全外顯子測序指南

1、ACMG全外顯子測序指南摘要：美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（ACMG）以前為序列突變的解釋提供了指導(dǎo).1在過去十年中，隨著高通量測序的出現(xiàn)，測序技術(shù)迅速發(fā)展。通過采用和利用下一代測序，臨床實驗室正在進行基因分型，單基因，基因組，外顯子，基因組，轉(zhuǎn)錄組和遺傳疾病表觀遺傳學(xué)檢測的不斷增加的遺傳檢測目錄。由于復(fù)雜性增加，基因檢測的這種轉(zhuǎn)變伴隨著序列解釋的新挑戰(zhàn)。在這方面，ACMG于2013年召集了一個由ACMG，分子病理學(xué)協(xié)會（AMP）和美國病理學(xué)家學(xué)會的代表組成的工作組，重新審視和修訂了序列突變解釋的標準和準則。該組由臨床實驗室主任和臨床醫(yī)生組成。本報告代表ACMG，AMP和美國病理學(xué)家利益相關(guān)者

2、聯(lián)盟組成的工作組的專家意見。這些建議主要適用于臨床實驗室使用的遺傳檢測的范圍，包括基因分型，單基因，panel，外顯子和基因組。本報告建議使用具體的標準術(shù)語 - “致病性”，“可能致病性”，“不確定性意義”，“可能良性”和“良性”來描述在導(dǎo)致孟德爾病癥的基因中鑒定的突變。此外，該建議描述了基于使用典型類型的突變證據(jù)（例如，群體數(shù)據(jù)，計算數(shù)據(jù)，功能數(shù)據(jù)，分離數(shù)據(jù)）的標準將突變分類為這五個類別的過程。由于本報告中描述的臨床基因檢測的分析和解釋的復(fù)雜性增加，ACMG強烈建議臨床分子遺傳學(xué)檢測應(yīng)在經(jīng)過臨床實驗室改進修訂批準的實驗室進行，結(jié)果由相關(guān)職業(yè)認證的臨床分子遺傳學(xué)家或分子遺傳病理學(xué)家或同等學(xué)科專

3、家進行解釋。關(guān)鍵詞：ACMG實驗室指導(dǎo); 臨床遺傳檢測; 解釋；報告; 序列變異術(shù)語；突變報告前言臨床分子實驗室正在不斷增加檢測的新的序列突變，因為在檢測患者標本時不斷發(fā)現(xiàn)大量與基因疾病相關(guān)的基因。 雖然一些表型與單個基因相關(guān)，但許多與多個基因相關(guān)。 我們對任何給定序列突變的臨床意義的理解是循序漸進的，其范圍從那些幾乎肯定是疾病致病性突變到幾乎肯定是良性的突變。 雖然以前的美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會（ACMG）的建議提供了序列突變的解釋類別和解釋算法，但是這些建議沒有提供定義的術(shù)語或詳細的突變分類指南.1。本報告描述了關(guān)于序列變異分類的更新的標準和指南，由專家意見和經(jīng)驗數(shù)據(jù)確定的標準。方法在2

4、013年，由ACMG，分子病理學(xué)協(xié)會（AMP）和美國病理學(xué)家學(xué)會成員組成的工作組成立，代表臨床實驗室主任和臨床醫(yī)生，目的是制定使用標準術(shù)語的建議，以使用根據(jù)通過專家意見，工作組共識和社會投入制定的制度對現(xiàn)有證據(jù)加權(quán)。為了評估臨床實驗室的意見，調(diào)查發(fā)送到GeneT中列出的美國和加拿大的100多個測序?qū)嶒炇?，要求輸入術(shù)語偏好和評估變異分類的證據(jù)。實驗室檢測經(jīng)驗包括罕見疾病以及藥物基因組學(xué)和體細胞癌檢測。旨在評估術(shù)語偏好的第一項調(diào)查于2013年2月發(fā)布，結(jié)果在2013年ACMG年度會議的公開論壇上發(fā)布，其中包括75位與會者。調(diào)查對象在北美代表了超過45個實驗室。 調(diào)查結(jié)果和公開論壇表

5、明，（i）使用“致病性”，“可能致病性”，“不確定性意義”，“可能良性”和“良性”這五個術(shù)語系統(tǒng)是首選的，已經(jīng)在大多數(shù)實驗室使用，以及（ii）工作組的首次努力應(yīng)著重于孟德爾病和線粒體突變。在第一次調(diào)查中，實驗室也被要求提供突變評估方案，11個人分享了他們的方法。通過分析所有提交的協(xié)議，工作組制定了一套標準來加權(quán)突變證據(jù)和一套組合標準以達到五個分類層之一的規(guī)則。工作組成員使用已知類別的突變在其實驗室和/或更廣泛的范圍檢測了該方案數(shù)周。此外，對具有最常見類型證據(jù)的突變的典型示例進行了分類分配，以確保系統(tǒng)根據(jù)工作組成員當前應(yīng)用的方法對這些突變進行分類。第二次調(diào)查于2013年8月發(fā)送給那些相同的通過G

6、eneTests確認的實驗室，以及通過AMP的約2,000個成員，以及提出的分類方案和詳細的補充描述如何使用每個標準的實驗室。實驗室被要求使用該方案，并就每個標準的適用性和相對權(quán)重，分類系統(tǒng)的易用性以及是否在本國實驗室采用這種系統(tǒng)提供反饋。超過33個實驗室的回應(yīng)表明多數(shù)支持擬議的方法，反饋意見進一步指導(dǎo)了擬議標準和準則的制定。2013年11月，工作組在AMP會議上與50多名與會者舉行了研討會，介紹了修訂的分類標準和兩個潛在的評分系統(tǒng)。一個系統(tǒng)與這里提出的方法一致，另一個系統(tǒng)是一個點系統(tǒng)，其中每個標準給出了一些點，為病原標準指定積極點和良性標準的負點，從而對所以突變的分類進行了定義。通過觀眾回應(yīng)

7、系統(tǒng)，參與者被問及如何在評估突變證據(jù)時對每個標準（強，中等或支持或不使用）進行加權(quán)。同樣，這些答復(fù)也納入了這里介紹的分類系統(tǒng)。應(yīng)該指出的是，雖然大多數(shù)答復(fù)者都贊成一個積分制，但工作組認為，為每個標準指定具體要點意味著對目前不支持科學(xué)評估的每個標準的定量水平的理解，并沒有考慮到解釋遺傳證據(jù)的復(fù)雜性。工作組還對來自其他專業(yè)社會和工作組的建議進行了評估，其中已經(jīng)制定了乳腺癌，結(jié)腸癌和囊性纖維化中良好基因的變異分類指南，以及用于定量評估選擇性疾病變異的統(tǒng)計分析程序.2-5。雖然這些突變分析指南在特定環(huán)境中是有用的，但是很難將其提出的標準應(yīng)用于所有基因和不同的實驗室設(shè)置。本文中描述的突變分類方法適用于所

