瓊脂擴散試驗

1、可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合，兩者比例適當(dāng)并有電解質(zhì)存在及一定的溫度條件下，經(jīng)一定的時間，可形成肉眼可見的沉淀物，稱為沉淀反應(yīng)。沉淀反應(yīng)的抗原可以是多糖、蛋白質(zhì)、類脂等，與相應(yīng)的抗體相比，抗原分子?。?lt;20pm），單位體積內(nèi)所含抗原量多，具有較大的反應(yīng)面積。為了使抗原抗體之間比例適合，不使抗原過剩，故一般均應(yīng)稀釋抗原，并以抗原最高稀釋度仍能與抗體出現(xiàn)沉淀反應(yīng)為該抗體的沉淀反應(yīng)效價（滴度）。免疫擴散法就是使抗原與抗體在瓊脂糖凝膠中自由擴散而相遇，從而形成抗原抗體復(fù)合物，由于此復(fù)合物分子量增大并產(chǎn)生聚集，不再繼續(xù)擴散而形成肉眼可見的帶狀或線狀沉淀帶?？乖贵w復(fù)合物的沉淀帶是一種特異性的半滲

2、透性屏障，它可以阻止免疫學(xué)性質(zhì)與其相似的抗原抗體分子通過，而允許那些性質(zhì)不相似的分子繼續(xù)擴散，這樣由不同抗原或不同抗體所形成的沉淀帶各有各的位置，從而可以分離和鑒定混合系統(tǒng)。利用瓊脂糖凝膠作為擴散介質(zhì)是因為一定濃度的瓊脂糖凝膠，其內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀。而且孔徑很大，可以允許大分子物質(zhì)（分子量自十幾萬到幾百萬以上）自由通過。因為大多數(shù)抗原和抗體的分子量都在20萬以上，所以它們在瓊脂糖凝膠中幾乎可以自由擴散。而且瓊脂糖凝膠又具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、含水量大、透明度好、來源方便、處理容易等優(yōu)點，因此是免疫沉淀檢測技術(shù)中最理想的擴散介質(zhì)。瓊脂擴散試驗可在試管內(nèi)、平皿中以及玻片上的瓊脂中進(jìn)行。又可分為單向瓊脂擴

3、散試驗和雙向瓊脂擴散試驗兩類。單向瓊脂擴散試驗單向瓊脂擴散試驗是一種常用的定量檢測抗原的方法。將適量稀釋后的抗體與等量瓊脂混勻，澆注成板，凝固后，在板上打孔，孔徑3mm,孔間距10mm,孔中加入抗原，每孔10L,放置濕盒中，37c溫箱，抗原就會向孔的四周擴散，邊擴散邊與瓊脂中的抗體結(jié)合。24h-48h后觀察結(jié)果，在兩者比例適當(dāng)處形成白色沉淀環(huán)。沉淀環(huán)的直徑與抗原的濃度成正比。如事先用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)抗原制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，則從曲線中可求出標(biāo)本中抗原的含量。本試驗主要用于檢測標(biāo)本中各種免疫球蛋白和血清中各種補體成分的含量，敏感性很高。雙向瓊脂擴散試驗雙向瓊脂擴散試驗測定時將加熱溶化的瓊脂或瓊脂糖澆至玻片

4、上，等瓊脂凝固后，打多個小孔，將抗原和抗體分別加入小孔內(nèi)，使抗原和抗體在瓊脂板上相互擴散。當(dāng)二個擴散圈相遇，如抗原和抗體呈特異性的結(jié)合且比例適當(dāng)時，將會形成抗原抗體復(fù)合物的沉淀，該沉淀可在瓊脂中呈現(xiàn)一條不透明的白色沉淀線。如果抗原與抗體無關(guān)，就不會出現(xiàn)沉淀線，因此可以通過該試驗，用特異性抗體鑒定抗原，或反之用已知抗原鑒定抗體。另外沉淀線的特征與位置不僅取決于抗原，抗體的特異性和濃度，而且與其分子的大小及擴散速度有關(guān)，當(dāng)抗原體存在多種成分時，將呈現(xiàn)多條沉淀線以至交叉反應(yīng)線，因此可用來檢查抗原和免疫血清的特異性、純度或濃度比較抗原之間的異同點，因而應(yīng)用范圍較廣。實驗材料1 .材料和試劑（1） PH

5、8.6,0.1M巴比妥一一巴比妥鈉緩沖液巴比妥鈉10.3g巴比妥1.84g硫柳汞100mg（防腐劑）蒸儲水加熱溶解并定容至500ml（2） 1%預(yù)復(fù)瓊脂（或瓊脂糖）1g瓊脂（或瓊脂糖）加蒸儲水100ml溶化即可。（3） 1%瓊脂糖凝膠1g瓊脂糖加50ml蒸儲水置水溶中煮沸溶解或用與波爐加熱溶解（注意不要溢出且注意加入蒸發(fā)的水），然后再加入50ml上述巴比妥緩沖液混勻，置4c保存?zhèn)溆?。?） 抗原及相應(yīng)免疫血清。2 .設(shè)備和器材玻璃板、模具，打孔器和挑針、滴管、有蓋搪瓷盒（內(nèi)鋪有濕潤的濾紙）、溫箱（25C）、三角燒杯、玻璃攪拌、微量加樣器、其他常用器材。編輯本段操作步驟1 .預(yù)復(fù)瓊脂玻板的制備將

6、溶化的1%預(yù)復(fù)瓊脂用滴管加玻板上，使之能將表面覆蓋即可，放于溫箱內(nèi)干燥（或自然干燥），即可用以制備凝膠板。2 .凝膠板的制備溶化瓊脂糖，在水平桌上將溶化的瓊脂糖倒在預(yù)復(fù)瓊脂玻板上，制成厚度約34mm厚的瓊脂糖凝膠板，待冷卻后根據(jù)所需形狀打孔（注意不宜在室溫下放置過久，盡量縮短操作時間，以免干燥）。梅花型：3 .免疫擴散及結(jié)果觀察將抗原加入中心孔，倍比稀釋的免疫血清加入周圍孔，留1孔加雙蒸水，以作空白對照（注意：加樣至孔滿為止，不可外溢）。待孔內(nèi)液體滲入凝膠后即可放于溫盒中（如需要可重復(fù)加樣，加樣間隔時間應(yīng)掌握在第一次加樣后孔內(nèi)液體尚未完全擴散完的情況下即加入，以免孔周圍形成不透明的白色圈）。濕盒于25c中，一般保溫2448h,觀察抗原抗體產(chǎn)生的白色沉淀線。免疫血清的滴度以一定抗原濃度下出現(xiàn)白色沉淀線的最高稀釋度來表示。如不知抗原濃度是否與免疫血清相當(dāng)時，抗原也可倍比稀釋，多做幾個梅花孔以作比較。標(biāo)本的保存為了保存標(biāo)本，可染色處理，步驟如下：（1）用生理鹽水浸洗待保存的玻板23天，每天換水12次，洗去多余的抗原抗體及其他蛋白。（2）浸洗后于玻板的凝膠上加5%甘油或用0.5%瓊脂填孔防裂，用濕的優(yōu)質(zhì)濾紙覆在凝膠上（兩者之間不要有空氣），37c過液使其徹底干燥。（3）打濕濾紙，輕輕揭下，洗凈膠