島津LC-20AT型高效液相色譜儀的圖文操作手冊

1、島津LC-20AT型高效液相色譜儀的圖文操作手冊貯液瓶DGU-20A3真空脫氣機(jī)LC-20AT溶液傳輸單元CBM-20A系統(tǒng)控制器SPD-M20A二極管陣列檢測器SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器RF-10AXL熒光檢測器CTO-20A柱溫箱手動(dòng)進(jìn)樣器Varian380-LC蒸發(fā)光檢測器一、 島津LC-20AT型高效液相色譜儀：島津LC-20AT型高效液相色譜儀二、 功能和用途：1、 功能：本儀器采用高壓梯度通過高壓輸液泵分別獨(dú)立精確控制流量、調(diào)整溶劑濃度比例，實(shí)現(xiàn)高效率、高精度混合；即配備了可提供全波長三維信息的二極管陣列檢測器，全新的光路設(shè)計(jì)與有效的梯形狹縫池設(shè)計(jì)保證了高分辨率和高靈敏度；也配備了靈

2、敏度更高、選擇性更好的熒光檢測器；還配備了具有高靈敏度、檢測范圍更廣的蒸發(fā)光檢測器。2、 用途：本儀器可以高效地分離分析高沸點(diǎn)、熱不穩(wěn)定的有機(jī)及生化試樣；二極管陣列檢測器對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)；熒光檢測器可以檢測產(chǎn)生熒光的物質(zhì)，對如多環(huán)芳烴、維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測器對碳?xì)浠衔?、表面活性劑、聚合物、脂肪酸和氨基酸、油和揮發(fā)性低于流動(dòng)相的任何樣品、不含發(fā)色團(tuán)的化合物有響應(yīng)。三、 操作步驟：1、 色譜柱的安裝本儀器配備了SPD-M20A二極管陣列檢測器、RF-10AXL熒光檢測器和Varian380-LC蒸發(fā)光散射檢測器。樣品分析

3、前首先要確定用什么檢測器，然后把色譜柱連接到所需的檢測器上。2、 開機(jī)a、 首先打開UPS，然后依次打開DGU-20A3真空脫氣機(jī)、LC-20AT溶液傳輸單元（泵）、CBM-20A系統(tǒng)控制器、所選用的檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器SIL-20A，CTO-20A柱溫箱電源打開。（HPLC組件的電源開關(guān)大都在儀器的右下角）b、 將兩個(gè)泵上部中間的黑色旋鈕逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)90180度，按purge鍵進(jìn)行自動(dòng)脫氣，一般設(shè)置為3分鐘；然后按自動(dòng)進(jìn)樣器軟鍵盤的purge鍵，對自動(dòng)進(jìn)樣器上的樣品進(jìn)行脫氣，一般為25分鐘。c、 雙擊Lc solution圖標(biāo)。輸入用戶名Admin，點(diǎn)擊OK。單擊系統(tǒng)配置的圖標(biāo)，出現(xiàn)系統(tǒng)配置的對

4、話框。單擊自動(dòng)配置，儀器自動(dòng)將能找到的儀器配置，也可以用圖示中的藍(lán)色和紅色箭頭分別添加和去掉配置的儀器。需要注意的是，儀器優(yōu)先選擇自動(dòng)進(jìn)樣器，如果需要手動(dòng)進(jìn)樣，需將自動(dòng)進(jìn)樣器去掉。單擊儀器（通訊設(shè)置），選擇正確的儀器類型，然后單擊自動(dòng)獲取IP地址。單擊系統(tǒng)控制器，出現(xiàn)系統(tǒng)控制器的對話框，繼電器的四個(gè)選項(xiàng)需要設(shè)置為start。d、 單擊儀器開關(guān)按鈕，將軟件與儀器連接e、 儀器參數(shù)視圖里面，簡單設(shè)置里面，模式選擇二元高壓梯度，設(shè)置總流速，泵B濃度，時(shí)間，柱溫箱溫度，時(shí)間程序。然后選擇下載，跑基線。單擊繪圖，可以看查看基線。3、 方法編輯a、下圖中看到儀器參數(shù)視圖，選擇高級，然后依次改變其中的參數(shù)。

