親和素和生物素系統(tǒng)

1、親和素和生物素系統(tǒng)第一頁，共14頁。親和細胞化學(xué)不同于免疫細胞化學(xué)，親和細胞化學(xué)是利用兩種物質(zhì)之間的高度親和能力而相互結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)。目前，親和組織化學(xué)中的親和物質(zhì)包括親和素與生物素、植物凝集素與糖類、葡萄球菌A 蛋白（SPA ）與IgG、抗原與抗體、陽離子與陰離子、激素與維生素和脂質(zhì)與受體等。第二頁，共14頁。親和素和生物素系統(tǒng) 親和素和生物素系統(tǒng)是在免疫組織化學(xué)技術(shù)方法上不斷加以改進，與細胞生物化學(xué)緊密結(jié)合后的產(chǎn)物。 這種方法使免疫組化技術(shù)的敏感性得到進一步提高，更有利于微量抗原（或抗體）在細胞或亞細胞水平的定位，擴大了其應(yīng)用范圍。第三頁，共14頁。生物素 生物素（biotin ），也稱維

2、生素H，是一種分子質(zhì)量為244Da 的小分子維生素。 抗體分子經(jīng)生物素化后，其結(jié)合抗原的能力不受損失，細胞經(jīng)生物素化后仍能保持正常的分裂、增殖能力，因此被用作抗體、細胞的標記。 第四頁，共14頁。親和素 親和素（avidin）是一種分子質(zhì)量為68000Da的一種堿性糖蛋白。親和素具有與其他示綜物質(zhì)，如，熒光素、酶、膠體金等，結(jié)合的能力。 生物素和親和素之間有極強的親和力，比抗體對抗原的親和力要高出100 萬倍。 親和素有4 個亞單位，它具有4 個同生物素親和力極高的結(jié)合位點，因其能使生物素失活，故又稱抗生物素。第五頁，共14頁。鏈霉親和素 鏈霉親和素（streptavidin ）是一種從鏈霉菌

3、培養(yǎng)物中提取的蛋白質(zhì)，相對分子質(zhì)量60000，且不含糖鏈。 同親和素一樣，鏈霉親和素也具有4個生物素結(jié)合位點，親和力高達1015 mol/L，是一種更完美的生物素結(jié)合蛋白。因為它很少有低聚糖殘余成分，可保持中性等電點，避免了組織中的非特異性染色。 第六頁，共14頁。標記親和素-生物素法（labeled avidin biotin，LAB） 將親和素與標記酶（HRP）結(jié)合，一個親和素可結(jié)合多個HRP 將生物素與抗體（一抗或二抗）結(jié)合，一個抗體分子可連接多個生物素分子 細胞的抗原（或通過一抗）先與生物素化的抗體結(jié)合，繼而將酶標記親和素結(jié)合在抗體的生物素上，如此多層放大提高了檢測抗原的敏感性。第七頁

4、，共14頁。橋接親和素-生物素法（bridged avidin biotin，BAB） 先使抗原與生物素化的抗體結(jié)合，再以游離親和素為“橋”將生物素化抗體與酶標記生物素連接，也可達到多層放大效果。第八頁，共14頁。親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物法（avidin biotin-peroxidase complex，ABC） 此方法為前兩種方法的改進，即先按一定比例將親和素與酶標生物素（或稱生物素化酶）結(jié)合，形成親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（ABC 復(fù)合物）。第九頁，共14頁。 ABC 復(fù)合物不能飽和，即親和素上的4 個結(jié)合位點最多允許3 個位點與生物素化酶結(jié)合，留12 個位點與生物素化二抗

5、結(jié)合。 抗原先后與特異性一抗、生物素化二抗、ABC 復(fù)合物結(jié)合，最終形成巨大復(fù)合體，因該復(fù)合體網(wǎng)絡(luò)了大量酶分子，從而提高了檢測的靈敏度。第十頁，共14頁。標記鏈霉親和素-生物素法（Labelled streptavidin biotin ，LSAB） 它是采用生物素標記的第二抗體與結(jié)合有HRP 或AKP 酶的鏈霉親和素（streptavidin ）連接來測定細胞及組織中的抗原。第十一頁，共14頁。 鏈霉親和素同一定濃度的生物素化酶混合后，就能形成鏈霉親和素-生物素-酶復(fù)合物，這種復(fù)合物中至少存在1 個尚未被生物素占據(jù)的鏈霉親和素結(jié)合位點，可以和各種生物素標記抗體結(jié)合。由于采用了改良的親和純化技術(shù)和酶標技術(shù)，LSAB 法敏感性更高、背景更清晰。第十二頁，共14頁。LSAB法優(yōu)缺點 此方法與ABC 法相比，不需A、B 兩液提前混合，操作者容易掌握，穩(wěn)定性高，由于采用了低等電點的鏈霉親和素，其內(nèi)源性生物素干擾要低于ABC 法。 該法生物素化二抗和鏈霉親和素HRP