免疫固定電泳操作規(guī)程

1、免疫固定電泳操作規(guī)程項(xiàng)目名稱(chēng)免疫固定電泳（HYDRAGEL IMMUNOFIXATION ）.檢驗(yàn)方法名稱(chēng)瓊脂糖凝膠免疫固定電泳三. 方法學(xué)原理血清蛋白電泳中出現(xiàn)的異常條帶主要存在于B-球蛋白和丫 -球蛋白區(qū)域，通常疑為單克隆蛋白質(zhì)并且提示丙球蛋白血癥。 為鑒別異常條帶，可運(yùn)用免疫固定技術(shù)。 免疫固定電泳是 一種簡(jiǎn)單的技術(shù)，電泳后的蛋白質(zhì)與相應(yīng)抗體形成復(fù)合物和被固定在相應(yīng)的位置上，通過(guò)下列四個(gè)步驟：1 .蛋白質(zhì)在瓊脂糖凝膠內(nèi)進(jìn)行電泳分離。2 .電泳后已分離的蛋白質(zhì)被固定并產(chǎn)生免疫沉淀：應(yīng)用固定劑和抗血清加于凝膠表面的 泳道上，并讓固定劑和抗血清在凝膠內(nèi)滲透擴(kuò)散。3 .使用吸水紙和清洗將未沉淀的

2、蛋白質(zhì)去除，已被沉淀的蛋白質(zhì)貯留在凝膠內(nèi)。4 .將蛋白質(zhì)染色，并將這些免疫沉淀區(qū)帶的位置與蛋白質(zhì)經(jīng)電泳后觀察到的異常蛋白區(qū) 帶進(jìn)行比較。為了精確識(shí)別單克隆區(qū)帶，樣品同時(shí)在六條泳道上進(jìn)行測(cè)試。經(jīng)電泳后，ELP作為參考泳道以顯示電泳后的蛋白質(zhì)。其余五條泳道用于鑒定單克隆成分。通過(guò)它（們）與抗血清， 丫（IgG）、a （IgA）、卩（IgM）重鏈和k、入輕鏈（游離和非游離）反應(yīng)與否進(jìn)行鑒別。該技術(shù) 簡(jiǎn)單、快速、圖象清晰，易于解釋結(jié)果。四. 方法學(xué)溯源自 1930 年由 Tiselius 發(fā)現(xiàn)了移界電泳（moving boundary eectrophoresis ）,而后，這種技 術(shù)的各種局限性已逐

3、漸被區(qū)帶電泳（zone elecrrophoresis）所克服，區(qū)帶電泳的條件和支持介質(zhì)的選擇是電泳成敗的關(guān)鍵。通過(guò)免疫化學(xué)手段觀察其電泳特性及抗原特性是鑒定某一蛋 白成分最好的方法，免疫固定電泳技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的方法之一。五. 儀器（一）型號(hào)：SEBIA HYDRASYS （PN1210）（二）分析和計(jì)算參數(shù)：1. 處理量：約18個(gè)樣本/小時(shí)2. 所需樣本量：10ul3. 檢驗(yàn)時(shí)間：約55分鐘4. 重復(fù)性：有良好的批內(nèi)和批間重復(fù)性5. 電泳參數(shù)：電壓 0 300V （可選至3000V）電流 0 500mA功率0 100W六試劑及配套品（一） 試劑1. HYDRAGEL 1 IF 試齊 U

4、盒HYDRAGEL 2 IF 試齊 U盒HYDRAGEL 4 IF 試齊 U盒HYDRAGEL 9 IF 試齊 U盒(1)商標(biāo)：SEBIA(2)包裝規(guī)格：10測(cè)試/20測(cè)試/40測(cè)試/90測(cè)試(3)貨號(hào)：PN4301/ PN4302/ PN4304/PN43092.脫色液(1)商標(biāo)：SEBIA(2)包裝規(guī)格：Pack for 10 x 100ml(3)貨號(hào)：PN4540(4)成分：檸檬酸3.洗滌液(1)商標(biāo)：SEBIA(2)包裝規(guī)格：Pack for 10 x 80ml(3)貨號(hào)：PN4541(4)成分：疊氮鈉4.稀釋劑(1)商標(biāo)：SEBIA(2)包裝規(guī)格：Pack for 1 x 5ml(3

5、)貨號(hào)：PN4587二）配套品：IF試劑抗體(1)商標(biāo)：SEBIA(2 )包裝規(guī)格：Pack for 5 x 1ml(3)PN4315七操作步驟開(kāi)機(jī)，啟動(dòng)電泳儀。將1只（用于1, 2IF）, 2只（用于4IF ）或3只（用于9IF）點(diǎn)樣梳置于整表面，有數(shù)字 的一端向上，在2分鐘內(nèi)完成每塊加樣梳的加樣，每孔加 10ul樣品，然后齒梳向上把加樣 梳放于濕盒內(nèi)5分鐘。電泳/免疫固定泳道孔號(hào)ELPGAMKLHydrasys 1 IF123456Hydrasys 2/4 IF1或3號(hào)樣本2345672或4號(hào)樣本91011121314Hydrasys 9 IF1,4或7號(hào)樣本1234562,5或8號(hào)樣本7

