野外采樣實驗

1、野外取樣實驗方案（201604）1. 實驗?zāi)康难芯孔匀粭l件下東南景天不同生育期間，其內(nèi)生菌多樣性的動態(tài)變化。2. 實驗設(shè)計選擇在東南景天的苗期、開花期、成熟期，于浙江衢州鉛鋅礦山采集具有代表性5個樣點的超累積生態(tài)型東南景天，混合為一個樣品并將其連同根際土壤放入無菌的塑料箱中，地上部裸露于袋外，保持鮮活狀態(tài)，帶回實驗室，然后進(jìn)行后續(xù)處理。3. 實驗內(nèi)容（1） powersoil試劑盒提取根際土壤菌DNA （2） 可培養(yǎng)植物內(nèi)生菌分離（3） CTAB法提取植物內(nèi)生菌DNA （4） 植物重金屬含量測定（5） 土壤理化性質(zhì)測定實驗一 powersoil試劑盒提取根際土壤菌DNA1. 實驗?zāi)康膒ower

2、soil試劑盒提取根際土壤菌DNA，保存，待之后送檢2. 實驗步驟（1） 獲取東南景天根際土壤小心把東南景天從土壤中取出，用鑷子夾取粘附在根表的土壤。每個樣點夾取約3g土壤，取1g立即提取DNA，余下裝入封口袋，（？）-20保存。（取出的東南景天表面洗凈，晾干。測量鮮重后，殺青，烘干。測量干重后，研磨，待測。植物重金屬含量，3個重復(fù)，每個重復(fù)0.1g，共需要植物根莖葉鮮重各5g）（2）選取Mobio PowerSoil DNA Isolation Kit （MO BIO Laboratories, Inc, Carlsbad, CA）試劑盒提取土壤樣品DNA。具體操作步驟如下：1）稱取約0.2

3、5g土壤樣品，放入研磨珠套管（PowerBead Tubes），渦旋混勻。2）套管中加入60l C1溶液（裂解緩沖液），顛倒數(shù)次，渦旋5s混勻。3）將套管放入水平渦旋振蕩儀，在最大速度振蕩10min。4）取出套管，在室溫下10000×g離心30s。5）把上清液（約400500l）轉(zhuǎn)移到新的2mL離心管。6）加250l C2溶液（抑制物去除液）至離心管中，渦旋5s，4下放置5min，在室溫下10000×g離心1min。7）將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的2mL離心管，總體積不超過600l，同時避免吸出沉淀物。8）加200l C3溶液（抑制物去除液）至離心管中，渦旋混勻，4下放置5min

4、，在室溫下10000×g離心1min。9）將上清液轉(zhuǎn)移到另一新的2mL離心管，總體積不超過750l，同時避免吸出沉淀物。10）加1.2mL C4溶液（高鹽溶液）至離心管中，渦旋混勻，從離心管中抽取約650l溶液至離心過濾管（Spin Filter）。11）在室溫下10000×g離心1min，取出管中過濾柱，棄去液體，過濾柱放回管中。12）加入第10步離心管中約650l溶液，重復(fù)第步操作，加入第10步離心管中剩余的溶液，重復(fù)第11步操作。13）加500l C5溶液（乙醇淋洗緩沖液）至離心過濾管中，在室溫下10000×g離心30s，棄去管中液體。14）在室溫下1000

5、0×g離心1min。15）取出過濾柱小心放入新的2mL離心管中，避免任何C5溶液濺到過濾柱上。16）加入60l C6溶液（DNA洗脫液）或無菌超純水至過濾柱白色薄膜中，在室溫下10000×g離心30s。17）棄去離心柱，提取完成。分裝-20保存，待下一步應(yīng)用。實驗二 可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的分離純化保存1. 實驗?zāi)康模?）分離東南景天內(nèi)生菌，記錄菌落數(shù)，菌落種類數(shù)，菌落形態(tài)，優(yōu)勢菌菌落數(shù)。（2）菌落純化，保存菌種。2. 儀器和試劑2.1內(nèi)生菌分離（1）需要干熱滅菌的儀器培養(yǎng)皿150個（其中在15個培養(yǎng)皿中放入濾紙）150mL燒杯75個研砵15個（2） 需要高溫濕熱滅菌的儀器R2A