8、有孟德爾基因的突變，無論是通過單基因檢測，多基因定位，外顯子測序還是基因組測序鑒定。我們期望隨著技術(shù)和知識的改進，這種突變分類方法將會發(fā)展。我們還應(yīng)該注意，在特定疾病組中工作的那些人應(yīng)該繼續(xù)制定關(guān)于特定基因中突變分類的更集中的指導(dǎo)，因為賦予某些標準的適用性和重量可能因基因和疾病而異。一般考慮術(shù)語突變被定義為核苷酸序列的永久變化，而多態(tài)性定義為頻率高于1的突變。 然而，廣泛使用的術(shù)語“突變”和“多態(tài)性”通常分別導(dǎo)致由于不良假定的致病性和良性效應(yīng)而引起的混淆。 因此，建議將兩個術(shù)語用術(shù)語“突變”替換為以下修飾物：（i）致病性，（ii）可能的致病性，（iii）不確定的意義，（iv）可能良性或（v）良

9、性。 雖然這些修飾劑可能不涉及所有人類表型，但是它們包括與本指南中所述的與孟德爾病有關(guān)的突變的五級分類系統(tǒng)。 建議所有的致病的診斷（包括“可能致病”的報道）是相對于條件和遺傳模式（例如，c.1521_1523delctt（p.phe508del），致病性，囊性纖維化，常染色體隱性遺傳）。應(yīng)該指出的是，一些實驗室可能會選擇擁有額外的分類層級（例如，對具有不確定意義的突變進行分類，特別是內(nèi)部使用），這種做法不被認為與這些建議不一致。還應(yīng)該指出，這里推薦的術(shù)語與目前用于分類細胞遺傳學(xué)微陣列檢測的拷貝數(shù)變異的建議有所不同.6。推薦用于拷貝數(shù)突變的模式，同時包括五個層次，使用“不確定的臨床意義 - 可能

10、致病性“和”不確定的臨床意義 - 可能良性“。大多數(shù)工作組不支持使用“不確定的意義 “術(shù)語修改為”可能致病”或“可能是良性”，因為認為這里提出的標準將突變分類為“可能”類別包括比拷貝數(shù)突變指南中概述的更強的證據(jù)，并且組合這兩個類別將為接受臨床報告的衛(wèi)生保健提供者和個體造成混亂。然而，有人認為，使用術(shù)語“可能”應(yīng)該限于數(shù)據(jù)支持很可能是致病性或很有可能是良性的突變。雖然術(shù)語“可能”沒有定量定義，但在某些突變分類設(shè)置中已經(jīng)提出了指導(dǎo)。然而，在ACMG公開論壇期間對協(xié)會的調(diào)查顯示，“可能”一詞的用途范圍更廣泛。認認識到這一點，我們建議將“可能致病性”和“可能良性”這一術(shù)語用于表示大于一個突變的90的確

11、定性是致病的或良性的，為實驗室提供一個具有共同的，雖然是規(guī)定的定義，是疾病或良性的。同樣，國際癌癥研究機構(gòu)準則2支持95的致病性確定性，但工作組（通過ACMG公開論壇的反饋確認）認為，臨床醫(yī)生和患者愿意容忍稍高一些的錯誤機率到90的決定。還應(yīng)該指出，目前，大多數(shù)疾病具有異質(zhì)性，大多數(shù)突變沒有數(shù)據(jù)來支持對五個類別中的任何一個的突變確定性的定量分配。 希望隨著時間的推移，將會開發(fā)客觀地將變異的致病性信心的實驗和統(tǒng)計學(xué)方法開發(fā)出來，并且采用更加嚴格的方法來定義臨床協(xié)會在信心方面的期望，將更充分地說明術(shù)語和可能性。使用新術(shù)語可能需要協(xié)會的教育。鼓勵專業(yè)協(xié)會對所有實驗室和保健提供者進行教育，使用這些術(shù)語

12、，并鼓勵實驗室直接教育其對應(yīng)醫(yī)師。命名方法推薦通過一組標準化標準通知的統(tǒng)一命名法，以確保明確指定突變，并能夠有效共享和下游使用基因組信息。 標準基因變異命名法（）由人類基因組變異學(xué)會（HGVS）7維護和版本化，其使用被推薦作為確定變異命名法的主要準則，除非另有說明。6 實驗室應(yīng)注意檢測中使用的版本。 工具軟件可用于提供正確的HGVS術(shù)語，用于描述突變（）.8。臨床報告應(yīng)包括序列參考，以確保在DNA水平上對突變進行明確的命名，以及提供編碼蛋白質(zhì)命名法以協(xié)助功能性解釋（例如，“g.”，用于基因組序列，“c.”，用于編碼DNA序列，“p.”用于蛋白質(zhì)，“m.”用于線粒體）。應(yīng)使用ATG翻譯起始密碼子

13、的“A”作為位置號1來描述編碼術(shù)語。如果使用歷史替代命名法，則應(yīng)使用當前命名法以及歷史命名的附加符號。 參考序列應(yīng)該是完整的，并且來自國家生物技術(shù)信息中心RefSeq數(shù)據(jù)庫（/RefSeq/)9，其版本號或Locus參考基因組數(shù)據(jù)庫（http： / ）.10?；蚪M坐標或一個涵蓋整個基因的基因組參考序列(包括5'和3'未翻譯的區(qū)域和啟動子)應(yīng)該根據(jù)標準的基因組構(gòu)建來使用和定義(例如:hg19) 。在描述編碼突變時，應(yīng)在報告中使用并提供每個基因的參考文獻。轉(zhuǎn)錄應(yīng)代表最長的已知記錄和/或最臨床相關(guān)的記錄。學(xué)會支持的參考文獻通常可以

14、通過Locus Reference Genomic10， Consensus CDS數(shù)據(jù)庫，11人基因突變數(shù)據(jù)庫（http：/www.hgmd。），ClinVar（http：/www.ncbi。）或軌跡特異性數(shù)據(jù)庫查詢。 然而，實驗室應(yīng)該評估突變對所有臨床相關(guān)轉(zhuǎn)錄物的影響，包括在這些區(qū)域中已知的突變在臨床上可解釋時含有額外的外顯子或擴展的非翻譯區(qū)的替代轉(zhuǎn)錄物。并非所有類型的突變（例如，復(fù)雜突變）都被HGVS建議所涵蓋，但可能可以被已經(jīng)報告了復(fù)雜突變所描述.7,12。此外，該ACMG建議支持HGVS命名規(guī)則的三個具體例外：（i） 除了目前的HGVS“*”和“Ter”建議之外，“X”仍然被認為可以

15、用于報告無義突變。 （ii）建議根據(jù)用于指定突變的選定參考文獻編號外顯子; 和（iii）推薦使用術(shù)語“致病性”而不是“影響功能”，因為臨床解釋通常直接評估致病性。文獻資料庫的使用大量數(shù)據(jù)庫包含在人類基因組中不斷發(fā)現(xiàn)的越來越多的突變。 在分類和報告突變時，臨床實驗室可能會在數(shù)據(jù)庫以及已發(fā)表的文獻中找到有價值的信息。 如上所述，序列數(shù)據(jù)庫也可用于鑒定適當?shù)膮⒖夹蛄小?數(shù)據(jù)庫可用于收集信息，但應(yīng)謹慎使用。人類數(shù)據(jù)庫（表1）可用于獲取大群體變異頻率。 人類數(shù)據(jù)庫不能被認為僅包括健康個體和已知含有致病性突變。 這些數(shù)據(jù)庫不包含關(guān)于這些突變的功能效應(yīng)拓展性信息或任何可能的相關(guān)表型。 當使用人類數(shù)據(jù)庫時，必

