IFT74對雄性小鼠精子發(fā)生及生育能力的影響.doc

1、IFT74 對雄性小鼠精子發(fā)生及生育能力的影響目的 : 探討鞭毛內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白74（IFT74）對雄性小鼠精子發(fā)生和生育能力的影響 , 為更加全面地了解男性生殖功能障礙提供一定的科學(xué)線索。方法 : 將成年的Ift74^flox/flox雌性小鼠與 Stra8-iCre雄性小鼠雜交 , 建立 Ift74基因條件敲除小鼠 , 通過常規(guī) PCR分析小鼠的基因型 , 篩選出Stra8-iCre⁺/Ift74^flox/flox雄性小鼠作為實(shí)驗(yàn)組 ,Stra8-iCre<

2、;sup>-</sup> 雄性小鼠作為對照組 , 收集各組小鼠的心臟、 腦、脾、肺、肝、腎、肌肉、睪丸及附睪等組織 , 采用蛋白印跡法檢測在對照組小鼠各組織中 IFT74 蛋白的表達(dá)水平及睪丸組織中第一波精子發(fā)生各個(gè)階段IFT74 蛋白的表達(dá)水平 ; 采用免疫熒光染色檢測IFT74 在實(shí)驗(yàn)組及對照組雄性小鼠睪丸組織生精細(xì)胞中的定位 ; 采用 HE染色檢測睪丸和附睪等組織中精子發(fā)生各個(gè)階段的形態(tài)學(xué)的變化 , 掃描電鏡觀察附睪中精子形態(tài)的變化, 透射電鏡觀察小鼠睪丸組織超微結(jié)構(gòu)的改變 ; 蛋白印跡檢測各組小鼠睪丸組織中IT20 、IFT25、IFT27、IFT81、IFT88 、

3、IFT140、ODF2、SPAG16L、AKAP4等精子發(fā)生相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化;并收集各組雄性小鼠附睪中的精子, 進(jìn)行精子計(jì)數(shù) , 檢測精子活力 ; 同時(shí)選取 6 對6 周齡以上的 Ift74基因條件敲除雄性小鼠和對照組雄性小鼠分別與成年野生型雌性小鼠交配兩個(gè)月以上, 評估其生育及繁殖能力。 結(jié)果 :IFT74 蛋白在雄性小鼠腦、肺、腎和睪丸等組織器官中均有表達(dá), 且在睪丸組織中的表達(dá)量最高。在雄性小鼠出生后第一波精子發(fā)生的過程中,IFT74 蛋白從第 12 天開始有表達(dá) , 到第 20 天其表達(dá)量顯著上調(diào) , 至第 35 天達(dá)到最高水平。 IFT74 蛋白主要定位于精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞

4、的囊泡、延長精子細(xì)胞的頂體和中心體, 以及發(fā)育中的精子尾部。 HE染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組小鼠睪丸組織中的精子鞭毛被釋放到管腔中 , 生殖細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的殘余體被支持細(xì)胞吞噬 , 精子發(fā)生過程正常 , 且附睪管腔內(nèi)充滿有著正常頭部和尾部的精子 ; 但在 Ift74 基因條件敲除雄性小鼠睪丸組織中 ,第 VIII 階段的精子形成異常 , 沒有形成正常的殘余體 , 細(xì)胞質(zhì)保留在管腔邊緣或脫落到管腔中 , 且第 16 期異常的精子細(xì)胞被吞噬 , 在第 XI 階段觀察到具有畸形的頭部且無尾巴的異常第 11 期精子細(xì)胞 , 在第 XIII 階段的生精小管內(nèi)雖有正常的圓形精子細(xì)胞 , 但第 13 期的延長精子細(xì)胞尾

5、部缺失 , 同時(shí)過量的細(xì)胞質(zhì)脫落到管腔中 , 且附睪管腔內(nèi)幾乎觀察不到具有正常頭部和尾部的精子 , 管腔內(nèi)存在大量異常的細(xì)胞質(zhì)殘留體 , 脫落的圓形細(xì)胞 , 以及異常頭部和短尾或無尾的異常精子細(xì)胞。掃描電鏡結(jié)果顯示對照組小鼠附睪中的精子均具有形狀正常的頭部和長而光滑的尾巴 , 而 Ift74 基因條件敲除雄性小鼠精子結(jié)構(gòu)異常 , 出現(xiàn)圓頭 , 短尾或無尾等改變 ; 透射電鏡觀察到對照組小鼠睪丸曲細(xì)精管的管腔內(nèi)存在大量正常 “ 9+2”雙微管結(jié)構(gòu)的軸絲以及正常的頭部 , 但 Ift74 基因條件敲除雄性小鼠睪丸曲細(xì)精管中精子的軸突和微管呈現(xiàn)多樣性的異常 , 如無序的微管、無核心軸絲結(jié)構(gòu)的微管和線粒體簇、 或者缺失中央微管而形成異常的軸絲等。 在 Ift74 基因條件敲除雄性小鼠睪丸組織中 ,IFT-B 復(fù)合物的其他成分如 IFT27,IFT57,IFT81,IFT88 和IFT140 以及纖維鞘的主要成分AKAP4表達(dá)水平顯著低于對照組小鼠體內(nèi)的表達(dá)水平 , 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P&lt;0.05 ）。且與對照組小鼠相比 ,Ift74基因條件敲除雄性小鼠的精子數(shù)量和精子活力顯著降低, 且精子的運(yùn)動(dòng)能力也下降（ P&lt;0.05）, 雖然它們有正常的交配行為, 但完全不具備生育能力。結(jié)論 :IFT74 是雄性小鼠精