第十章吸光光度法

1、第第10章章 吸光光度法吸光光度法10.1 概述概述10.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理10.3 分光光度計分光光度計10.4 顯色反應(yīng)及影響因素顯色反應(yīng)及影響因素10.5 光度分析法的設(shè)計光度分析法的設(shè)計10.6 吸光光度法的誤差吸光光度法的誤差10.7 常用的吸光光度法常用的吸光光度法10.8 吸光光度法的應(yīng)用吸光光度法的應(yīng)用吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光吸光光度法：分子光譜分析法的一種，又稱分光光度法，屬于分子吸收光譜分析方法度法，屬于分子吸收光譜分析方法 基于外層電子躍遷基于外層電子躍遷10.1 概述概述n吸收光譜吸收光譜n發(fā)射光譜發(fā)射光譜n散射光譜散射光譜n分

2、子光譜分子光譜n原子光譜原子光譜10.2 吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理1 吸收光譜產(chǎn)生的原因吸收光譜產(chǎn)生的原因 光光: :一種電磁波一種電磁波, ,波粒二象性波粒二象性 光譜名稱波長范圍X射線0.110nm遠(yuǎn)紫外光10200nm近紫外光200400nm可見光400750nm近紅外光0.752.5um中紅外光2.55.0um遠(yuǎn)紅外光5.01000um微波0.1100cm無線電波11000m當(dāng)光子的能量與分子的當(dāng)光子的能量與分子的 E匹配時，匹配時，就會吸收光子就會吸收光子 E=hu u=hc/l la 躍遷類型躍遷類型 價電子躍遷價電子躍遷：*, *; n*, n* E (h) 順序:

3、n* n*104)c. 產(chǎn)物的化學(xué)組成穩(wěn)定產(chǎn)物的化學(xué)組成穩(wěn)定d. 化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定e. 反應(yīng)和產(chǎn)物有明顯的顏色差別反應(yīng)和產(chǎn)物有明顯的顏色差別 ( l l60nm)沒有顏色的化合物，需要通過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)定量沒有顏色的化合物，需要通過適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)定量生成有色化合物再測定生成有色化合物再測定 顯色反應(yīng)顯色反應(yīng)1 顯色反應(yīng)顯色反應(yīng)一顯色反應(yīng)和顯色劑一顯色反應(yīng)和顯色劑2. 顯色劑顯色劑無機(jī)顯色劑無機(jī)顯色劑: 過氧化氫，硫氰酸銨，碘化鉀過氧化氫，硫氰酸銨，碘化鉀有機(jī)顯色劑：有機(jī)顯色劑： 肟類：丁二肟肟類：丁二肟CCCH3NNO HH OCH3鄰菲羅啉類：新亞銅靈鄰菲羅啉類：新亞銅靈 NNC H3C H

4、3N NN NSO3HHO3SOHOHAsO H32H O As32偶氮類：偶氮胂偶氮類：偶氮胂III三苯甲烷類三苯甲烷類 三苯甲烷酸性染料三苯甲烷酸性染料: :鉻天菁鉻天菁S S OC H3C O O HH OCC lC lS O3HC H3C O O H 三苯甲烷堿性染料三苯甲烷堿性染料: :結(jié)晶紫結(jié)晶紫 CN ( C H3)2( H3C )2NN ( C H3)23.多元絡(luò)合物多元絡(luò)合物混配化合物混配化合物 V-PAR-H2O2 Nb-5-Br-PADAP-酒石酸離子締合物離子締合物 AuCl4-羅丹明B金屬離子金屬離子-配體配體-表面活性劑體系表面活性劑體系 Mo-水楊基熒光酮-CTM

5、AB 二影響顯色反應(yīng)的因素二影響顯色反應(yīng)的因素1 溶液酸度（溶液酸度（pH值及緩沖溶液）值及緩沖溶液）u a影響顯色劑的平衡濃度及顏色，改變lu b影響待測離子的存在狀態(tài)，防止沉淀u c影響絡(luò)合物組成形式形式 pH max(nm) 形式形式 pH max(nm)H4L+ 1.2 462-465 Sn4+ 1.0 530H3L 4.8-5.2 462,490 Ga3+ 5.0 550H2L- 8.4-9.0 512HL2- 11.4-12.0 532-538pH對苯芴酮及其絡(luò)合物的顏色影響對苯芴酮及其絡(luò)合物的顏色影響 2 顯色劑的用量顯色劑的用量稍過量，處于平臺區(qū)稍過量，處于平臺區(qū) 3 顯色反應(yīng)

