家族及在細胞凋亡中的作用

1、caspase家族及在細胞凋亡中的作用admin注:本文僅是基礎知識，目前這方面進展十分快，需要更新更多的知識。如caspase家族目前發(fā)現(xiàn)至少14種。這里僅介紹幾種常見的成員。目的是讓大家了解到caspase家族的概況，以及在細胞凋亡中的作用。一 caspase家族蛋白酶的組成未活化的caspase家族蛋白酶是以酶原形式存在的，酶原的氨基端有一段被稱為“原結(jié)構(gòu)域”(pro-domain)的序列。酶原活化時不但要將原結(jié)構(gòu)域切除，并且要將剩余部分剪切成一大一小兩個亞基，分別稱為P20和P10，活性酶就是由這兩種亞基以(P20/P10)2的形式組成的。這種活化反應也是Asp特異的，剪切發(fā)生在酶原中

2、保守序列的Asp與其后的氨基酸殘基之間，一般是先切下羧基端的小亞基，然后再從大亞基的氨基端切去原結(jié)構(gòu)域。這種剪切可以是酶原及中間活性酶自我催化，也可以是其它ICE家族蛋白酶的作用，還有其它酶類如顆粒酶B參與。表5. caspase家族蛋白酶的識別序列及作用底物蛋白酶名稱別名識別序列底物caspase 1ICEYVADpro-IL-1b , pro-caspase 3, pro-caspase 4caspase 4TX, ICH-2, ICErel-IIpro-caspase 1caspase 5ICErel-III, TYmICH3mICH4caspase 2ICH-1PARPcaspase

3、9ICE-LAP6, Mch6PARPcaspase 3CPP32, Yama, apopainDEVDPARP, DNA-PK, SRE/BP, rho-GDI, KCqcaspase 6Mch2VEIDlamin Acaspase 7Mch3, ICE-LAP3, CMH-1DEVDPARP, pro-caspase 6caspase 8MACH, FLICE, Mch5DEVDpro-caspase3,4,7,9,10caspase 10Mch4YVADcaspase 11ICH3, FLICE2CED-3已命名的caspase家族成員均已克隆成功，它們不但在氨基酸序列上具有同源性，而且

4、在空間結(jié)構(gòu)上也很相似。目前已經(jīng)獲得了caspase-1(ICE)和caspase-3(CPP32)的X線結(jié)晶圖像，結(jié)果顯示它們具有相似的空間結(jié)構(gòu)，在P20的C端和P10的N端有200多個氨基酸殘基的序列尤為保守，在空間結(jié)構(gòu)上組成相似的b 折疊中心和相鄰的a 螺旋，保守的、對蛋白酶活性有特殊意義的氨基酸殘基均位于這一段，并形成特定的結(jié)構(gòu)。不同源的序列主要存在于P20的N端和P20與P10交界處，這兩個部位的氨基酸殘基在蛋白酶活化過程中一般被全部或部分切除。所有的成員都保守性地包含有與底物P1Asp作用的氨基酸殘基，如在ICE中，它們是催化中心的Cys285，與酶/抑制劑復合物的巰基半縮醛以氫鍵結(jié)

5、合的His237，以及可以穩(wěn)定反應中間物氧陰離子的Gly238。另外，Arg179、Arg341、Gln383和Ser347形成容納P1Asp的“口袋”，Ser339靠近Cys285的巰基，以氫鍵結(jié)合P1位的酰胺。與P2P4作用的氨基酸殘基則變異比較大，這可能是各個成員識別不同底物的特異性之所在。在活性Cys周圍的氨基酸序列也很保守，一般都有Gln-Ala-Cys-Arg-Gly(QACRG)五肽序列，在caspase-8、caspase-10中為QACQG，在caspase-9中是QACGG，這三個成員都有一個氨基酸殘基的變異，但這種變異不影響蛋白酶的剪切活性和特異性。 二 caspase家

6、族蛋白酶的結(jié)構(gòu)與功能按照結(jié)構(gòu)同源性的大小，可以將caspase蛋白酶分為三個組，分別以caspase-1、caspase-2和caspase-3為代表。其中最重要的是caspase-1、caspase-3和caspase-8。(一)caspase-1(ICE)(二)caspase-3(三)caspase-8(四)其它caspase蛋白酶(一)caspase-1(ICE)1. ICE的結(jié)構(gòu)與生物學作用ICE即IL-1b 轉(zhuǎn)化酶(IL-1b converting enzyme)，是單核細胞合成的一種蛋白酶，可以將34kD的IL-1b 前體(pro-IL-1b )剪切為17kD的成熟IL-1b ，這

