細(xì)菌內(nèi)毒素檢查

1、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查1、實(shí)驗(yàn)原理2、實(shí)驗(yàn)試劑3、試驗(yàn)器具4、檢查方法概述5、供試品溶液的制備6、內(nèi)毒素限值的確定7、最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定8、賞試劑靈敏度復(fù)核9、干擾試驗(yàn)10、供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查1、實(shí)驗(yàn)原理：利用賞試劑與微量內(nèi)毒素產(chǎn)生凝聚反應(yīng)的現(xiàn)象，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的限量是否符合規(guī)定的一種方法。細(xì)菌內(nèi)毒素的量用內(nèi)毒素單位（EU）表示。2、實(shí)驗(yàn)試劑：賞試劑：從海洋無脊椎動物“賞”的藍(lán)色血液中提取的變形細(xì)胞溶解物，經(jīng)低溫冷凍干燥精制的生物制劑。賞試劑的生物活性以其能檢出細(xì)菌內(nèi)毒素的最低有效濃度表示，即賞試劑的靈敏度，單位為EU/mlo當(dāng)使用新批號的賞試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生可能影響檢驗(yàn)結(jié)

2、果的改變時，應(yīng)進(jìn)行賞試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品：系自大腸埃希菌提取精制得到的內(nèi)毒素，用于標(biāo)定細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)定，仲裁賞試劑靈敏度。細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：系以細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品為基準(zhǔn)標(biāo)定其效價(jià)，用于試驗(yàn)中賞試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗(yàn)及各種陽性對照。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水：指內(nèi)毒素含量少于0.015EU/ml（用于凝膠法）或0.005EU/ml（用于光度測定法），且對內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用的滅菌注射用水。3、實(shí)驗(yàn)器具：刻度吸管、凝聚管（10X75mm、三角瓶、小試管（10X100mm、試管架、洗耳球、封口膜或金屬試管帽、時鐘、脫脂棉、吸水紙、剪刀砂輪。耐熱器皿常用干熱滅菌法（250

3、C,30分鐘以上）去除，塑料用具應(yīng)選用無內(nèi)毒素并且對試驗(yàn)無干擾的器械（目前多為無熱源的一次性用品）。4、檢驗(yàn)方法概述凝膠法：限量法、半限量法光度測定法：濁度法（終點(diǎn)濁度法和動態(tài)濁度法）、顯色基質(zhì)法（終點(diǎn)濁度法和動態(tài)濁度法）凝膠法：最簡單、經(jīng)濟(jì)、應(yīng)用廣泛、中國藥典的“仲裁”方法，對干擾相對不敏感，較光度測定法不靈敏。5、供試品溶液的制備某些供試品需進(jìn)行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸取制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的PH值在6.08.0的范圍內(nèi)?？墒褂盟帷A溶液或適宜的緩沖液調(diào)節(jié)PH值。6、內(nèi)毒素限值的確定一般按公式：L三yM式中：L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限量，以EUXml,EU/mg或EUXU（活

4、性單位）表示。K為人每公斤體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，注射劑K=5EU（kg.h）,放射性藥品注射劑K=2.5EU（kg.h）靶內(nèi)用注射劑K=0.2EU（kg.h）。M為人人用每公斤體重每小時的最大供試品劑量，依據(jù)藥品使用說明書，w臨床用藥須知規(guī)定。7、最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）指在試驗(yàn)中供試品溶液被稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進(jìn)行內(nèi)毒素限度的測定。MVD=Cl/入式中：L為供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限量，C為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EUXml表示時，則C等于1.0ml/ml,當(dāng)L以EU/mg表示時，C的單位為mg/ml,入為在凝膠法中賞試劑的標(biāo)示靈

5、敏度（EU/ml）。8、賞試劑靈敏度復(fù)核目的：考察賞試劑的靈敏度是否符合標(biāo)準(zhǔn)，考察檢驗(yàn)人員操作方法是否正確及實(shí)驗(yàn)條件是否符合規(guī)定。當(dāng)使用新批號的賞試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生可能影響檢查結(jié)果的改變時，應(yīng)進(jìn)行賞試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)。細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)備：、取細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（或國家標(biāo)準(zhǔn)品）一支，輕彈瓶壁，使粉末洛入瓶底，然后用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，75%酒精棉球擦拭后啟開，啟開過程中應(yīng)防止玻璃屑落入瓶內(nèi)。、按照標(biāo)準(zhǔn)品說明書，加入規(guī)定量的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴(yán)，置旋渦混合器上混合15分鐘，然后進(jìn)行稀釋，制備成4個濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，即2入、入、0.5入和0.25入（