5、如果儀器為PDA檢測器時(shí)，則按以下進(jìn)行設(shè)置。數(shù)據(jù)采集：LC停止時(shí)間為0.01。采集時(shí)間打勾，結(jié)束時(shí)間為分析樣品的時(shí)間。LC時(shí)間程序：如果等度洗脫，則設(shè)置如圖中0.01 controller stop。進(jìn)行梯度洗脫時(shí)需要如圖所示進(jìn)行設(shè)置。單擊繪制曲線，可查看梯度曲線。泵：模式選擇二元高壓梯度，設(shè)置泵B的濃度。最大壓力根據(jù)色譜柱的最大壓力進(jìn)行設(shè)置。PDA：一般同時(shí)選擇D2和W等，然后輸入開始和結(jié)束時(shí)的波長。柱溫箱：設(shè)置柱溫箱的溫度?？刂破鳎簩⑺膫€(gè)時(shí)間全部打勾。自動(dòng)進(jìn)樣器：不需要重新設(shè)置。自動(dòng)排氣：不需要重新設(shè)置。方法設(shè)置完后，選擇文件，另存為方法文件。當(dāng)儀器穩(wěn)定，基線穩(wěn)定后，可以下載方法，進(jìn)行樣品

6、的分析。b、如果選擇熒光檢測器，首先需要色譜柱接熒光檢測器，打開熒光檢測器的電源，系統(tǒng)配置自動(dòng)配置熒光檢測器。儀器參數(shù)設(shè)置部分檢測器需要輸入激發(fā)光和發(fā)射光的波長。其他同PDA檢測器。c、4、如果選擇蒸發(fā)光檢測器，將色譜柱連接蒸發(fā)光散射檢測器。打開Varian-380電源開關(guān)，打開Varian ELSD Control軟件方法編輯器單擊Method，出來一對話框，Use my own instrument sett，則可以改變參數(shù)，設(shè)置新的方法。也可以不打勾，直接選擇已經(jīng)設(shè)置好的方法。儀器開啟時(shí)即處于STANDBY模式，加熱塊關(guān)閉，霧化氣流速設(shè)定為較低的1.2SLM。Standby模式下用戶可設(shè)

7、定儀器參數(shù)（霧化氣流速，霧化溫度，蒸發(fā)溫度），然后將模式切換至RUN。Run模式是正常工作模式，儀器處于完全設(shè)定控制狀態(tài)。在加熱或降冷卻程中，儀器會顯示“NOT READY”，表明儀器未達(dá)設(shè)定條件。當(dāng)儀器平衡完畢，會顯示“READY”。方法使用打開機(jī)器后，選擇合適的方法。將工作模式設(shè)定為RUN，使儀器加熱平衡。打開LC solution 軟件，自動(dòng)配置選擇AD2，即選擇了蒸發(fā)光檢測器。其它設(shè)置同PDA檢測器。儀器平衡后檢察基線。在洗脫液未接入時(shí)噪音應(yīng)低于0.2mv，這表明霧化氣潔凈干燥?；€毛刺一般是由霧化氣中的粒子或水分造成的。引入洗脫液并待其平衡15min。再次檢查基線，應(yīng)不超過1mv，如

8、是為純水應(yīng)不超過0.25mv，純有機(jī)溶劑也應(yīng)不超過1mv。緩沖體系和穩(wěn)定劑可顯著增加噪音。然后進(jìn)行樣品分析。4、 運(yùn)行a、 單次運(yùn)行單擊單次運(yùn)行，出現(xiàn)對話框，選擇已經(jīng)編輯的方法，輸入文件名，輸入樣品瓶，樣品架和樣品的體積，單擊確定可以進(jìn)行樣品的分析。點(diǎn)擊輔助欄停止或者停止的快捷鍵，可以將分析停止。b、 批處理運(yùn)行單擊批處理，打開二級菜單，單擊向?qū)?，可以新建，也可以附加一個(gè)批處理文件。選擇方法文件，輸入開始樣品瓶，樣品架，進(jìn)樣體積。下一步。輸入樣品組數(shù)，選擇標(biāo)準(zhǔn)品和未知。下一步。輸入標(biāo)準(zhǔn)品名字，ID，校準(zhǔn)級別，數(shù)據(jù)文件名。下一步。輸入未知品名字，ID，數(shù)據(jù)文件名。下一步。下一步，完成。出現(xiàn)批處理