7、種剪切對于IL-1b 活性的發(fā)揮是必須的。不表達ICE的細胞系轉(zhuǎn)化IL-1b 基因后可以產(chǎn)生pro-IL-1b ，但不能分泌有活性的成熟IL-1b ；ICE特異性抑制劑可以阻斷金黃色葡萄球菌刺激引起的IL-1b 的分泌。ICE屬于半胱氨酸蛋白酶，活性中心有高活性的巰基，對氧化劑很敏感，但對絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶或天冬氨酸蛋白酶的抑制劑不敏感。(1)ICE活化時的剪切過程：ICE基因定位于11q13-23，編碼的ICE前體(pro-ICE)全長404aa，約45kD，蛋白酶活性中心是位于283287位置的Gln-Ala-Cys-Arg-Gly(QACRG)五肽序列，其中Cys285是發(fā)揮酶切活

8、性的關鍵殘基。在活化過程中pro-ICE在4個位點Asp103Ser104、Asp119Asn120、Asp297Ser298和Asp316Ala317進行自我催化剪切形成兩個片段P20和P10，P20和P10首先形成異源二聚體，然后兩個P20/P10異源二聚體再通過P10小亞基多聚化形成同源二聚體，所以ICE的活性形式是(P20/P10)2。pro-ICE活化過程中的剪切并不是在四個酶切位點同時進行的，最先被剪切的是第三個位點(Asp297Ser298)，形成P35和P12兩個片段，P35的酶切活性比pro-ICE要高，它既可以進一步在第三個酶切位點剪切其它pro-ICE，還可以剪切其它三個

9、酶切位點，形成P20和P10兩個片段，再由P20和P10形成四聚體。四聚體形式的ICE酶切活性非常強，實驗證明即使在單核細胞大量分泌IL-1b 時，細胞漿中活性形式的ICE也僅占很小的比例。從pro-ICE上剪切下來的原結(jié)構(gòu)域可以抑制ICE的進一步剪切，這可能是一種反饋機制。(2)ICE識別的剪切位點和特異性抑制劑：ICE識別的剪切位點是一個四肽序列，除了在P1位置的Asp外，還要求在P4位置的氨基酸殘基具有一個較大的疏水性集團，P2和P3位置上的氨基酸的變異則較大，P1位置上一般是一個較小的疏水性氨基酸。根據(jù)這一研究結(jié)果，人們合成了ICE的人工特異性四肽底物YVAD，醛化的YVAD(Ac-Y

10、VAD-CHO)是ICE的特異可逆抑制劑，醯酮化YVAD(Ac-YVAD-CMK)是特異性不可逆抑制劑。YVAD抑制劑可以抑制單核細胞中成熟IL-1b 的釋放，而對其它細胞因子的釋放沒有作用，在體的實驗也有同樣的結(jié)果，說明這些特異性抑制可能具有一定的臨床實用前景。牛痘病毒產(chǎn)生的一種38kD的蛋白質(zhì)CrmA(cytokine response modifier A)與絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)很相似，但它并不抑制絲氨酸蛋白酶的活性，反而抑制ICE的活性。研究發(fā)現(xiàn)這是因為CrmA的氨基酸序列中有LVAD四肽結(jié)構(gòu)，與ICE的特異性抑制劑YVAD很相似，可以作為假底物結(jié)合ICE，阻斷ICE對p

11、ro-IL-1b 的剪切，從而降低IL-1b 的分泌。所以CrmA在病毒感染時可以干擾宿主的炎癥反應，促進病毒在體內(nèi)的復制。(3)ICE的空間構(gòu)型：利用不可逆的抑制劑Ac-YVAD-CMK，Walker等于1994年獲得了活性ICE的X線結(jié)晶圖像。分析發(fā)現(xiàn)，ICE是首先由P20/P10構(gòu)成一個完整的結(jié)構(gòu)域，然后兩個相同的結(jié)構(gòu)域再通過P10結(jié)合成一個蛋白酶。在P20/P10異源二聚體中，中心位置是由6個b 折疊股組成，其中4個來自于P20呈平行排列，另兩個來自P10，其中一個與P20的4個折疊股平行排列，另一個則呈反平行排列。b 折疊股形成的核心周圍是由分別來自P20和P10的a 螺旋所包圍。兩