16、須確定是使用健康隊列還是疾病隊列，如果可能，還應(yīng)確定最好包括家庭中的一個以上個體以及符合受試者的年齡范圍。疾病數(shù)據(jù)庫（表1）主要包含在患有疾病的患者中發(fā)現(xiàn)的突變并評估突變的致病性。 疾病和基因特異性數(shù)據(jù)庫通常包含錯誤分類的突變，包括在同行評議的文獻中發(fā)布的不正確的索賠，因為許多數(shù)據(jù)庫不執(zhí)行證據(jù)的初步審查。 當使用疾病數(shù)據(jù)庫時，重要的是考慮如何確定患者，如下所述。當使用數(shù)據(jù)庫時，臨床實驗室應(yīng)該（i）確定數(shù)據(jù)庫更新的頻率，數(shù)據(jù)策劃是否得到支持，以及使用什么方法進行策劃; （ii）確認使用HGVS命名并確定用于命名突變的基因組構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄物參考; （iii）確定數(shù)據(jù)的分析準確度（例如，低通次下一代測序

17、與Sanger驗證的突變）的程度，并評估提供用于評估數(shù)據(jù)準確度的任何質(zhì)量度量，這可能需要閱讀相關(guān)出版物; 和（iv）確定所列觀察的來源和獨立性。變異評估還包括搜索科學(xué)文獻和醫(yī)學(xué)文獻。 使用較舊的術(shù)語和分類或基于單次觀察的文獻應(yīng)謹慎使用。 當識別具有突變的個體和家庭以及相關(guān)表型時，重要的是考慮如何確定患者。 評估發(fā)表的數(shù)據(jù)時，這一點很重要，因為受影響的個人和相關(guān)個人經(jīng)常被報告多次，這取決于研究的背景和大小。 這可能是由于作者重疊，實驗室間合作，或者是不同臨床系統(tǒng)之間的先證者和家庭成員。 這可能會錯誤地導(dǎo)致受影響患者的重復(fù)計數(shù)和變異頻率的虛假增加。重疊的作者或機構(gòu)是重疊數(shù)據(jù)集的潛力的第一線索。臨床

18、實驗室應(yīng)實施內(nèi)部系統(tǒng)，以跟蹤每個基因中鑒定的所有序列變異和報告時的臨床診斷。 這對于跟蹤基因型 - 表型相關(guān)性和受影響和正常人群中變異體的頻率非常重要。 鼓勵臨床實驗室對諸如ClinVar等突變數(shù)據(jù)庫做出貢獻，包括用于變異分類的臨床斷言和證據(jù)，以幫助持續(xù)了解人類變異的影響。 只要有可能，應(yīng)根據(jù)“健康保險可移植性和責任法案”隱私規(guī)定提供臨床信息。鼓勵臨床實驗室與臨床醫(yī)生形成合作，提供臨床信息，以更好地了解基因型如何影響臨床表型，并解決實驗室之間變異解釋的差異。 由于輔助臨床實驗室實踐的巨大潛力，正在努力擴大和標準化臨床突變數(shù)據(jù)庫。 標準化將更容易獲得更新的信息，并便于臨床實驗室提交。 例如，Cl

19、inVar數(shù)據(jù)庫允許通過臨床觀察和診斷來確定突變位點，并且跟蹤檢查狀態(tài)，以使對策略質(zhì)量水平的透明度更高。計算（計算機）預(yù)測程序公開和商業(yè)上可用的各種計算機工具可以幫助解釋序列突變。 每個工具使用的算法可能不同，但可以包括確定序列突變在核苷酸和氨基酸水平的影響，包括檢測突變對初級和替代基因轉(zhuǎn)錄物，其他基因組元件的影響，以及 、該突變對蛋白質(zhì)的潛在影響。 這些工具主要的兩個類別包括那些預(yù)測錯誤變化是否損害所得蛋白質(zhì)功能或結(jié)構(gòu)的工具，以及預(yù)測是否對剪接有影響的工具（表2）。 更新的工具開始解決額外的非編碼序列。13錯誤變化的影響取決于諸如氨基酸或核苷酸進化的保守性，蛋白質(zhì)序列內(nèi)的位置和上下游以及氨基

20、酸取代的生物化學(xué)結(jié)果等標準。這些標準中的一個或組合的測量用于評估錯誤改變的預(yù)測影響的各種計算機算法。有幾項努力評估了可用的預(yù)測軟件的性能，以便將它們相互比較，并評估其預(yù)測“已知”致病突變的能力.14-17。一般來說，大多數(shù)誤差變異預(yù)測算法的準確度為65-80檢查已知的疾病突變。16大多數(shù)工具往往具有較低的特異性，導(dǎo)致錯誤更改過早預(yù)測有害，并且在預(yù)測具有較高效果的錯誤突變方面不可靠.18臨床實驗室中更常用于錯誤突變解釋的計算機工具包括PolyPhen2，19 SIFT，20和MutationTaster.21表2中可以找到用于預(yù)測錯誤突變的計算機工具列表。已經(jīng)開發(fā)了多個軟件程序來預(yù)測剪接，因為它

21、與在外顯子或內(nèi)含子水平上的剪接位點的產(chǎn)生或喪失有關(guān).22一般來說，剪接位點預(yù)測工具相對于特異性（90-100）具有更高的靈敏度 60-80）預(yù)測剪接位點異常.23,24通常用于剪接位點突變解釋的一些計算機工具列在表2中。雖然許多不同的軟件程序使用不同的算法進行預(yù)測，但它們的基礎(chǔ)有相似之處; 因此，從不同的計算機工具組合的預(yù)測被認為是序列解釋中的單一證據(jù)，而不是獨立的證據(jù)。 還推薦使用多個軟件程序進行序列突變解釋，因為不同的程序每個都有自己的優(yōu)點和缺點，這取決于算法; 在許多情況下，性能可以由基因和蛋白質(zhì)序列變化決定。 然而，這些只是預(yù)測，并且應(yīng)該仔細地實施它們在序列突變解釋中的使用。 不建議將

22、這些預(yù)測用作作為臨床斷言的唯一證據(jù)來源。對序列變異的解釋標準用于評估突變證據(jù)的方法旨在解釋在臨床診斷實驗室環(huán)境中疑似遺傳（主要是孟德爾）病癥的患者中觀察到的突變。 它不是用于解釋體細胞變異，藥物基因組（PGx）突變或與多基因非孟德爾復(fù)合障礙相關(guān)基因的突變。 在外來組織或基因組研究的背景下，將這些規(guī)則應(yīng)用于候選基因（“不確定的基因”（GUS）時，必須注意，因為本指南并不旨在滿足研究界在確定疾病中的新基因的需要。雖然這些方法可用于評估健康個體中發(fā)現(xiàn)的突變或繼發(fā)性檢測指征，但如指南中的幾個部分所述，必須進一步注意，因為與指示無關(guān)的大多數(shù)突變是致病性的。雖然我們期望，一般來說，這些指南將適用于突變分類