9、文件。另存批處理文件。單擊批處理開始，開始分析樣品。5、 關(guān)機(jī)樣品分析完畢，按照色譜柱的沖洗要求進(jìn)行沖洗。沖洗完后，儀器參數(shù)視圖，將總流速設(shè)為0，下載。然后單擊儀器開關(guān)，關(guān)閉軟件，最后將電源關(guān)掉，關(guān)閉UPS。6、 積分單擊再解析，打開已經(jīng)完成的數(shù)據(jù)，會看到數(shù)據(jù)、方法、報(bào)告格式、批處理、全部文件形式。點(diǎn)擊分析圖標(biāo)，選擇多色譜，提取所要波長下的峰。在積分頁面，選擇通道，半峰寬，斜率，最小峰面積，一般選擇面積選項(xiàng)。識別頁面，利用時(shí)間窗或時(shí)間帶限制峰。也可以選擇積分頁面的程序，進(jìn)行手動(dòng)積分。如果不了解方法，可以單擊幫助。點(diǎn)擊確定，分析完成。結(jié)果在視圖，峰表內(nèi)查看。7、 標(biāo)準(zhǔn)曲線a、外標(biāo)法定量單擊向?qū)В?/p>

10、打開化合物表向?qū)Т翱?，選擇通道，半峰寬，斜率，最小峰面積，一般選擇面積選項(xiàng)，下一步。選擇要標(biāo)定的峰，下一步。選擇外標(biāo)法。計(jì)算面積。輸入校準(zhǔn)級別，曲線擬合類型，一般選擇線性。零點(diǎn)，一個(gè)校準(zhǔn)級別，選擇強(qiáng)制通過，其它選擇未強(qiáng)制。加權(quán)方法無。輸入濃度，下一步。識別，選擇時(shí)間窗或者時(shí)間帶。一般來說保留時(shí)間小的用時(shí)間窗。下一步。定義峰的名字和標(biāo)樣的濃度。完成。保存方法。單擊校準(zhǔn)，雙擊已經(jīng)建立的方法。然后將標(biāo)樣圖譜拖動(dòng)到左下角數(shù)據(jù)文件的級別中，有幾個(gè)級別，則相應(yīng)的拖到相應(yīng)的級別中。則自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。另存為方法。b、內(nèi)標(biāo)法定量定量方法為內(nèi)標(biāo)法，確定內(nèi)表物的峰。8、 利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品的濃度打開需要計(jì)算的譜

11、圖，文件選擇需要加載的方法參數(shù)，查看峰表可以看結(jié)果。9、 報(bào)告編輯單擊報(bào)告模板，拖動(dòng)到報(bào)告模板中即可，然后另存為報(bào)告格式文件。顯示報(bào)告，將數(shù)據(jù)拖動(dòng)到報(bào)告模板中即顯示報(bào)告。四、 注意事項(xiàng)：1、 高壓恒流泵的維護(hù)：泵的密封圈是最易磨損的部件，密封圈的損壞可引起系統(tǒng)的許多故障，要注意保養(yǎng)和定期更換。應(yīng)采取下列措施以延長使用壽命：絕對不允許在沒有流動(dòng)相的或流動(dòng)相還沒有進(jìn)入泵頭的情況下啟動(dòng)泵而造成柱塞桿的干磨。每天使用后應(yīng)將整個(gè)系統(tǒng)管路中的緩沖液體沖洗干凈，防止鹽沉積，整個(gè)管路要浸在無緩沖的溶液或有機(jī)溶劑中。長期不用也要定期開泵沖洗整個(gè)管路。要用HPLC級試劑。 輸液管前端要用燒結(jié)不銹鋼沉子過濾流動(dòng)相。

12、要注意防止管路阻塞造成壓力過高而損壞儀器。壓力下限應(yīng)設(shè)置在0.51MPa，以防止儲液器中的流動(dòng)相被抽干或嚴(yán)重滲漏而引起柱塞的干磨。2、 流動(dòng)相的使用：必須使用HPLC級或相當(dāng)于該級別的流動(dòng)相，并先經(jīng)0.45µm薄膜過濾。過濾后的流動(dòng)相必須經(jīng)過充分脫氣，以除去其中溶解的氣體O2等，如不脫氣易產(chǎn)生氣泡、基線噪聲增加、靈敏度下降，甚至無法分析。如果管路中使用peek樹脂部件，不可使用濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、丙酮、四氫呋喃、二氯甲烷、氯仿和二甲基亞砜等試劑。特別注意HPLC使用過后的系統(tǒng)清洗：含有緩沖溶液流動(dòng)相的清洗方法：a、 先用100%的純水沖洗，打開排放閥，用35ml/min的流量，