6、培養(yǎng)基3000mL，分裝至15個250mL三角瓶磷酸緩沖溶液150mL，至于200mL滅菌瓶試管+蒸餾水（2*3*5=30支試管）2000mL蒸餾水，裝入1000mL三角瓶1mL槍頭兩盒（其中30個需要剪缺口）錫箔紙50張（3） 其他試劑99%酒精、35%雙氧水、3%次氯酸鈉2.2內(nèi)生菌純化保存（1）需要干熱滅菌的儀器培養(yǎng)皿50個（2）需要高溫濕熱滅菌的儀器50%甘油150mL（約150個菌種用量），倒入200mL滅菌瓶。150個凍存管，用保鮮袋包裝。R2A 固體培養(yǎng)基1000mL，分裝至5個250mL三角瓶。R2A 液體培養(yǎng)基1000mL，分裝至50個50mL三角瓶。3. 實驗步驟3.1 植

7、物樣品表面（消毒滅菌燒杯：15個植物樣×5=75個）制作2000mL無菌水。分別取4g植物樣在自來水下沖洗99%酒精（1min）35%雙氧水+3%次氯酸鈉（30min）無菌水沖洗三次。取0.3g植物樣用錫箔紙包裝，做3個重復(fù)，液氮速凍，-80保存。3.2 可培養(yǎng)細(xì)菌的培養(yǎng)及純化保存（1）細(xì)菌的培養(yǎng)基配方 R2A 培養(yǎng)基（1000ml蒸餾水，酵母粉0.5g、胰蛋白胨0.5g、酪蛋白氨基酸0.5g、葡萄糖0.5g、可溶性淀粉0.5g、KH2PO40.3g、MgSO4·7H2O：0.05g、丙酮酸鈉0.2g，pH 7.2）配制R2A 培養(yǎng)基3000mL，分裝至15個250mL三角

8、瓶，高溫濕熱滅菌121,20min。（2）磷酸緩沖溶液（滅菌處理）磷酸緩沖溶液：0.8g氯化鈉；0.02gKH2PO4；0.11gNa2HPO4；0.02gKCl；100ml蒸餾水；PH值7.4。配制磷酸緩沖溶液150mL，至于200mL滅菌瓶，高溫濕熱滅菌121,20min。（3）研磨把消毒后的葉、莖和根，分別放在滅菌的研缽中，研磨成汁，加入3ml的磷酸緩沖溶液，攪拌均勻，靜置10分鐘，再攪拌。（4）稀釋（2*3*5=30支試管）從研缽中取1ml的溶液分別稀釋10倍、100倍（5）涂布分別從原液、10倍、100倍的溶液中取200微升到細(xì)菌的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每個梯度做3個平行。（用酒精浸泡，燒的

9、時間長一些，葉、莖，考慮用不同的三角刮刀）（15個植物樣*3個濃度*3個重復(fù)=135個平板）（6）平板培養(yǎng)一星期后，計數(shù)，并記錄其菌落形態(tài)。同時，根據(jù)菌落特征。 （7）菌種純化保存（約50個菌種用量）配制50%甘油150mL（約150個菌種用量），倒入200mL滅菌瓶。準(zhǔn)備150個凍存管，用保鮮袋包裝。配制R2A 固體培養(yǎng)基1000mL，分裝至5個250mL三角瓶，配制R2A 液體培養(yǎng)基1000mL，分裝至50個50mL三角瓶。以上儀器試劑使用高溫濕熱滅菌121,20min。挑選不同的菌落到新的培養(yǎng)基，純化1次。挑單個菌落到R2A液體培養(yǎng)基中，30 、160r/min，搖床12-16小時，搖到

10、對數(shù)期或?qū)?shù)末期，測OD值，取700 uL菌液并加300 uL 50%甘油于甘油管中，保存，每個菌保存3個甘油管。實驗三 CTAB法提取植物內(nèi)生菌DNA1. 實驗?zāi)康睦肅TAB法提取植物內(nèi)生菌DNA，保存待測。2. 實驗原理 十六烷基三甲基溴化銨 (hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB)是一種陽離子去污劑，具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來。3.