23、，無論通過單個基因，基因組，外顯子，基因組或轉(zhuǎn)錄組的分析來確定突變，重要的是考慮牽連變異體之間的差異作為可能被預(yù)測為其編碼但不一定涉及疾病的蛋白質(zhì)具有破壞性/破壞性的疾病和突變的致病性（即致病性）。這些規(guī)則旨在確定在孟德爾病癥中具有確定作用的基因中的突變是否可能是該病癥的致病性。致病性檢測應(yīng)獨立于在給定患者中解釋疾病的原因。例如，一個突變不應(yīng)該在一種情況下報告為致病性，而不是在另一種情況下報告為致病性，僅因為該突變在某種情況下不被認為解釋疾病。致病性應(yīng)由整個證據(jù)的整體確定，包括所有研究的病例，得出一個結(jié)論。這種分類方法可能比實驗室迄今應(yīng)用的要嚴格得多。 它們可能導(dǎo)致較大比例的突變被歸類為不確定

24、的意義。 希望這種方法將減少大量的變異報告為疾病的“病因”，因為沒有足夠的支持證據(jù)證明該分類。 重要的是要記住，當臨床實驗室將突變報告為致病性時，醫(yī)生很可能將其視為“可行動的”，并改變對患者的治療或監(jiān)視25或者去除對該基因陰性的家庭成員的管理，基于這一決定（見下面的衛(wèi)生保健提供者如何使用這些指南和建議）。我們提供了兩套標準：一種用于分類致病性或可能的致病性突變（表3），一種用于良性或可能良性突變的分類（表4）。每個致病標準被稱為非常強（PVS1），強（PS1-4）;中度（PM1-6）或支持（PP1-5），并且每個良性標準被加權(quán)為獨立（BA1），強（BS1-4）或支持（BP1-6）。每個類別中的

25、編號不表示任何重量差異，只是標記為幫助參考不同的標準。對于給定的突變，用戶根據(jù)對突變觀察到的證據(jù)來選擇標準。然后根據(jù)表5中的評分規(guī)則組合標準，從五層系統(tǒng)中選擇分類。這些規(guī)則適用于所有可用的突變數(shù)據(jù)，無論是從當前被調(diào)查案件收集，還是從以前公布的數(shù)據(jù)中獲悉。還可以通過公共資源（例如，ClinVar或基因座特定數(shù)據(jù)庫）和實驗室自己的數(shù)據(jù)庫獲得未發(fā)布的病例數(shù)據(jù)。為了提供突變分類的標準的靈活性，根據(jù)所收集的證據(jù)，可以使用專業(yè)判斷將一種重量的標準移動到另一種重量。例如，如果一個反式突變（在反式染色體上）的檢測值是在其他致病性突變檢測突變的數(shù)倍（參見PM3 BP2順式/反式檢驗進一步指導(dǎo)），則PM3可以升級

26、為強。相比之下，在數(shù)據(jù)不如所述的那么強的情況下，可以使用判斷來將證據(jù)視為履行較低級別（例如參見PS4，表3中的注2）。如果一個突變不符合使用這些組（致病性或良性）的標準，或者良性和致病性的證據(jù)是相互沖突的，那么突變默認為不確定的意義。按類型和實力組織的標準如圖1所示。請注意，在評估全部證據(jù)以解釋突變證據(jù)強度的差異時，必須采用專家判斷。提供以下內(nèi)容以更徹底地解釋突變分類標準中注明的某些概念（表3和4），并提供其使用中的示例和/或注意事項或陷阱。本節(jié)應(yīng)與表3和表4相一致。PVS1無義突變通?？梢约僭O(shè)某些類型的突變（例如，廢話，移位，正常的±1或2個剪接位點，起始密碼子，單個外顯子或多重缺

27、失突變）通過缺少轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致完全不存在基因產(chǎn)物來破壞基因功能或無義介導(dǎo)的衰變導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物的改變。 但是，通過考慮以下原則，將這些突變分類為致病性時，請謹慎行事：（i） 當將這些突變分類為致病性時，必須確保無效突變是已知的致病性機制，與確定的疾病遺傳模式一致。 例如，存在僅雜合錯義突變導(dǎo)致疾病的基因，而無義突變在雜合狀態(tài)中是良性的（例如，許多增生性心肌病基因）。 僅基于該證據(jù)，MYH7基因中的新型雜合無義突變將不被認為是主要肥厚性心肌病的致病性，而CFTR基因中的新型雜合無義突變可能被認為是隱性致病突變。（ii） 患者具有與中祖輩相一致的疾病（例如，未受影響顯性遺傳病的父母）。 然而，由于種系嵌合，

28、有可能影響其他兄弟姐妹。（iii） 患者的表型與合理的特異性匹配基因的疾病關(guān)聯(lián)。 例如，對于具有獨特面部特征，多毛癥和上肢缺陷（即Cornelia de Lange綜合征）的NIPBL基因中具有隔代遺傳的患者，這一觀點是強的，而在具有非特異性特征如發(fā)育遲緩的兒童中通過外顯子測序發(fā)現(xiàn)的突變，隔代遺傳則較弱。 PS3 BS3功能研究功能研究可以成為支持致病性的有力工具; 然而，并非所有功能研究都可以有效預(yù)測基因或蛋白質(zhì)功能的影響。 例如，某些酶檢測提供了確定的方法來評估錯義突變對代謝途徑（例如-半乳糖苷酶功能）中酶功能的影響。 另一方面，一些功能測定可能不太一致地預(yù)測突變對蛋白質(zhì)功能的影響。 為了

29、評估功能測定的有效性，人們必須考慮功能測定反映生物環(huán)境的程度。 例如，從患者或動物模型的活檢組織直接測定酶功能提供比在體外表達蛋白質(zhì)更強的證據(jù)。同樣地，如果測定反映了蛋白質(zhì)的完整生物學(xué)功能（例如，酶的底物分解）與僅具有一個功能組分（例如具有附加結(jié)合特性的蛋白質(zhì)的三磷酸腺苷水解）相比，證據(jù)力度更強。評估測定的分析性能和考慮樣品完整性的驗證，重現(xiàn)性和穩(wěn)健性數(shù)據(jù)可能受到采集方法和時間以及儲存和運輸?shù)挠绊?，是重要的考慮因素。在臨床實驗室改進修訂實驗室開發(fā)的測試或市售試劑盒中的測定中，這些因素得到緩解。評估突變在信使RNA水平的影響的測定在評估突變在剪接點和編碼序列和非翻譯區(qū)以及更深的內(nèi)含子區(qū)域（例如，