13、洗20min左右后停泵，主要是針對吸液系統(tǒng)、泵頭、進(jìn)出口單向閥等體積較大的空間的清洗。b、 再用95/5的甲醇/水清洗整個(gè)系統(tǒng)，關(guān)閉排放閥，用1ml/min的流量，洗3060min后停泵，主要是用水清洗整個(gè)系統(tǒng)中的鹽，用5%的甲醇主要是為了保護(hù)色譜柱。c、 最后用100%的甲醇清洗整個(gè)系統(tǒng)，用1ml/min的流量，洗2min左右，然后關(guān)機(jī)。 如果流動(dòng)相中不含鹽，則只使用上述第三步清洗即可。3、 更換流動(dòng)相：在分析過程中，有時(shí)需要更換流動(dòng)相進(jìn)行分析。一定要注意前一種使用的流動(dòng)相和所更換的流動(dòng)相是不是能夠相溶。如果前一種使用的流動(dòng)相和所更換的流動(dòng)相不能夠相溶，要采用一種與這二種需更換的流動(dòng)相都能相

14、溶的流動(dòng)相進(jìn)行過濾、清洗。較為常用的過濾流動(dòng)相為異丙醇，但實(shí)際操作中要看具體情況而定，原則就是采用與這二種需更換的流動(dòng)相都能相溶的流動(dòng)相。一般清洗時(shí)間為3040分鐘，直至系統(tǒng)完全穩(wěn)定。 更換流動(dòng)相時(shí)，要用100ml的燒杯，放入需要更換的流動(dòng)相，將慮頭放入燒杯中，上下反復(fù)沖洗，然后將排液閥逆時(shí)針180度，purge。然后將排液閥順時(shí)針180度。儲液器的注意事項(xiàng)： 保持流動(dòng)相儲液器的清潔是保證儀器正常使用的關(guān)鍵。要使用HPLC級的溶劑，對試劑含有緩沖鹽及非HPLC級的流動(dòng)相一定要用0.45µm過濾器除區(qū)去其中的微量物質(zhì)。4、 色譜柱的使用：a、使用前色譜柱的儲存液無特殊說明，均為評價(jià)報(bào)告

15、所示的流動(dòng)相。在使用前，一定要注意色譜柱的儲存液與要分析樣品的流動(dòng)相是否互溶。在反相色譜中，如用高濃度的鹽或緩沖液作洗脫劑，應(yīng)先用10左右的低濃度的有機(jī)相洗脫劑過渡一下，否則緩沖液中的鹽在高濃度的有機(jī)相中很容易析出，堵塞色譜柱。b、樣品樣品也要盡可能清潔，可選用樣品過濾器或樣品預(yù)處理柱（SPE）對樣品進(jìn)行預(yù)處理；若樣品不便處理，要使用保護(hù)柱。在用正相色譜法分析樣品時(shí)，所有的溶劑和樣品應(yīng)嚴(yán)格脫水。c、色譜柱的保存如色譜柱要長時(shí)間保存，必須存于合適的溶劑下。對于反相柱可以儲存于純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲存于嚴(yán)格脫水后的純正己烷中，離子交換柱可以儲存于水（含防腐劑疊氮化鈉或柳硫汞）中，并將購買新色

16、譜柱時(shí)附送的堵頭堵上。儲存的溫度最好是室溫。d、色譜柱的再生 因?yàn)樯V柱是消耗品，隨著使用時(shí)間或進(jìn)樣次數(shù)的增加，會出現(xiàn)色譜峰高降低，峰寬加大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象，一般來說可能是柱效下降。（1）、反相柱的再生：依次采用2030倍的色譜柱體積的甲醇/水=10/90 （V/V）、乙腈、異丙醇作為流動(dòng)相沖洗色譜柱，完成后再以相反順序沖洗色譜柱。（2）、正相柱的再生：依次以20-30倍色譜柱的體積的正己烷、異丙醇、二氯甲烷、甲醇作為流動(dòng)相沖洗色譜柱，然后再以相反的順序沖洗色譜柱。要注意上述溶劑必須嚴(yán)格脫水。5、色譜柱在使用過程中易出現(xiàn)的問題和解決辦法 色譜柱在使用中最常見的問題就是柱壓升高，如果柱壓是在長時(shí)間使用過程中緩慢增加，屬于正?，F(xiàn)象。但柱壓在使用過程中突然升高（系統(tǒng)管路堵塞及壓力傳感器故障除外），可能的原因有如下幾點(diǎn)：a、色譜柱頭的過濾篩板堵塞或污染；b、色譜柱頭的填料被樣品污染；c、色譜柱內(nèi)緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機(jī)溶劑，形成結(jié)晶析出；d、流動(dòng)相PH值過大或過小使固定相結(jié)構(gòu)破壞或溶解。解決辦法如下：a、如確定是色譜柱頭的過濾篩板被污染，可以將色譜柱反方向用甲醇沖洗至正