6、入為所復(fù)核的賞試劑的標(biāo)示靈敏度），四個濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30分鐘。示例：某待復(fù)核賞試劑的靈敏度標(biāo)示值為0.25EU/ml,細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品規(guī)格為150EU/ml,將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水，再稀釋制備成濃度為0.50EU/ml,0.25ELI/ml,0.125EU/ml和0.06EU/ml的細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備過程圖示：15EU/ml2.0EU/ml0.5EU/ml0.25EU/mI0J25EU/mI0.06EU/mI待復(fù)核賞試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格0.1ml/支的賞試劑18支，每支加入0.1ml檢驗(yàn)用水使溶解備用（

7、規(guī)格大于0.1ml/支的賞試劑，按其標(biāo)示量加入細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶后按0.1ml/管分裝到凝聚管中，至少準(zhǔn)備18管）。加樣將已充分溶解的待復(fù)核賞試劑18支（管）放在試管架上，排成5歹U,其中4列4支，1列2支。其中4支4列分別加入0.1ml的2入、入、0.5入和0.25入內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，另2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對照。加樣結(jié)束后，將賞試劑用封口膜封口，輕輕振動混勻，垂直放入371C恒溫器中，保溫602分鐘。觀察結(jié)果將試管輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180。，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑落者為陽性，未形成凝膠或形成的凝膠不堅(jiān)實(shí)、變形并從管壁滑落著為陰性。計(jì)算當(dāng)最大濃度2入管

8、均為陽性，最低濃度0.25入管均為陰性，陰性對照為陰性時實(shí)驗(yàn)為有效，按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為賞試劑靈敏度的復(fù)核結(jié)果。XC=lg-1（匯X/4）式中X為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值（lg）。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。例子：內(nèi)毒素D50.250.1250.06NC反應(yīng)級占平1+一一0.125行2+一0.25管3+一0.25數(shù)4十+0.25入晨（NX/4）二lgKlgO-125+lgO.2541gO.25+1名825）Z41二0.21EU/ml結(jié)果判斷當(dāng)入C在0.5入2入（包括0.5入和2入）時，方可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以標(biāo)示靈敏度入為該批賞試劑靈敏度。

9、9、干擾試驗(yàn)?zāi)康模捍_定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和賞試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。當(dāng)進(jìn)行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗(yàn)前，或無內(nèi)毒素檢查項(xiàng)的品種建立內(nèi)毒素檢查法時，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)賞試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時，須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。進(jìn)行干擾試驗(yàn)一般步驟供試品限量確定根據(jù)賞試劑的靈敏度確定MVD范圍（供試品溶液濃度范圍）預(yù)試驗(yàn)（帥選試驗(yàn)）：確定樣品最大不干擾濃度正式干擾試驗(yàn)干擾試驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模撼醪酱_定供試品的最大不干擾濃度（當(dāng)限值以EU/mg或EtyU活性單位標(biāo)示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當(dāng)限值以EU/ml標(biāo)示），

10、為正式干擾實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)，避免干擾試驗(yàn)的盲目性。操作方法將無可檢測到內(nèi)毒素的供試品進(jìn)行一系列倍數(shù)的稀釋，但最大的稀釋倍數(shù)不得超過MVD=CL/入0.03（0.03EU/ml為現(xiàn)今我國市售賞試劑的最高靈敏度）使用賞試劑對每一稀釋倍數(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)。每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和2支供試品陽性對照（即該濃度的供試品稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2入濃度）。另取2支細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照，2支加入2入濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液作為陽性對照。例子制備稀釋倍數(shù)為4的供試品陽性對照溶液：0.3ml4.0入EU/ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液+0.3ml稀釋倍數(shù)為2的供試品稀釋液=0.6ml含2入EU/ml內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶

11、液為4的供試品稀釋數(shù)。保溫602分鐘，觀察并記錄結(jié)果。當(dāng)陰性對照為陰性，陽性對照為陽性時，實(shí)驗(yàn)有效。當(dāng)系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽性對照2管為陽性時，認(rèn)為供試品在該濃度下不干擾實(shí)驗(yàn)，此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋倍數(shù)。即可選擇該稀釋倍數(shù)進(jìn)行正式干擾實(shí)驗(yàn)。當(dāng)系列濃度中所有濃度的供試品管都不為陰性，或供試品陽性對照不為陽性時，說明供試品對內(nèi)毒素與賞試劑的反應(yīng)在干擾，則應(yīng)對供試品進(jìn)行更大稀釋倍數(shù)（不得超過MVD=CL/入0.03）或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱中和等）排除干擾。當(dāng)供試品的內(nèi)毒素限值單位為EU/mg或EUXU活性單位時，應(yīng)將最小不干擾稀釋倍數(shù)換算成最大不干

