試驗(yàn)十二常用血細(xì)胞化學(xué)染色

1、實(shí)驗(yàn)十二常用血細(xì)胞化學(xué)染色Cytochemistry stain for blood cells一、過(guò)氧化物酶染色染色原理粒細(xì)胞和局部單核細(xì)胞的溶酶體顆粒中含有髓過(guò)氧化物酶myeloperoxidase,POX或MPO，能將底物H2O2分解，產(chǎn)生新生態(tài)氧，新生態(tài)氧可氧化四甲基 聯(lián)苯膠成聯(lián)苯胺藍(lán)。聯(lián)苯胺藍(lán)自我脫氫氧化形成棕色的四甲基苯釀二胺，后者與亞硝基鐵氧化納結(jié)合，再進(jìn)一步氧化形成穩(wěn)定的藍(lán)色顆粒， 沉淀于細(xì)胞 質(zhì)內(nèi)酶所在的部位。試劑器材1. 1%TMB3,5,31,5f 一四甲基聯(lián)苯膠乙醇溶液:0.1g TMB溶于100mL88% 乙醇溶液中，置棕色瓶?jī)?nèi)，冰箱保存。2. 亞硝基鐵氧化鍋飽和溶液

2、在少量蒸餾水中參加亞硝基鐵氰晶體，至不 再溶解為止，置棕色瓶?jī)?nèi)，冰箱保存。3. 1%過(guò)氧化氫溶液取30%H2021mL參加蒸館水29mL。4. 稀過(guò)氧化氫溶液1%H2021滴，加10 mL蒸餾水稀釋新鮮配制。5 .瑞氏Wright染色液。6.新鮮涂片骨髓或血片、染色架、洗耳球、光學(xué)顯微鏡等。操作步驟1. 取0.1%TMB乙醇溶液1mL，加亞硝基鐵氰化鈉飽和溶液 10卩L ,溶液 呈淡棕黃色，染色液應(yīng)臨用前配制。2. 在新鮮枯燥的血片或骨髓涂片上，加 0.1%TMB 亞硝基鐵氰化鈉飽和 溶液0.5mL，放置lmin，再加稀H202溶液0.7mL，吹勻，染色6min。3. 自來(lái)水沖洗，待干，用瑞氏

3、染液復(fù)染 1520 min。4. 自來(lái)水沖洗，待干，用油鏡鏡檢。注意事頂1. 血涂片或骨髓涂片應(yīng)新鮮制作，涂片應(yīng)厚薄適宜。2. TMB配制在85%88%的乙醇溶液中染色效果較好，勿用90%95%乙醇， 否那么細(xì)胞外表蛋白質(zhì)很快凝固，阻礙試劑向胞內(nèi)滲入而導(dǎo)致染色效果差。3. H202需新鮮配制，其濃度與參加量不能隨意更改。涂片中粒細(xì)胞看不見(jiàn)陽(yáng)性顆粒，紅細(xì)胞呈棕色或綠色，即表示出。2過(guò)濃。假設(shè) 出。2加于血片上不產(chǎn)生氣泡，那么示無(wú)效。4. 染色液pH應(yīng)為5.5。5. 試劑應(yīng)置于低溫暗處，防止因光線照射而失效。實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)1. POX染色是鑒別急性白血病類型最重要最常用的細(xì)胞化學(xué)染色方法，臨 床上不管是

4、哪種急性白血病，首先做 POX染色，以區(qū)分是急性髓細(xì)胞白血 病還是急性淋巴細(xì)胞白血病。如變異型的急性早幼粒細(xì)胞白血病極易誤診為 急單、急粒中如以小型原粒細(xì)胞為主者極易誤認(rèn)為急淋等。在判讀細(xì)胞POX 染色結(jié)果前，要先觀察成熟粒細(xì)胞是否呈強(qiáng)陽(yáng)性，以判斷染色是否成功。2. POX陽(yáng)性說(shuō)明是急性髓細(xì)胞白血病陽(yáng)性較強(qiáng)常見(jiàn)于急性粒細(xì)胞白血病， 弱陽(yáng)性常見(jiàn)于急性單核細(xì)胞白血??；陰性說(shuō)明各種急性白血病的可能性均 有。因原始細(xì)胞多表現(xiàn)為陰性反響，故本法對(duì)白血病的分型有一定的局限性， 特別是對(duì)某些分化極差的白血病，可能失去鑒別意義。3四甲基聯(lián)苯胺法操作簡(jiǎn)單，染色效果較好，試劑無(wú)致癌作用，但對(duì)染液 pH要求較高，如