6、891011123,6或9號(hào)樣本131415161718 選擇相應(yīng)的“ IF”電泳程序， 從包裝袋內(nèi)取出緩沖條，將其固定在電極支架背側(cè)的釘上，再取出凝膠，用薄濾紙快 速輕輕地吸去凝膠表面多余的液體，在溫控板表面下1/3處加200ul蒸餾水或去離子水，將凝膠片底邊緊靠框架底邊，邊緣對(duì)齊邊線，略彎曲凝膠片慢慢放平，注意凝膠片下面勿 出現(xiàn)氣泡。 自然放下支架，從濕盒中取出加樣梳并去除齒梳下的保護(hù)支架，1、2IF的點(diǎn)樣梳置于支架6號(hào)位，4IF的2只點(diǎn)樣梳則分別置于 3號(hào)和9號(hào)，9IF的3只點(diǎn)樣梳則分別置于 2，6號(hào)和10號(hào)，注意點(diǎn)樣梳上的數(shù)字必須面對(duì)操作者，關(guān)上電泳艙蓋，按下鍵盤(pán)左側(cè)的綠色 箭頭“ S

7、TART鍵，電泳開(kāi)始，確保儀器右側(cè)的空氣通道不被堵塞。 電泳儀自動(dòng)發(fā)出蜂鳴聲，提示電泳結(jié)束，進(jìn)行免疫固定操作。 打開(kāi)電泳蓋，將加樣梳和緩 沖條丟棄，移走兩支架，用濕紙巾擦拭電極絲，將抗體加樣條裝入抗體加樣架上，按如下要求將動(dòng)物血清抗體加入抗體加樣條：Hydrasys 1 IF 用6孔抗體加樣條：每孔加8卩l(xiāng)抗體Hydrasys 2/4IF 用15孔抗體加樣條：2人份每孔加8卩l(xiāng)抗體，4人份每孔加12卩l(xiāng)抗體Hydrasys 9 IF 用18孔抗體加樣條：每孔加8卩l(xiāng)抗體固定好抗體加樣架,將抗體加到凝膠片上。然后關(guān)上電泳艙蓋，按“Start ”鍵開(kāi)始免疫固10分鐘后，電泳儀自動(dòng)發(fā)出蜂鳴聲，提示“

8、PAPER BLOTTING ,移走抗體加樣架，棄去抗體加樣條，放一厚濾紙光面向下蓋于于凝膠表面，左手固定好濾紙，右手手指用力的 摩擦濾紙表面，注意勿將濾紙移動(dòng)，關(guān)閉電泳艙蓋，按“Start ”鍵開(kāi)始凝膠表面多余抗體的吸收。3分鐘后，電泳儀自動(dòng)發(fā)出蜂鳴聲，打開(kāi)電泳艙蓋，移去濾紙，關(guān)閉艙蓋，按“Start ”鍵開(kāi)始凝膠片的干燥。6分鐘后，電泳儀自動(dòng)發(fā)出蜂鳴聲，打開(kāi)電泳艙蓋，取出凝膠片，用濕紙巾擦拭溫控板， 將膠片固定于凝膠支架上放入染色空間中，在檢查洗液瓶中是否有400ml洗液，染色液瓶?jī)?nèi)是否有300ml染色液，脫色液瓶?jī)?nèi)是否有1000ml脫色液以及是否排空了廢液瓶后，菜單上選擇染色指令，按“

9、Start ”鍵開(kāi)始染色。在染色、脫色以及干燥步驟完成后，電泳儀自動(dòng)發(fā)出蜂鳴聲，取出凝膠支架，將烘干的 膠片取下。八.臨床意義對(duì)多發(fā)性骨髓瘤、Waldenstrom巨球蛋白血癥、分泌型骨髓瘤、輕鏈病、重鏈病等研究有重大意義。1 .正常人體內(nèi)有正常的免疫球蛋白分布，故免疫固定電泳圖譜可見(jiàn)均勻分布的IgG/A/M2. 在IgG/A/M及Kappar、lammda的泳道上發(fā)現(xiàn)濃集的條帶即為病理性的。九標(biāo)本要求 取新鮮血清進(jìn)行分析，根據(jù)臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)各種試驗(yàn)所使用的操作程序進(jìn)行血清樣本的采 集，樣本置于冰箱內(nèi)（28C）可保存一周，若冰凍可延長(zhǎng)保存時(shí)間至少一個(gè)月。冰凍的血 清樣本加入0.02g/dl的疊氮

10、鈉可以增加其存放穩(wěn)定性。 為避免抗原過(guò)剩引起的帶現(xiàn)象，血清于加樣前應(yīng)先作如下稀釋?zhuān)⒒靹?。泳道血清（ul）稀釋劑（ul）蛋白電泳（ELP）和其他免疫球蛋白固定泳道3060igG免疫固定泳道20100特殊情況當(dāng)總免疫球蛋白的水平 20g/L，稀釋劑量加倍（除了 ELP泳道）當(dāng)總免疫球蛋白水平v 5g/L，稀釋劑量減半（除了 ELP泳道）冷藏或冰凍后，某些樣本（尤其是含有冷球蛋白或冷凝膠）可能變得粘稠或混濁。這種樣 本可能由于擴(kuò)散障礙而存在點(diǎn)樣問(wèn)題。在這樣情況下，加25ul液化劑于75ml血清中，混勻15秒。然后按規(guī)定程序繼續(xù)進(jìn)行。某些單克隆蛋白質(zhì)可能因多聚體而導(dǎo)致所有的免疫固定泳道上均出現(xiàn)單克隆片段。在這樣情況下（i）準(zhǔn)備1 %B巰基乙醇（這種還原劑可在室溫于未封閉微管內(nèi)保存1周）（ii）加25ul還原劑于75u