12、擾濃度（即稀釋倍數(shù)下溶液的濃度），以mg/ml或活性單位/ml標(biāo)示。舉例某注射液限值為2.5EU/ml,按MVD=CL入計(jì)算出靈敏度為0.03EU/ml下的MVD83倍，將供試品溶液進(jìn)行一系列稀釋，用靈敏度為0.25EU/ml的賞試劑預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下：稀釋倍數(shù)原液510204080供試品溶液一一一一一一一一一一一一供試乩陽性對照+由以上結(jié)果可初步確定該樣品的最小不干擾稀釋倍數(shù)為20倍，可在此濃度下進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。正式干擾試驗(yàn)制備內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)對照溶液取1支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋成4個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液即2入、入、0.5入、0.25入。制備含內(nèi)毒素的供試品溶液將供試品稀釋至預(yù)實(shí)驗(yàn)中

13、確定的不干擾稀釋倍數(shù)，再用此稀釋液將同支細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成4個濃度即2入、入、0.5入、0.25入的含內(nèi)毒素的供試品溶液。賞試劑的準(zhǔn)備取規(guī)格為0.1ml/入支的賞試劑36支，備用。加樣準(zhǔn)備好的36支賞試劑放在試管架上，按下圖加樣。0.1ml含內(nèi)加泰的供法品港0.1ml供內(nèi)品素OJml內(nèi)2泰林用液0,1ml介川水2AX&5人0*2&A陰，密?寸照 O O 。加樣樣結(jié)束后，用封口膜封口，輕輕振動混勻，避免產(chǎn)生氣泡，放入37c土1C恒溫器中，保溫602分鐘，觀察并記錄結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算如兩組最大濃度2入均為陽性，最低濃度0.25入均為陰性，陰性對照4管均為陰性時，按下式計(jì)算用檢查用水制成的內(nèi)毒素

14、標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Es）和用供試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值（Et）。Es=lg1（二Xs/4）Et=lg1（匯Xt/4）式中：Es、Et分別用檢查用水和試品溶液或稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對數(shù)值（lg）。當(dāng)Es在0.5入5入（包括0.5入和2入）及Et在0.5Es2Es（包括0.5Es和2Es）時，則認(rèn)為供試品在該濃度下無干擾作用，可在該濃度下對此供試品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。當(dāng)Et不在0.5Es2Es（包括0.5Es和2Es）時，則認(rèn)為供試品在該濃度下干擾實(shí)驗(yàn)。應(yīng)使用適宜的方法排除干擾，如可將供試品進(jìn)行更大倍數(shù)稀釋（不超過MVD）。建立

15、新品種細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法時，每個廠家至少取三個批號的供試品。用兩個以上賞試劑生產(chǎn)廠家的賞試劑進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)。10、供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查在細(xì)菌內(nèi)毒素檢查中，每批供試品必須做2支供試品管和2支供試品陽性獨(dú)照，同時每次實(shí)驗(yàn)必須做2支陽性對照和2支陰性對照。供試品溶液的準(zhǔn)備根據(jù)內(nèi)毒素限度值，計(jì)算MVD=CL/入，然后將供試品進(jìn)行稀釋，其稀釋倍數(shù)不得超過MVD。一般稀釋至MVD:如樣品有干擾作用，選擇符合干擾試驗(yàn)要求的第二農(nóng)地作為日常檢驗(yàn)濃度。陽性對照溶液的制備用檢查用水將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制成2入濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液。供試品陽性對照溶液的制備用待檢測的供試品溶液或其稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品制成2入濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液陰性對照即細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水賞試劑的制備取規(guī)格為0.1ml/支的賞試劑8支，每支加入01ml檢查用水使溶解備用。加樣8支管中2支加入0.1ml供試品溶液或其稀釋液作為供試品管，2支加入0.1ml陽性對照溶液作為陽性對照管，2支加入0.1ml檢查用水作為陰性對照管，2支加入0.1ml供試品陽性對照溶液作為供試品陽性對照管。將試管中溶液輕輕混勻后，用封口膜封閉管口，垂直放入37C1C水浴或適宜恒溫器中，保溫602分鐘。結(jié)果判斷當(dāng)陽性對照都為陽性，供試品陽性對照都為陽性且陰性對照都為陰性時，實(shí)驗(yàn)方有效。若供試品2管均為陰性，認(rèn)為該供試品符合規(guī)定；如供試品2管均為陽