5、pH<5.0會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。二、氯乙酸AS-D荼盼醋酶染色 染色原理血細(xì)胞內(nèi)的氯乙酸 AS-D 荼酚酯酶naphythol AS-D chloroacetate esterase,NAS-DCE水解基質(zhì)液中的氯乙酸 AS-D荼酚，產(chǎn)生AS-D荼酚，進(jìn)而與基 質(zhì)液中的重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酶所在的部GBC,形成的有色沉淀為紅色1.94g2.94g100mL位。本試驗(yàn)常用的重氮鹽為堅(jiān)牢紫醬試劑器材1. 10%甲醛甲醇固定液甲醛25mL甲醇75mL混合后置4 C冰箱保存。2. Veronal醋酸緩沖液甲液：醋酸鈉含3出0巴比妥鈉蒸餾水乙液:0.1mol/L鹽酸 取鹽酸

6、比密1.190g/L0.85mL加蒸餾水至100mL。 取甲液50mL，乙液45mL，再加蒸餾水135mL，用1mol/L鹽酸調(diào)pH至 7.57.6。3基質(zhì)液氯乙酸AS-D荼酚100mg丙酮0.5mL蒸餾水5mLVero nal醋酸緩沖液5mL固醬紫GBC鹽10 mg不必過(guò)濾立即染色，一次用完。4.蘇木素染液。操作步驟1固定 新鮮枯燥的涂片在固定液中30 s1mi n,蒸餾水沖洗，待干。2. 顯示 放入基質(zhì)液37C30min，自來(lái)水沖洗。3復(fù)染 蘇木素染液復(fù)染5mn，自來(lái)水沖洗，待干，鏡檢。 注意事頂1. 冬季室溫低，茶酚和固醬紫 GBC鹽不易溶解，可放37E溫箱促溶。2. 茶酚在丙酮中溶解后

7、再加其他液體。3. NAS-DCE不被氟化鈉抑制。4. 此酶染色后的標(biāo)本易脫色，不能長(zhǎng)期保存。實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)NAS-DCE陽(yáng)性反響幾乎僅出現(xiàn)在粒細(xì)胞、較POX染色更具有特異性，因此 又稱為"粒細(xì)胞酯酶"、"特異性酯酶"。故該酶較特異地識(shí)別粒細(xì)胞系，有助 于急粒和急單的鑒別，特別是對(duì)某些 POX反響較強(qiáng)的單核細(xì)胞白血病鑒別 意義更大。三、a醋酸荼盼醋酶染色染色原理血細(xì)胞內(nèi)的a -醋酸荼酚酯酶a -naphythyol acetate esterase, -NAE在pH中 性的條件下可水解基質(zhì)液中的a -醋酸荼酚，釋放出a -荼酚與基質(zhì)液中的重 氮鹽偶聯(lián)形成不溶的

8、有色沉淀，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)酶所在的部位。本試驗(yàn)常用 的重氮鹽對(duì)堅(jiān)牢藍(lán)B,形成的有色沉淀為棕黑色或灰黑色。a -NAE存在于 單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中，故它是一種中性非特異性酯酶。單核系細(xì) 胞的陽(yáng)性可被氟化鈉抑制，所以做 a -NAE染色時(shí)，通常同時(shí)做氟化鈉抑制 試驗(yàn)。試劑器材1. 0.067mol/L 磷酸緩沖液pH7.6。甲液：Na2HPO4 T2H2O 2.388g加蒸館水至 100mL。乙液：KH2 PO4 0.908g加蒸餾水至100 mL。取甲液87mL，乙液13mL混合，調(diào)pH至7.6。2. 基質(zhì)液0.067mol/L磷酸緩沖液50 mL，加10g/L a -醋酸荼酚用50%丙酮

9、 為溶劑1.0mL，充分振蕩，直至最初產(chǎn)生的混濁物大局部消失為止，加重 氮鹽堅(jiān)牢藍(lán)B等50mg,振蕩，過(guò)濾后立即使用。3. 10 g/L甲綠水溶液。操作步驟1 .固定 新鮮枯燥涂片置10%甲醛生理鹽水中5min，自來(lái)水沖洗5min， 待干。2 .顯示 放入基質(zhì)液37C1h，自來(lái)水沖洗。3. 復(fù)染l0 g/L甲綠水溶液復(fù)染515min,自來(lái)水充分沖洗，待干，鏡檢。4. 氟化鈉抑制試驗(yàn) 在1mL基質(zhì)液中參加1.5mg氟化鈉，其余按本染色法 進(jìn)行，染色步驟同上。注意事頂1. 標(biāo)本必須新鮮，應(yīng)于取材后兩天內(nèi)染色。2. 重氮鹽的選擇依次為堅(jiān)牢藍(lán) B、堅(jiān)牢藍(lán)RR及堅(jiān)牢黑B的染色效果為好。 實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)1. a