12、個P20/P10異源二聚體以反平行方式通過P10結(jié)合在一起，在外表形成一個可以容納底物P1Asp側(cè)鏈羧基基團的“口袋”。這個“口袋”由P20的Arg179、Gln283和P10的Arg341、Ser347組成，Gly238和His237也參與這種構(gòu)型的維持，活性中心的Cys285通過氫鍵與底物結(jié)合。對ICE/CED-3家族其它成員的研究發(fā)現(xiàn)，在ICE中形成活性中心的氨基酸序列和形成容納底物的“口袋”的四個氨基酸都很保守，提示它們可能具有相似的空間結(jié)構(gòu)。2. ICE在細胞凋亡中的作用Yuan等于1993年將CED-3基因克隆出來，發(fā)現(xiàn)它所編碼的蛋白質(zhì)的與人ICE很相似，在一級結(jié)構(gòu)上有28%的同源

13、性。CED-3包含503個氨基酸殘基，有100aa富含絲氨酸，與ICE的同源性主要表現(xiàn)在非富含絲氨酸的區(qū)域，尤其是羧基端的115aa，與ICE同源性高達43%，其中也包含活性中心QACRG(361365)。CED-3可能象ICE一樣，也是一種半胱氨酸蛋白酶，通過剪切底物蛋白來參與細胞凋亡。ICE是人體中CED-3的同源物，可以發(fā)揮與CED-3相似的作用，參與人體細胞的凋亡過程。用ATP或過量內(nèi)素毒素刺激單核細胞，可以通過活化ICE增加IL-1b 的分泌，這些刺激同時也可以促進細胞凋亡。將ICE cDNA轉(zhuǎn)染入大鼠成纖維細胞系中過量表達ICE可以引起細胞凋亡，這種凋亡可以被牛痘病毒蛋白CrmA或

14、細胞凋亡拮抗蛋白BCL-2所抑制；如果在轉(zhuǎn)染前將ICE基因中編碼酶切活性中心的氨基酸殘基(Cys285、Gly287)突變，則不能誘導細胞發(fā)生凋亡；將CrmA導入雞背根神經(jīng)節(jié)細胞可以阻斷撤除神經(jīng)生長因子而引起的神經(jīng)元細胞的凋亡過程。但是有些研究與上述結(jié)果不相吻合：穩(wěn)定高表達IL-1b 的細胞系并不自動發(fā)生凋亡；ICE基因剔除的小鼠雖然不能分泌成熟IL-b ，但其發(fā)育并不受影響，也不發(fā)生自身免疫性疾病，這些小鼠的胸腺細胞和巨噬細胞在受到特定信號刺激后仍能發(fā)生凋亡；在具有ICE活性的細胞中用YVAD抑制ICE活性后，細胞凋亡過程也不受影響；凋亡的雞細胞DU249的細胞提取液不具有剪切pro-IL-

15、1b 的能力，但凋亡的DU249細胞提取液的另一種成分prICE(proteolytic resembling ICE)則可以將不能作為ICE底物的PARP剪切成典型的凋亡片段。這些結(jié)果說明ICE本身可能不是人體細胞凋亡的真正效應劑，至少不是最主要的因素，在人體中可能有其它更重要的ICE樣的蛋白酶參與細胞凋亡過程。(二)caspase-31994年Fernandez-Alnemri等在BenBank表達序列標記(expression sequence tag, EST)數(shù)據(jù)庫中找到一段ICE/CED-3活性中心同源的序列，用它合成探針后，篩選人Jurkat T淋巴細胞cDNA文庫，從中克隆到一

16、種新基因，因其編碼分子量為32kD的半胱氨酸蛋白酶而稱之為CPP32(cysteine protease protein, 32kD)。隨后，其它學者獨立地將這一蛋白基因克隆出來，并分別命名為prICE、apopain(凋亡素)和Yama(印度傳說中的死亡之神)。1996年這種蛋白酶被命名為caspase-3?，F(xiàn)在一般認為caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是CTL細胞殺傷機制的重要組成部分。1. caspase-3的結(jié)構(gòu)pro-caspase-3含有277個氨基酸殘基，分子量約32kD，與ICE有30%同源性，與CED-3有35%同源，是caspase家族中與CED-3同