6、時間顯色反應(yīng)時間針對不同顯色反應(yīng)確定顯示時間 顯色反應(yīng)快且穩(wěn)定；顯色反應(yīng)快但不穩(wěn)定； 顯色反應(yīng)慢，穩(wěn)定需時間；顯色反應(yīng)慢但不穩(wěn)定4 顯色反應(yīng)溫度顯色反應(yīng)溫度加熱可加熱可加快反應(yīng)速度，導(dǎo)致顯色劑或產(chǎn)物分解5 溶劑溶劑6 干擾離子干擾離子 有機(jī)溶劑，提高靈敏度、顯色反應(yīng)速率有機(jī)溶劑，提高靈敏度、顯色反應(yīng)速率消除辦法：消除辦法： 提高酸度，加入隱蔽劑，改變價態(tài)提高酸度，加入隱蔽劑，改變價態(tài) 選擇合適參比選擇合適參比 褪色空白褪色空白(鉻天菁鉻天菁S測測Al，氟化銨褪色，消除鋯、鎳、鈷干擾，氟化銨褪色，消除鋯、鎳、鈷干擾) 選擇適當(dāng)波長選擇適當(dāng)波長 1 測定波長選擇測定波長選擇選擇原則：選擇原則：“吸

7、收最大，干擾最小吸收最大，干擾最小”靈敏度選擇性10.4 吸光光度分析及誤差控制吸光光度分析及誤差控制一一 測定波長的選擇和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作測定波長的選擇和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作標(biāo)準(zhǔn)曲線制作0123456780.000.050.100.150.200.250.300.35Aconcentration理論基礎(chǔ)：朗伯理論基礎(chǔ)：朗伯-比爾定律比爾定律 相同條件下相同條件下測定不同濃度標(biāo)測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度準(zhǔn)溶液的吸光度AAc 作圖作圖非單色光引起的偏移非單色光引起的偏移物理化學(xué)因素：非均勻介質(zhì)及化學(xué)反應(yīng)物理化學(xué)因素：非均勻介質(zhì)及化學(xué)反應(yīng)吸光度測量的誤差吸光度測量的誤差 二二.對朗伯對朗

8、伯-比爾定律的偏移比爾定律的偏移1 非單色光引起的偏移非單色光引起的偏移復(fù)合光由復(fù)合光由l l1和和l l2組成，對于濃度不同的溶液組成，對于濃度不同的溶液a和和b,引起的吸光度的偏差不一樣，濃度大，復(fù)合光引引起的吸光度的偏差不一樣，濃度大，復(fù)合光引起的誤差大，故在高濃度時線性關(guān)系向下彎曲。起的誤差大，故在高濃度時線性關(guān)系向下彎曲。 膠體，懸浮、乳濁等對光產(chǎn)生散射，使實測吸膠體，懸浮、乳濁等對光產(chǎn)生散射，使實測吸光度增加，導(dǎo)致線性關(guān)系上彎光度增加，導(dǎo)致線性關(guān)系上彎2 非均勻介質(zhì)非均勻介質(zhì)離解、締合、異構(gòu)等離解、締合、異構(gòu)等如：如：Cr2O72-+H2O =2HCrO4- =2H+2CrO42-

9、 PAR的偶氮醌腙式的偶氮醌腙式 3.化學(xué)反應(yīng)化學(xué)反應(yīng)控制濃度控制濃度 吸光度吸光度A：0.20.8減少測量誤差減少測量誤差三三.吸光度測量的誤差吸光度測量的誤差吸光度標(biāo)尺刻度不均勻吸光度標(biāo)尺刻度不均勻A0.434 ，T36. 8% 時，測量的相對誤差最小時，測量的相對誤差最小A=0.20.8, T=1565%，相對誤差，相對誤差4% dc/c= dA/A=dT/TlnT Er=dc/c100= dA/A100=dT/TlnT1001.示差吸光光度法示差吸光光度法目的：提高光度分析的準(zhǔn)確度和精密度目的：提高光度分析的準(zhǔn)確度和精密度 解決高解決高(低低)濃度組分濃度組分(A在在0.20.8以外以