10、 -NAE染色是一種非特異性醋酶染色，是判斷急性白血病的常規(guī)染色 方法，在中性pH時(shí)用a -NAE作底物，正常單核細(xì)胞和原始單核及幼稚單 核細(xì)胞均呈陽(yáng)性反響，不被氟化鈉抑制；其他血細(xì)胞那么呈陰性或弱陽(yáng)性反響， 故a -NAE又稱"單核細(xì)胞酶"，結(jié)合氟化鈉抑制試驗(yàn)，對(duì)鑒別單核細(xì)胞白血 病有重要價(jià)值。2. 有時(shí)單系細(xì)胞或粒系細(xì)胞、淋系細(xì)胞陽(yáng)性較弱，因此難以判斷加氟化鈉 后的抑制情況，且有時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞是由于假陽(yáng)性所致。四、過(guò)碘酸-雪夫染色染色原理過(guò)碘酸是氧化劑，使含有乙二醇基-CHOH-CHOH的多糖類物質(zhì)糖原、黏 多糖、黏蛋白、糖蛋白及糖酯等氧化，形成雙醛基-CHO-CHO。醛基

11、與雪 夫試劑中的無(wú)色品紅結(jié)合，使其變成紫紅色，定位于細(xì)胞內(nèi)的多糖所在處。在過(guò)碘酸氧化前，用麥芽糖淀粉酶或唾液淀粉酶處理標(biāo)本，再糖原染色，可鑒別是糖原還是其他多糖類物質(zhì)，如被消化那么是糖原，如不被消化那么為其他 多糖類物質(zhì)。過(guò)碘酸-雪夫反響periodic acid-Schiff reaction, PAS,以前又稱為 糖原染色。試劑器材1. IOg/L高碘酸溶液Hd2H2O1g蒸餾水加至100mL2雪夫染液 取蒸餾水200 mL加人500 mL容量的三角燒瓶，加熱至沸。移 開(kāi)火焰，緩慢參加堿性品紅1g，繼續(xù)加熱2min，使之充分溶解后停止加熱。 冷卻至60C左右時(shí)，過(guò)濾，參加1moI/L鹽酸2

12、0mL，混勻。待冷卻至25C 參加偏重亞硫酸鈉Na2S2O52g混勻，置帶塞的棕色玻璃瓶中，放暗處 24h 后加活性炭1g，振蕩混勻吸附色素，用濾紙過(guò)濾后密封在棕色瓶?jī)?nèi)，放冰 箱保存。3. 亞硫酸液100g/L偏重亞硫酸鈉1mol/L鹽酸蒸餾水每次用前新鮮配制。4. 20g/L 甲綠 甲綠蒸餾水6mL5mL100mL2g加至100mL5 淀粉酶 嚼石蠟刺激分泌唾液，收集唾液離心取上清液，內(nèi)含淀粉酶，將麥芽糖淀粉酶0.11.0g溶于0.02moI/L磷酸鹽緩沖液pH6.0100mL中。操作步驟1 固定新鮮枯燥的涂片用95%乙醇固定10 min,蒸餾水沖洗，待干。2 如涂片需要消化，可加唾液或麥芽

13、糖淀酶，置室溫消化60 min，然后用蒸餾水沖洗。3. 10g/L高碘酸氧化1520min,蒸餾水沖洗，待干。4. 置雪夫染液中室溫染色3060 min。5用亞硫酸溶液沖洗3次后，再用自來(lái)水沖洗23min,待干。6. 20g/L 甲綠復(fù)染 1020 min。7. 水洗，待干，鏡檢。注意事頂1 .所用染色缸及器具應(yīng)十分清潔、手燥。2. 固定試劑不同，染色效果不同。目前較常用的有95%乙醇、純甲醇及甲醛蒸氣，其中乙醇固定后糖原顆粒明顯，各成熟粒細(xì)胞的反響有較明顯的顏 色差異，易于判斷陽(yáng)性反響的程度，且唾液消化后的對(duì)照標(biāo)本沒(méi)有假陽(yáng)性， 故通常選用乙醇為固定劑。3. 10 g/L高碘酸溶液質(zhì)量要保證，

14、變黃那么不能用，氧化時(shí)間要準(zhǔn)確，否那么 將導(dǎo)致假陽(yáng)性或假陰性。4. 堿性品紅試劑對(duì)染色的影響不同品牌的堿性品紅染色效果不一，堿性品紅的質(zhì)量是試驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素之一。雪夫 Schiff染液應(yīng)避光保存，無(wú)色, 變紅那么失效。5. 染色后標(biāo)本應(yīng)及早觀察和記錄，染色后標(biāo)本保存8天后，將逐漸褪色， 保存時(shí)間延長(zhǎng)，褪色更為明顯。實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)1 不同疾病血細(xì)胞的PAS染色呈不同程度的陽(yáng)性反響，它在診斷惡性紅細(xì) 胞系疾病中最有價(jià)值尤其是強(qiáng)陽(yáng)性；但要注意的是惡性紅細(xì)胞系疾病并不 都是陽(yáng)性，良性紅細(xì)胞系疾病也并不是全為陰性。2. PAS染色在鑒別急性粒細(xì)胞白血病和急性單核細(xì)胞白血病中作用不大， 而在診斷淋巴細(xì)胞白血病