30、信使RNA穩(wěn)定性，加工或翻譯）中的影響時可以是高度信息的）。技術(shù)方法包括RNA和/或互補DNA衍生物的直接分析和體外小基因剪接測定。PS4 PM2 BA1 BS1 BS2突變頻率和使用控制人群評估對照或一般群體中突變的頻率對于評估其潛在的致病性是有用的。 這可以通過搜索公開的人口數(shù)據(jù)庫（例如，1000個基因組計劃，國家心臟，肺和血液研究所外顯子測序項目外顯子突變服務(wù)器，外顯子聚合聯(lián)盟;表1），以及使用經(jīng)常在文獻中出現(xiàn)的競爭匹配的對照數(shù)據(jù)。外顯子測序項目數(shù)據(jù)庫對白種人和非裔美國人群有用，并具有覆蓋數(shù)據(jù)以確定突變是否不存在。 盡管1000種基因組計劃數(shù)據(jù)不能用于評估突變的缺失，但是它具有不同種族群

31、體的更廣泛的代表性。 外顯子聚集聯(lián)盟最近發(fā)布了來自不同人群的60000個外顯子等位基因頻率數(shù)據(jù)，包括大約三分之二的外顯子測序項目數(shù)據(jù)。一般而言，控制群體的等位基因頻率大于疾病預(yù)期（表6），被認為是對罕見孟德爾病癥（BS1）的良性解釋的強大支持，或者如果超過5，則被認為是立場獨立支持（BA1）。此外，如果正在研究的疾病在早期完全滲透，并且在隱性（純合），顯性（雜合）或X連鎖（半合子）病癥的良好記錄的健康成年個體中觀察到突變，則被認為是良性解釋的有力證據(jù)（BS2）。如果該突變不存在，則應(yīng)確認數(shù)據(jù)庫中的讀取深度足以在突變站點進行準確的調(diào)用。如果一個突變不存在（或低于預(yù)期的載體頻率，如果是隱性的）大的

32、普通人群或?qū)φ贞犃校?gt; 1,000個人），并且群體與攜帶識別的突變的患者進行種族匹配，則可以考慮該觀察一個適度的致病性證據(jù)（PM2）。然而，許多良性突變是“私人的”（個人或家庭獨有的），因此不符合種族匹配的人群不被認為是足夠的，甚至是致病性的強有力證據(jù)。當群體表型良好，頻率差異較大，孟德爾病發(fā)病早期發(fā)病時，使用人口數(shù)據(jù)進行病例對照比較是非常有用的。 轉(zhuǎn)診到臨床實驗室進行測試的患者很可能包括被 “排除”為該疾病的個體，因此他們可能是不符合表型的病例。 當使用普通人群作為對照組時，患有亞臨床疾病的個體總是存在的。 然而，在這兩種情況下，病例對照比較在檢測差異方面的功能不足; 因此，如上所述，

33、仍然可以假設(shè)顯示出統(tǒng)計學(xué)上顯著的差異來為致病性提供支持性證據(jù)。 相比之下，缺乏統(tǒng)計學(xué)差異，尤其是極度稀有的變異和較少的滲透性表型，應(yīng)該謹慎解釋。優(yōu)勢比（OR）或相對風險是基因型（即突變存在于基因組中）和表型（即受疾病/結(jié)果影響）之間關(guān)聯(lián)的量度，可用于孟德爾疾病或復(fù)合物表征。在本指南中，我們只討論其在孟德爾病中的用途。雖然相對風險與OR不同，但相對風險漸漸地接近OR的小概率。 OR為1.0意味著該突變不影響患有疾病的可能性，值高于1.0表示變異與疾病風險之間存在關(guān)聯(lián)，而低于1.0的值意味著突變與疾病風險一般來說，具有適度孟德爾效應(yīng)大小的突變將具有3或更大的OR，而高度滲透突變將具有非常高的OR；

34、例如，與E3 / E3純合子相比，APOE E4 / E4純合子的OR為13（https：/ / home / education-outreach / past-summer-interns / 2012- summer-interns / erika- kollitz.aspx.VOSi3C7G_vY）。然而，OR的置信區(qū)間（CI）與關(guān)聯(lián)本身的度量一樣重要。 如果CI包括1.0（例如，OR = 2.5，），則關(guān)聯(lián)的斷言幾乎沒有信心。在上述APOE示例中，CI為10-16。 互聯(lián)網(wǎng)上提供非常簡單的OR計算器（例如和 PM1突變熱點和/或關(guān)鍵與完善的功能域已知某些蛋白質(zhì)

35、結(jié)構(gòu)域?qū)τ诘鞍踪|(zhì)功能是至關(guān)重要的，并且迄今為止鑒定的這些結(jié)構(gòu)域中的所有錯義突變已被證明是致病性的。 這些領(lǐng)域也一定缺乏良性變異。 此外，報道了在不太好表征的基因區(qū)域中的突變熱點，在該區(qū)域中一個或幾個附近殘留物中的致病突變可以更大的頻率觀察到。 而這可以被認為是致病性的中度證據(jù)。PM3 BP2順/反試驗檢測親本樣品以確定突變是否發(fā)生在順式（基因的相同拷貝）或反式（基因的不同拷貝）中）對于評估致病性是重要的。 例如，當在隱性病癥的基因中鑒定了兩種雜合突變時，如果已知一種突變是致病性的，則確定另一種突變是反式的，可以被認為是后一種突變（PM3）的致病性的適度證據(jù)。 此外，如果該反式變異體其他致病性變

36、異有多個觀察結(jié)果，則此證據(jù)可以升級至強。 然而，如果突變在普通人群中存在，則需要統(tǒng)計學(xué)方法來控制隨機共生。 相比之下，找到順式的第二個突變將支持盡管不是確定性的證據(jù)是良性作用（BP2）。 在隱性基因中鑒定有不確定致病性的兩種雜合變異的情況下，突變的順式與反式性質(zhì)的確定不一定提供關(guān)于任一突變的致病性的附加信息。 然而，如果突變以順式發(fā)現(xiàn)，則基因的兩個等位基因都受到影響的可能性降低。  在顯性疾病的背景下，反式突變被檢測為致病性突變可以被認為是支持良性影響的證據(jù)（BP2），或者在某些發(fā)達的疾病模型中，甚至可以被認為是獨立的證據(jù)，如已經(jīng)被驗證可用于評估CFTR突變3。由于框內(nèi)缺失/插入和停

37、止損失導(dǎo)致PM4 BP3蛋白長度變化通過將終止密碼子改變?yōu)榘被崦艽a子（例如止血藥物突變），一個或多個氨基酸的缺失或插入以及蛋白質(zhì)的延伸更可能與單獨的錯誤改變相比破壞蛋白質(zhì)功能， 蛋白質(zhì)長度變化的結(jié)果。 因此，框內(nèi)缺失/插入和停止損失被認為是致病性的適度證據(jù)。 刪除，插入或延伸越大，缺失區(qū)域中氨基酸越保守，支持致病性的證據(jù)就越大。 相比之下，在重復(fù)區(qū)域或進化中不夠保守的區(qū)域的小框內(nèi)缺失/插入不太可能是致病的。PM5在同一個位置新發(fā)的錯義突變發(fā)生在與另一致病性錯義變化相同位置（例如，Trp38Ser和Trp38Leu）的新型錯義氨基酸變化被認為是適度的證據(jù)，但不能被認為是致病性的。 如果與確定的