17、源性最高的，不論從結(jié)構(gòu)同源性還是從底物特異性來看都與CED-3很相似，所以有人認為它是CED-3在哺乳動物中的同源蛋白。caspase-3的原結(jié)構(gòu)域明顯短于ICE只有28個氨基酸殘基，但蛋白酶活性中心和與結(jié)合底物有關的保守的氨基酸均與ICE一致。pro-caspase-3在活化過程中從Asp28Ser29和Asp175Ser176兩處被剪切，形成P17(29175)和P10(182277)兩個片段，相當于ICE的P20和P10，兩種亞基再組成活性形式的caspase-3。pro-caspase-3本身并沒有催化活性，在活化時首先由顆粒酶B(GrzB)或caspase-10在D175剪切下小片段

18、后它才被部分活化，隨后則可進行下一步的自我催化。在剪切原結(jié)構(gòu)域時可能還有其它caspase如ICE的參與。2. caspase-3的活化和參與細胞凋亡caspase-3在細胞凋亡中起著不可替代的作用，caspase-3基因轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細胞后引起細胞凋亡，這個過程可以被BCL-2阻斷；在發(fā)生凋亡的細胞提取液中去除caspase-3后，這些提取液就失去了誘導細胞凋亡的能力；再加入純化的caspase-3它就又恢復了致凋亡的功能。caspase-3可以被多種因素活化，在CTL細胞的殺傷作用中，它既可被Fas/FasL途徑活化，也可以通過顆粒酶B途徑活化。顆粒酶B是CTL細胞顆粒中的一種絲氨酸酯酶，

19、是哺乳動物中caspase蛋白酶外唯一的在Asp后剪切的蛋白酶，它可以特異性剪切ICE家族蛋白酶催化亞單位C端的IxxD序列，并活化caspase 2、3、6、7、8、9、10。ICE也可以被顆粒酶剪切，但剪切后并不被活化。3. caspase-3引起細胞凋亡的機制caspase-3最主要的底物是多聚(ADP-核糖)聚合酶PARP(poly(ADP-ribose) polymerase)，該酶與DNA修復、基因完整性監(jiān)護有關。在細胞凋亡啟動時，116kD的PARP在Asp216-Gly217之間被caspase-3剪切成31kD和85kD兩個片段，使PARP中與DNA結(jié)合的兩個鋅指結(jié)構(gòu)與羧基端

20、的催化區(qū)域分離，不能發(fā)揮正常功能。結(jié)果使受PARP負調(diào)控影響的Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶的活性增高，裂解核小體間的DNA，引起細胞凋亡。這種裂解過程可被caspase-3的特異性抑制劑Ac-DEVD-CHO所抑制，但不能被CrmA抑制。caspase 3還可以剪切U1-70K、DNA-PK、PKCd 和PKCq。PKCd 和PKCq 都屬于新型PKC(novel PKC, nPKC)，當被caspase 3剪切后，可以切除調(diào)節(jié)區(qū)域，而成為活性形式的PKC，另外實驗還證明，過量表達PKCd 和PKCq 均可以引起細胞凋亡，說明它們都參與了細胞凋亡的誘導。(三)caspase-8在casp

21、ase-8發(fā)現(xiàn)之前，人們雖然知道多種細胞膜外的因素可以引起細胞凋亡，而且知道caspase家族蛋白是這種細胞凋亡過程中的效應物質(zhì)，但對凋亡信號如何由細胞膜外轉(zhuǎn)遞到細胞漿，并如何引起caspase蛋白酶活化的過程卻知之甚少。含有死亡結(jié)構(gòu)域的胞漿信號蛋白的發(fā)現(xiàn)，證明死亡信號是通過這些蛋白質(zhì)向胞漿內(nèi)部傳遞，并最終引起caspase蛋白酶的活化的。1995年Enari等證明CrmA可以阻斷Fas與TNFRI引起的細胞凋亡，并且發(fā)現(xiàn)在Fas和TNFRI活化時有caspase-3和caspase-7的活化，而CrmA在阻斷細胞凋亡的同時也抑制了caspase-3和caspase-7的活化，這說明caspa