15、、鑒別脂質(zhì)代謝障礙等疾病有一定價(jià)值。五、中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色染色原理中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶染色的方法有 Gomori鈣-鉆法和kaplow偶氮偶聯(lián)法， 因?yàn)殁}-鉆法操作較為繁瑣且所需時(shí)間長(zhǎng)，偶氮偶聯(lián)法的試劑盒操作方便， 染色時(shí)間短，故目前國(guó)內(nèi)常用偶氮偶聯(lián)法，下面介紹該方法的原理。kaplow偶氮偶聯(lián)法成熟中性粒細(xì)胞堿性磷酸酶neutrophilic alkaline phosphatase, NAP在pH 9.6左右的堿性環(huán)境中，能水解基質(zhì)液中的磷酸荼鈉 底物，釋放出荼酚，后者與重氮鹽偶聯(lián)，生成不溶性的有色沉淀，定位于細(xì) 胞質(zhì)酶活性所在之處。試劑器材1. 10%甲醛甲醇固定液甲醛甲醇混合后置

16、4 C冰箱保存。2.丙二醇緩沖液1貯備液0.2mol/L2-氨基-2甲基-1,3-丙二醇 蒸餾水溶解后保存冰箱內(nèi)。25mL75mL10.5g加至50O mL(2)應(yīng)用液(0.05mol/L，pH 9.75)0.2mol/L貯存液0.1mol/L 鹽酸蒸餾水加至25mL5mL100 rnL3 基質(zhì)孵育液pH9.59.6 a -磷酸荼酚鈉20mg溶于0.05mol/L丙二醇緩 沖液20mL，再加堅(jiān)牢紫醬GBC鹽或重氮堅(jiān)牢藍(lán)20mg混合后用濾紙過(guò)濾， 用前臨時(shí)配制。4. 1g/L蘇術(shù)素復(fù)染液 取1g蘇木素加到蒸餾水500mL中，加熱煮沸，使 蘇木素溶解，再參加蒸餾水500mL、碘酸鈉200mg、硫酸

17、鋁鉀50g，充分混 勻，置棕色玻璃瓶中室溫保存，使用前過(guò)濾。操作步驟1 .固定新鮮枯燥的涂片用 10%甲醛固定液固定30s，蒸餾水輕輕沖洗 3060s,待干。2. 顯示 把涂片浸入基質(zhì)孵育液中，在室溫下溫育1015mi n冬季放孵育 箱溫育。蒸餾水沖洗2min。3. 復(fù)染 置蘇木素復(fù)染液復(fù)染58min,蒸餾水沖洗12min,待干，鏡檢。 注意事頂1 .堅(jiān)牢藍(lán)等重氮鹽的質(zhì)量好壞是 NAP染色成敗的關(guān)鍵。2. 基質(zhì)孵育液必須臨用前新鮮配制。3. 所用的片子要新鮮。固定后，一般在一周內(nèi)進(jìn)行染色。做NAP染色時(shí)， 最好選擇其他患者的片子做陽(yáng)性對(duì)照。4. NAP染色以陽(yáng)性率及積分報(bào)告結(jié)果。實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)1 本

18、法較鈣-鉆法簡(jiǎn)便、快速，色彩鮮艷，結(jié)果準(zhǔn)確。2 臨床上NAP染色應(yīng)用較廣泛，但受主觀因素影響較大，因此參考值變化 較大。所以,NAP積清楚顯增高或明顯減低者才有臨床意義，同時(shí)要排除生 理性影響如年齡、性別、應(yīng)激狀態(tài)、月經(jīng)周期、妊娠及分娩等 。六、鐵染色染色原理正常人骨髓中的貯存鐵主要存在于骨髓小粒和幼紅細(xì)胞中。 骨髓中的鐵在酸 性環(huán)境下與亞鐵氰化鉀作用，形成普魯士藍(lán)色的亞鐵氰化鐵沉淀，定位于含 鐵的部位。試劑器材1 酸性亞鐵氰化鉀溶液200g/L亞鐵氰化鉀溶液5份濃鹽酸1份取200g/L亞鐵氰化鉀溶液置于試管中，緩緩滴加濃鹽酸，邊滴邊搖勻， 待煙霧消失后，過(guò)濾備用。2. 2g/L核固紅-硫酸鋁溶液