38、致病性錯義突變相比，新穎的變化更保守，這是特別真實的。 此外，不同的氨基酸變化可導(dǎo)致不同的表型。 例如，F(xiàn)GFR3基因的Lys650殘基的不同取代與廣泛的臨床表型相關(guān)：p.Lys650Gln或p.Lys650Asn引起輕度軟骨發(fā)育不全; p.Lys650Met導(dǎo)致發(fā)育遲緩和黑棘皮病嚴重軟骨發(fā)育不全; 異位發(fā)育不良2型，致死性骨骼發(fā)育異常，來自p.Lys650Glu。PP1 BS4分離分析在家族中使用突變分離時，必須注意其作為致病性的證據(jù)。事實上，家族中具有表型的特定突變的分離是證實基因座與病癥的連鎖，而不是突變本身的致病性的證據(jù)。已經(jīng)公布的一種統(tǒng)計學(xué)方法29,30，其中指出，鑒定的突變可能與該

39、家族中真實致病突變的連鎖不平衡。統(tǒng)計學(xué)建?？紤]到與年齡有關(guān)的外顯率和感染率，采用先進的方法也將計算機預(yù)測與已知致病性變異共同出現(xiàn)為單一的定量測定的致病性.31。遠親很重要，應(yīng)該被考慮在內(nèi)，因為它們的比核心家族中的成員發(fā)生疾病和突變的可能性小。全基因測序（包括整個內(nèi)含子和5'和3'非翻譯區(qū)）可能提供更多的證據(jù)表明另一個突變不涉及或鑒定可能導(dǎo)致其他突變。除非仔細評估遺傳基因座，否則有可能將非致病性突變分類為致病性。 當靶基因中的特定變異與多種受影響的家族成員和來自不同種族背景的多個家族中的表型或疾病分離時，連鎖不平衡和確定偏倚不太可能混淆致病性的證據(jù)。 在這種情況下，這個標準可以視

40、為適度或強有力的證據(jù)，這取決于隔離的程度，而不是支持證據(jù)。另一方面，缺乏具有表型的突變的分離提供了強烈的抗致病性的證據(jù)。 需要仔細的臨床評估來排除所報告的未受影響個體的輕度癥狀，以及可能的遺傳因素（由于非致病性或不同遺傳原因引起的疾病的受影響個體）。 此外，需要確定生物家庭關(guān)系，以排除收養(yǎng)，非親子，精子和卵子捐贈以及其他非生物關(guān)系。 還必須考慮減少和年齡依賴性外顯率，以確保無癥狀的家族成員真正不受影響。在臨床實驗室設(shè)置中，分離的統(tǒng)計學(xué)評估可能是困難的。 如果有適當?shù)募彝?，鼓勵臨床實驗室與統(tǒng)計學(xué)或群體遺傳學(xué)專家合作，以確保適當?shù)慕?，并避免該突變與疾病的相關(guān)性的不正確結(jié)論。PP2 BP1變異譜許

41、多基因具有明確的病原性和良性變異譜。 對于其中錯義變異是疾病常見病因的基因，并且基因的非常少的良性變異，新的錯義突變可以被認為是支持致病性的證據(jù)（PP2）。 相比之下，對于截短突變是唯一已知的變異致病機制，錯義突變可以被認為是支持良性影響的證據(jù)（BP1）。 例如，ASPM中的截短突變是該基因中的致病突變的主要類型，其引起常染色體隱性原發(fā)性小頭癥，并且該基因具有高的錯義多態(tài)性變異率。 因此，ASPM中的錯誤突變可以被認為具有這種支持性證據(jù)的一個良性影響。PP3 BP4計算（硅片）數(shù)據(jù)沒有高估計算的證據(jù)是重要的，特別是考慮到不同的算法可能依賴于相同（或類似的）數(shù)據(jù)來支持預(yù)測，并且大多數(shù)算法還沒有被

42、證實是針對已經(jīng)確定的致病突變。 此外，算法可以對不同的基因具有非常不同的預(yù)測能力。 如果測試中的所有計算機程序符合預(yù)測，那么這個證據(jù)可以算作支持。 然而，如果在電腦預(yù)測中不通過，則不應(yīng)將此證據(jù)用于分類突變。 這種突變導(dǎo)致氨基酸變化存在于多個非人類哺乳動物物種中的保守的區(qū)域，表明氨基酸變化不會損害功能，可以被認為是良性解釋的強有力證據(jù)。 然而，如果該基因最近在人體中發(fā)生突變（例如涉及免疫功能的基因），則必須謹慎地評估對非保守區(qū)域有良好的影響的假設(shè)。PP4使用表型來支持突變的聲明、一般來說，患者具有與基因的已知臨床特征譜相匹配的表型的事實不被認為是致病性的證據(jù)，因為幾乎所有接受疾病靶向測試的患者都

43、具有所述的表型。 然而，如果滿足以下標準，患者的表型可以被認為是支持證據(jù)：（i）臨床檢測的敏感性高，大多數(shù)患者在該基因中檢測出致病性突變陽性; （ii）患者具有明確的綜合征，與其他臨床表現(xiàn)幾乎沒有重疊（例如，Gorlin綜合征，包括基底細胞癌，掌跖凹陷，牙源性角化囊腫）; （iii）基因不受實質(zhì)性良性變異的影響，可以通過大量普通人群進行確定（例如，Exome測序項目）。 和（iv）家族史與疾病遺傳模式一致。PP5 BP6信譽來源越來越多的例子來自信譽良好的來源（例如，在疾病領(lǐng)域具有長期專業(yè)知識的臨床實驗室）的致病性分類已經(jīng)在數(shù)據(jù)庫中共享，但沒有提供形成分類基礎(chǔ)的證據(jù)，可能不容易獲得。 在這種情

44、況下，如果最近提交的分類可以用作單一證據(jù)。 然而，鼓勵實驗室分享分類基礎(chǔ)，并與提交者溝通，以使基礎(chǔ)證據(jù)得到評估和建立。 如果證據(jù)可用，則不應(yīng)使用該標準; 相反與證據(jù)相關(guān)的標準則可以使用。BP5位置改變的觀察當在具有明確的候選遺傳病因的情況下觀察到突變時，通常認為這是支持將該突變分類為良性的證據(jù)。 但是，也有例外。 個體可以是隱性疾病的不相關(guān)致病突變的載體; 因此，與隱性病癥的基因相比，這種證據(jù)對于顯性疾病的基因中可能的良性變異分類的支持更強。 此外，存在多種突變可導(dǎo)致更嚴重疾病的疾病。 例如，兩種突變，一種致病和一種新型，在患有顯性疾病嚴重表現(xiàn)的患者中被鑒定出來。而他父母中也與一人有輕度疾病。

