP)，從而能夠更容易區(qū)分不同的量子點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)在同一樣品中對不同生物分子的同時(shí)標(biāo)記與識別。量子點(diǎn)的顏色可控性通過控制量

14、子點(diǎn)直徑，能夠得到具有不同熒光發(fā)射波長的量子點(diǎn)。并且不同大小的量子點(diǎn)能夠被同一波長的激發(fā)光所激發(fā)，從而發(fā)出顏色不同的熒光，實(shí)現(xiàn)了一元激發(fā)，多元發(fā)射，同時(shí)檢測。量子點(diǎn)熒光穩(wěn)定性由無機(jī)物構(gòu)成的量子點(diǎn)更加穩(wěn)定，能夠經(jīng)受長時(shí)間的光激發(fā)而不會出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，其熒光壽命相較于傳統(tǒng)的有機(jī)熒光分子延長了100多倍。這一特性能夠?qū)α孔狱c(diǎn)標(biāo)記的靶標(biāo)分子進(jìn)行長時(shí)間持續(xù)觀察。量子點(diǎn)的生物相容性量子點(diǎn)，特別是經(jīng)生物相容性修飾后的量子點(diǎn)，不僅能夠特異性的與生物分子相連接，而且對生物體的毒性也很低。量子點(diǎn)高雙光子吸收截面量子點(diǎn)與普通有機(jī)熒光染料分子比較，具有較高的雙光子吸收截面比一般的有機(jī)熒光分子高出兩到三個(gè)數(shù)量級。雙光子

15、激發(fā)波長大約是單光子激發(fā)波長的一倍，并且波長較長的光子相對不易為細(xì)胞吸收，所以對活細(xì)胞造成的光學(xué)毒性會更小。3量子點(diǎn)技術(shù)的應(yīng)用禽流感病毒的檢測與分型首先將量子點(diǎn)與特異性的核酸探針相偶聯(lián)，與此同時(shí)將磁珠與另一段識別同一病毒RNA分子的核酸探針偶聯(lián)。這樣，探針分子與病毒RNA結(jié)合成雜交分子后便形成量子點(diǎn)偶聯(lián)探針一病毒RNA一磁珠偶聯(lián)探針的“三明治”復(fù)合物。通過磁分離作用，將含有量子點(diǎn)的復(fù)合物分離、富集起來。最后通過對量子點(diǎn)熒光信號的檢測實(shí)現(xiàn)對禽流感病毒的檢測與分型。核酸分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)分析方面的應(yīng)用Mahtab等將CdS量子點(diǎn)與含特定結(jié)構(gòu)的核酸片斷相連，結(jié)果發(fā)現(xiàn)能夠通過量子點(diǎn)的表面敏化發(fā)光行為區(qū)

16、分扭結(jié)型、彎曲型和直線型等結(jié)構(gòu)不同的雙鏈DNA。Han等人利用不同顏色量子點(diǎn)微珠與核酸探針連接，用此方法得到的多色探針用于DNA分子雜交中，使得DNA測序技術(shù)取得了突破性發(fā)展?；铙w動物的標(biāo)記示蹤Gao等人將功能化的量子點(diǎn)轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞，然后直接將該細(xì)胞注射至裸鼠的皮下，從而能夠根據(jù)裸鼠皮下癌細(xì)胞熒光信號，觀察癌細(xì)胞的遷移、浸潤以及分化等過程。Zhang用CdHgTe量子點(diǎn)在近紅外區(qū)對裸鼠進(jìn)行了熒光成像測試，皮下注射3天后，仍然能夠檢測到非常明顯的熒光信號。（三）其他技術(shù)1生物傳感器技術(shù)生物傳感器是利用生物物質(zhì)作為識別元件，將生化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成可定量的物理、化學(xué)信號，從而能夠進(jìn)行生命物質(zhì)（病毒、細(xì)菌等）和化學(xué)物質(zhì)檢測和監(jiān)控的裝置。人們對以病毒的DNA或病毒蛋白作為生物傳感器的檢測目標(biāo)技能進(jìn)行了相關(guān)試驗(yàn)。如果完善病毒檢測的相關(guān)技術(shù)，開發(fā)的這種病毒檢測生物傳感器將優(yōu)于其他技術(shù)，其優(yōu)勢是樣品不必進(jìn)行繁瑣的預(yù)先處理，適合