10、外)問題問題分類：高吸光度差示法、低吸光度差示法、分類：高吸光度差示法、低吸光度差示法、 精密差示吸光度法精密差示吸光度法特點：特點： 以標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白以標(biāo)準(zhǔn)溶液作空白原理：原理： A相對相對 = A = e ebcx- e ebc0= e eb c準(zhǔn)確度：讀數(shù)標(biāo)尺擴(kuò)展準(zhǔn)確度：讀數(shù)標(biāo)尺擴(kuò)展, 相對誤差減少相對誤差減少, c0愈接近愈接近cx, 準(zhǔn)確度提高愈顯著準(zhǔn)確度提高愈顯著10.5 其他吸光光度法其他吸光光度法例：硫脲還原硫氰酸鹽比色法測定鋼鐵中的鉬。酸例：硫脲還原硫氰酸鹽比色法測定鋼鐵中的鉬。酸溶，硫酸高氯酸介質(zhì)中，硫脲還原鐵（溶，硫酸高氯酸介質(zhì)中，硫脲還原鐵（III）為鐵）為鐵(II),

11、除干擾，還原鉬（除干擾，還原鉬（VI）為五價，）為五價，2.00mg/100ml的的鉬標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比溶液，用鉬標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比溶液，用2.00-2.30mg/100ml的鉬標(biāo)的鉬標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制工作曲線和測定樣品溶液的吸光準(zhǔn)溶液，繪制工作曲線和測定樣品溶液的吸光度度,480nm測定測定A。 2.雙波長吸光光度法雙波長吸光光度法 目的：解決渾濁樣品光度分析目的：解決渾濁樣品光度分析 消除背景吸收的干擾消除背景吸收的干擾 多組分同時檢測多組分同時檢測 原理：原理： A = Al l1-Al l2 = （e el l1- e el l2）b c 波長對的選擇：波長對的選擇： a.等吸光度點法，等吸光度點

12、法，b.系數(shù)倍率法系數(shù)倍率法選選l l1為參比波長為參比波長, l l2為測量波長為測量波長得得 Al l1= e e xl l1bcx + e e yl l1bcy Al l2= e e xl l2bcx+ e e yl l2bcy A=Al l2-Al l1= (e e x2bcx+e e yl l2bcy)-(e e xl l1bcx+e e yl l1bcy)在等吸光度的位置在等吸光度的位置(G, F), e e yl l2 e e yl l1，則上式成為，則上式成為 A=(e e xl l2- e e xl l1）bcx A與與cx成正比成正比, 可用于測定可用于測定例例,苯酚與苯酚

13、與2,4,6-三氯苯酚三氯苯酚(y)混合混合物中苯酚物中苯酚(x)的雙波長分光光度法的雙波長分光光度法測定。測定。3.導(dǎo)數(shù)吸光光度法導(dǎo)數(shù)吸光光度法 目的：提高分辨率目的：提高分辨率 去除背景干擾去除背景干擾 原理：原理： dnA/dl ln l l 10.6 吸光光度法的應(yīng)用吸光光度法的應(yīng)用1 測定弱酸和弱堿的離解常數(shù)測定弱酸和弱堿的離解常數(shù) AHB和AB-分別為有機(jī)弱酸HB在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿性時的吸光度，它們此時分別全部以HB或B-形式存在。HB H+ + B- H+B-Ka = HBpKa=pH+ lg HBB-A=AHB+AB-pKa=pH+ lg AB- - AA- AHBlg AB- -

14、AA- AHB對對pH作圖即可求得作圖即可求得pKa 2 絡(luò)合物組成確定絡(luò)合物組成確定 飽和法（摩爾比法）飽和法（摩爾比法）制備一系列含釕制備一系列含釕3.010-5 mol/L (固定不變固定不變)和不和不同濃度（小于同濃度（小于12.010-5 mol/L）的）的PDT溶液，按溶液，按實驗條件，實驗條件，485nm測定吸光度測定吸光度,作圖。作圖。PDT:Ru=2:1等摩爾連續(xù)變化法等摩爾連續(xù)變化法固定固定M+L,改變改變M,獲得一系列吸光度值，獲得一系列吸光度值，吸光度最大的值所對應(yīng)的吸光度最大的值所對應(yīng)的M與與L的比值，即的比值，即獲得獲得M:L比值。比值。Co(III)與與3，5二氯二氯PADAT的比值為的比值為