45、 在這種情況下，必須考慮新型突變也可能是致病性并有助于先證者疾病嚴重程度增加的可能性。 在這種臨床情況下，觀察作為第二突變的新突變將不支持新型突變的良性分類（盡管它也不被認為是支持病原性分類而沒有進一步證據(jù)）。 最后，存在已知發(fā)生多基因遺傳的某些疾病，例如Bardet-Beidel綜合征，在這種情況下，第二個基因座中的另外的變異體也可能是致病性的，但應(yīng)謹慎地報告。BP7同義突變越來越多的認識到，剪接缺陷超過剪接共有序列的破壞，可能是致病性的重要機制，特別是對功能喪失是疾病的常見機制的基因。因此，假設(shè)同義核苷酸變化將不起作用，應(yīng)該謹慎。然而，如果核苷酸位置在進化過程中不保守，并且剪接評估算法既不

46、預(yù)測對剪接共有序列的影響也不預(yù)測新的替代剪接共有序列的產(chǎn)生，則拼接影響不太可能。因此，如果支持計算證據(jù)（BP4），則可以將新穎的同義突變分類為可能是良性的。然而，如果計算證據(jù)表明對剪接有可能的影響，或引起懷疑的影響（例如，該突變與隱性疾病的基因中的已知致病變異體發(fā)生反應(yīng)），則該突變應(yīng)被分類為不確定的意義直到功能評估可以提供更明確的影響評估或提供其他證據(jù)來排除致病作用。報告的突變序列撰寫簡明扼要但內(nèi)容豐富的臨床報告可能是一個挑戰(zhàn)，因為內(nèi)容的復(fù)雜性從單基因報告突變到多基因組到外顯子和基因組。已經(jīng)制定了幾個指導(dǎo)性文件，用于報告，包括ACMG下一代測序指導(dǎo)的臨床實驗室標準的完整樣本報告.32-35。臨

47、床報告是實驗室檢測的最終產(chǎn)品，經(jīng)常被納入患者的電子健康記錄。因此，有效的報告簡潔易懂。報告應(yīng)用清晰的語言編寫，避免使用醫(yī)學(xué)遺傳術(shù)語或定義這些術(shù)語。該報告應(yīng)包含測試執(zhí)行的所有基本要素，包括結(jié)構(gòu)化結(jié)果，解釋，參考，方法和適當?shù)拿庳熉暶?。報告的這些基本要素也被臨床實驗室改進修訂法規(guī)和美國病理學(xué)家學(xué)院下一代測序臨床試驗的實驗室標準強調(diào)。36結(jié)果結(jié)果部分應(yīng)列出使用HGVS命名的突變（參見命名法）。鑒于在基因檢測中發(fā)現(xiàn)的突變數(shù)量不斷增加，以表格形式呈現(xiàn)基本組分的突變可以最好地傳達信息。這些組分包括核苷酸（基因組和互補DNA）和蛋白質(zhì)水平，基因名稱，疾病，遺傳，外顯子，接合度和突變分類兩者的命名。補充附錄S

48、1在線提供了報告突變結(jié)構(gòu)要素的表格示例。如果已知母親來源也可能包括在內(nèi)。此外，如果在基因分型測試中分析了特異性突變，實驗室應(yīng)特別注意詢問的突變，如果存在，它們具有完整的描述和歷史命名。此外，當報告來自外來組織或基因組測序的結(jié)果或偶爾非常大的疾病靶向小組時，將突變分組成類別，例如“具有與報告的表型的建立的關(guān)聯(lián)的疾病基因中的突變”，“具有可能的結(jié)合的疾病基因中的突變與“報告的表型”和（如適用）“偶然（次要）調(diào)查結(jié)果”可能是有益的。解釋解釋應(yīng)包含支持變異分類的證據(jù)，包括其對所得蛋白質(zhì)的預(yù)測影響，以及所鑒定的任何突變是否可能完全或部分地解釋患者的測試指標。 該報告還應(yīng)向臨床醫(yī)生提供有關(guān)補充臨床測試的任

49、何建議，例如患者細胞的酶促功能測試和家族成員的突變測試，以進一步通知變異解釋。 解釋部分應(yīng)涉及結(jié)果部分中描述的所有突變，但可能包含其他信息。 應(yīng)該注意的是，以前是否在文獻或疾病或控制數(shù)據(jù)庫中報告了該突變。 引用有助于分類的參考文獻應(yīng)在報告結(jié)尾處討論和列出。解釋部分中描述的附加信息可能包括計算機分析和進化保護分析結(jié)果的總結(jié)。 然而，可能由于醫(yī)生不熟悉預(yù)測算法限制造成誤解，因此應(yīng)該避免人為的計算預(yù)測（例如分數(shù)，諸如“損害性”這樣的術(shù)語）（參見上面的Silico Predictive Programs）。 最后報告中應(yīng)列入有關(guān)疾病的外顯率和可變表達能力的討論，如果有關(guān)的話。 如何在臨床報告中描述變異

50、分類的證據(jù)的示例見附錄附錄S1在線。方法報告中應(yīng)提供通過實驗進行突變檢測的方法和類型，以及那些難以檢測的突變。還應(yīng)報告提及用于檢測突變的方法的限制。方法應(yīng)包括用于獲得核酸（例如，聚合酶鏈式反應(yīng)，捕獲，全基因組擴增）的那些以及分析核酸的那些（例如，雙向Sanger測序，下一代測序，染色體微陣列，基因分型技術(shù)）因為這可能會為保健提供者提供必要的信息，以決定是否需要額外的測試來跟蹤結(jié)果。方法部分還應(yīng)提供人類基因組組織基因命名委員會批準的官方基因名稱，轉(zhuǎn)錄本的RefSeq登錄號和基因組構(gòu)建，包括版本。對于大型面板，基因級信息可能會被URL發(fā)布和引用。實驗室可以選擇添加免責聲明，解決實驗室測試中的一般缺

51、陷，如樣品質(zhì)量和樣品混合。獲得患者權(quán)益保護組織同意，臨床試驗和研究雖然不建議通過實驗室報告給患者提供具體的臨床指導(dǎo)，但為結(jié)果類別（例如所有陽性）提供一般信息是適當且有幫助的。 現(xiàn)在有大量的病人權(quán)益組織和臨床試驗可用于支持和治療許多疾病。 實驗室可以選擇將該信息添加到報告的正文或附加信息，以便將其發(fā)送給衛(wèi)生保健提供者，以及當突變的效果被歸類為“不確定”時，報告實驗室可能會努力將保健提供者連接到研究具體疾病的研究小組，只要符合健康保險便攜性和責任法案，患者隱私權(quán)要求得到遵守。突變再分析隨著突變的證據(jù)發(fā)展，以前的分類可能需要修改。例如，大量人群中變異頻率數(shù)據(jù)的可用性導(dǎo)致許多不確定的重要變異被重新分類