11、 實驗材料（實驗分3批完成）1） 液氮；2） 研缽6個，干熱滅菌；3） CTAB DNA提取液： a. 100 mM Tris-HCl (pH8.0) 提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞； b. 20 mM EDTA (pH8.0) 螯合Mg2+或Mn2+離子，抑制DNase活性； c. 1.4 M NaCl提供一個高鹽環(huán)境，使DNA蛋白復(fù)合物（DNP）充分溶解； d. 2 % (w/v) CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide) 溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離； e. 1% PVP 40,000 (polyvinyl pyrrolidone) (聚乙

12、烯吡咯烷酮)是酚的絡(luò)合物，能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì)，有效去除多酚，減少DNA中酚的污染；同時它也能和多糖結(jié)合，有效去除多糖。 將上述試劑混合后，滅菌20分鐘，常溫保存；4） 酚氯仿異戊醇 按照酚:氯仿:異戊醇=48:48:4 的比例配置蛋白質(zhì)變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時,由于蛋白與DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。使用酚的優(yōu)點：1.有效變性蛋白質(zhì)；2抑制了DNase的降解作用。缺點：1.能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly(A)RNA。2.不能完全抑制RNase的活性；5) 氯仿異戊

13、醇 按照氯仿:異戊醇=96:4 的比例配置。能克服酚的缺點；加速有機(jī)相與液相分層。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚（酚易溶于氯仿中）；6) 異丙醇 沉淀DNA；7) 70%的酒精 清洗DNA；8) 2 mL與1.5 mL的離心管各18個，高溫濕熱滅菌。4. 實驗步驟1） 收集大約100 mg的植物樣品，在使用前保存于-80 。2） 將樣品放于研缽中，配合液氮，快速將樣品磨成粉末狀，將粉末盡量收集于一個2 mL的離心管中。3） 將步驟2中的離心管中加入0.9 mL CTAB，漩渦震蕩均勻，于65 中水浴20-30 分鐘。4） 水浴后，加入0.9 mL氯仿異戊醇，上下翻轉(zhuǎn)均勻，12000 r

14、pm離心8分鐘。5） 將離心后上清液（510L）轉(zhuǎn)至另一干凈的1.5 mL離心管中，加入340L（上清液體積的2/3）異丙醇，上下翻轉(zhuǎn)均勻（至有沉淀產(chǎn)生），12000 rpm離心8分鐘。6） 離心后棄掉液體，用0.7 mL 70 %的酒精清洗，12000 rpm離心2分鐘，小心地棄掉廢液，防止將DNA倒出。7） 重復(fù)步驟6。8） 于通風(fēng)櫥中將酒精晾干，至透明狀即可。9） 加入50 L滅菌水或TE水（pH8.0 TE可延長DNA保存時間），將DNA于-20 、-80 長期保存。5. 注意事項：1) 實驗前應(yīng)先預(yù)熱水浴鍋。3. 2) 在對DNA質(zhì)量要求不是特別高的情況下，用氯仿異戊醇即可，不用酚氯仿異戊醇。實驗四 植物重金屬含量及土壤理化性質(zhì)測定1. 實驗?zāi)康幕匦：蟊４嬷参飿蛹巴寥?，待后續(xù)檢測。2. 實驗步驟在獲取根際土壤后，將取出的東南景天表面洗凈，晾干。測量鮮重后，殺青，烘干。測量干重后，研磨，待測。植物重金屬含量，3個重復(fù)，每個重復(fù)0.1g，共需要植物根莖葉鮮重各5g。內(nèi)生菌分離試驗后，取出土壤約100g，風(fēng)干，研磨，過20