52、為良性，并且檢測其他家庭成員可能導(dǎo)致突變的重新分類。隨著測序檢測的內(nèi)容擴大，識別的變異數(shù)量增加，從外顯子和基因組測序擴展到成千上萬的突變，實驗室更新報告為變異型知識變化的能力將無法維持，因為沒有適當?shù)臋C制和資源來維持更新。為了對衛(wèi)生保健提供者和患者設(shè)定適當?shù)钠谕瑢嶒炇覒?yīng)對遺傳檢測數(shù)據(jù)的再分析提供明確的政策，以及是否可能需要進行再分析的附加費用。鼓勵實驗室探索創(chuàng)新方法，使患者和提供者更有效地獲取更新的信息。37,38對于包含與主要指征相關(guān)基因不確定意義的突變的報告，以及在沒有實驗室主動提供的更新的情況下，建議實驗室建議衛(wèi)生保健提供者定期查詢是否知道任何突變具有不確定性的意義，包括報告為可能致病

53、的突變，是否已經(jīng)發(fā)生變化。 相反，鼓勵實驗室考慮對病例進行主動修正，當報告有近似分類（病原性或良性）的突變必須重新分類時。 關(guān)于醫(yī)師的責任，請參閱ACMG指導(dǎo)方針，重新開展責任。39結(jié)果確認關(guān)于報告的突變結(jié)果的確認建議在其他地方被進行.35,36。除了所指出的，對于被認為是孟德爾病癥的致病性或可能致病性的所有序列突變，推薦使用正交方法的確認研究。 這些方法可以包括但不限于樣品的再次提取和檢測，親本的檢測，限制酶消化，第二次對感興趣的區(qū)域進行測序，或使用替代的基因分型技術(shù)。特別考慮根據(jù)測試指標對GUS中的突變進行評估和報告基因組和外顯子測序正在鑒定新的基因型 - 表型聯(lián)系。當實驗室發(fā)現(xiàn)基因中的突

54、變沒有與患者表型的有效關(guān)聯(lián)時，它被定義為GUS。當基因從未與任何患者表型相關(guān)聯(lián)或當基因與正在考慮的基因已經(jīng)與不同表型相關(guān)聯(lián)時，可能發(fā)生這種情況。將建議的指導(dǎo)原則應(yīng)用于GUS時，必須格外小心。在這種情況下，利用針對公認的基因型 - 表型關(guān)聯(lián)開發(fā)的突變分類規(guī)則是不合適的。例如，當跨越外顯子或基因組時，從頭觀察不再是致病性的強有力證據(jù)，因為預(yù)期所有個體在其外顯子中具有大約一個從頭突變或在其基因組中具有約100個突變。同樣，跨基因組的成千上萬個變異體可以以有效的對數(shù)（LOD）得分分離。此外，可以檢測到對基因或其所得蛋白明確破壞的許多有害突變（無義，移碼，標準±1,2剪接位點，外顯子缺失）;然

55、而，這在任何給定的疾病表現(xiàn)中沒有足夠的證據(jù)證明其起因作用。GUS中發(fā)現(xiàn)的突變可能被認為是候選物，并被報告為“不確定因素基因中的突變”。如果被報告，這些突變應(yīng)該總是被歸類為不確定的意義。 在基因本身的任何突變可被認為是該疾病的致病原因之前，需要額外的證據(jù)來支持該基因與疾病的關(guān)聯(lián)。例如，在相同基因中具有匹配的罕見表型和有害突變的其他病例將使單個突變能夠，可根據(jù)本文提出的建議進行分類。評估個體健康的突變或偶然性發(fā)現(xiàn)在使用這些指南來評估健康或無癥狀個體的突變或解釋與主要指標無關(guān)的偶然發(fā)現(xiàn)時，必須謹慎行事。 在這些情況下，任何鑒定的突變是致病性的可能性可能遠遠低于進行疾病靶向檢測時的可能性。 因此，稱為

56、變異致病性的必要證據(jù)應(yīng)更高，并應(yīng)特別小心。 此外，在沒有表型或家族史的情況下發(fā)現(xiàn)的病原性變異體的預(yù)測外顯率可能遠低于根據(jù)確定為具有疾病的患者的歷史數(shù)據(jù)預(yù)測的外顯率。線粒體突變除了成熟的致病性突變以外的線粒體突變的解釋是復(fù)雜的，并且仍然具有挑戰(zhàn)性; 這里有幾個特殊的考慮。線粒體基因命名與細胞核基因的命名不同，應(yīng)使用m.編號（例如，m.8993T> C）和p.編號，而不是標準c.編號（參見命名法）。 目前接受的參考序列是人線粒體DNA的修訂劍橋參考序列：GenBank序列NC_012920gi：251831106。40，41應(yīng)報告異質(zhì)性或同源性，以及該突變的異質(zhì)性估計值，如果確定異質(zhì)性水平的

57、檢測已被驗證。不同組織類型的異質(zhì)性百分比可能與測試樣品不同;因此，低的異質(zhì)性水平也必須在所測試的組織的背景下解釋，并且它們可能僅在受影響的組織例如肌肉中有意義。已經(jīng)記錄了超過275種與疾病有關(guān)的線粒體DNA突變（/bin/view.pl/MITOMAP/ WebHome）.42 。MitoMap被認為是與線粒體突變和單元型相關(guān)的主要信息來源。其他資源，例如頻率信息（http：/ www。mtdb.igp.uu.se/),43二級結(jié)構(gòu)，序列和線粒體轉(zhuǎn)移RNA的比對（http：/ mamittrna。u-strasbg.fr/），44線粒體單倍體（http：/ w

58、/)45和其他信息（http：/ / default.aspx），46可能證明在解釋線粒體變異中是有用的。鑒于評估線粒體變異的難度，尚未包含單獨的證據(jù)清單。但是，任何證據(jù)都需要加以注意（對于審查，參見參考文獻47）。線粒體基因中的基因編碼轉(zhuǎn)移RNA以及蛋白質(zhì);因此，評估氨基酸變化僅與編碼蛋白質(zhì)的基因相關(guān)。類似地，由于許多線粒體突變是錯義突變，缺失突變的證據(jù)標準可能不會有幫助。因為缺失突變在大多數(shù)線粒體基因中不符合已知的變異譜，所以它們的意義可能是不確定的。雖然線粒體突變通常是母體遺傳的，但它們可能是零星的，但是由于異質(zhì)

59、性可能低于測定的檢測水平或組織之間的差異，因此難以評估從頭突變。異質(zhì)性水平可能有助于家族內(nèi)發(fā)生的變異表達和減少的外顯率。然而，異質(zhì)性和疾病嚴重程度的百分比之間仍然缺乏相關(guān)性。47肌肉，肝臟或尿液可能是可用于臨床評估的額外標本。 未檢測到的異質(zhì)性也可能影響病例，病例對照和家族一致性研究的結(jié)果。 此外，功能研究不容易獲得，盡管評估肌肉形態(tài)可能是有幫助的（即，存在粗糙的紅色纖維）。 顯示因果關(guān)系的頻率數(shù)據(jù)和已發(fā)表的研究可能通常是清單上唯一可評估的標準。 線粒體疾病的另一種工具可能是單體組分析，但這可能不代表臨床實驗室使用的常規(guī)方法，臨床相關(guān)性不易解釋。應(yīng)考慮測試與線粒體疾病相關(guān)的核基因，因為核基因中的突變可能是氧化性疾病或調(diào)節(jié)線粒體變異的原因。藥物基因組學(xué)在與藥物代謝相關(guān)的基因中建立突變