22、se-3、caspase-7等ICE家族蛋白酶參與了Fas和TNFRI引起的細胞凋亡過程，并且提示CrmA可以通過抑制caspase-3、caspase-7的上游ICE樣蛋白酶來阻斷凋亡過程。之后Kischkel等發(fā)現(xiàn)Fas活化時可以與至少4種蛋白相連，分別稱為CAP1(cytotoxicity-dependent APO-1-associated proteins 1)、CAP2、CAP3和CAP4，這4種蛋白與活化的Fas受體一起被稱為死亡誘導信號復合物(death-inducing signaling complex, DISC)。隨后的研究證實CAP1和CAP2是不同形式絲氨酸磷酸化的

23、FADD蛋白，CAP3和CAP4則被證明是一種新蛋白的兩種不同剪接形式，這個蛋白被命名為FLICE(FADD-like ICE)。同年，另兩組研究者分別用酵母雙雜交系統(tǒng)和根據(jù)蛋白的同源性也發(fā)現(xiàn)了這個蛋白，分別將其命名為MACH(MORT1-associated CED-3 homolog)和Mch5(mammalian Ced homolog 5)，這個蛋白質(zhì)就是后來統(tǒng)一命名的caspase-8。1. caspase-8的結(jié)構(gòu)和分布Caspase-8前體共有479aa，分子量為55kD，其顯著的特點是在N端有2個70aa左右的結(jié)構(gòu)域，與FADD的N端的死亡效應結(jié)構(gòu)域(death effecto

24、r domain, DED)同源，這種同源的結(jié)構(gòu)域可以發(fā)生相互聚合，提供了caspase-8與FADD相互結(jié)合的一個部位。caspase-8的C端與ICE結(jié)構(gòu)同源，它的活性中心與其它ICE家族蛋白酶活性中心有所不同，不是通常的QACRG，而是由QACQG五肽組成，但這樣的結(jié)構(gòu)不影響其蛋白酶活性的發(fā)揮。caspase-8一級結(jié)構(gòu)中其它與結(jié)合底物有關的氨基酸殘基都很保守。caspase-8分布于胎兒和成人的各種組織中，但在胎腦中沒有分布。在外周血白細胞中水平較高，可能與白細胞的凋亡有關。2. caspase-8的活化和參與細胞凋亡caspase-8可以自我活化，也可以在顆粒酶B的剪切下活化。cas

25、pase 8特異性識別的序列是DEVD，活化的caspase-8不但可以剪切PARP，而且還參與其它ICE家族蛋白酶，如caspase-3和caspase-7的活化過程。用caspase-8基因轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細胞系，可以引起細胞凋亡，出現(xiàn)典型的形態(tài)變化。caspase-8引起的細胞凋亡可以被廣譜的ICE家族蛋白酶抑制z-VAD-fmk所阻斷，也可以被CrmA阻斷，提示它可能是CrmA的靶蛋白。3. caspase-8參與細胞凋亡的機制由于caspase-8具有FADD樣DED結(jié)構(gòu)域，并且能夠通過DED結(jié)構(gòu)域與FADD結(jié)合，所以caspase-8可以在凋亡過程中間接與細胞膜受體發(fā)生聯(lián)系，從

26、而將細胞膜事件轉(zhuǎn)化為細胞漿事件。他們認為，在非活化情況下caspase-8的兩個FADD樣DED結(jié)構(gòu)是互相結(jié)合在一起的。當細胞膜表面的Fas與其配體FasL或相應的單抗結(jié)合后，受體發(fā)生多聚化，引起FADD與受體胞漿區(qū)死亡結(jié)構(gòu)域互相結(jié)合。這種結(jié)合使FADD的DED結(jié)構(gòu)域發(fā)生變構(gòu)，變構(gòu)后的DED可以與胞漿中caspase-8的一個DED結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使caspase-8的兩個DED結(jié)構(gòu)域分開，同時使caspase-8的ICE同源區(qū)解放出來，恢復蛋白酶活性，通過自我催化生成活性形式的caspase-8蛋白酶，后者再作用于胞漿中其它ICE家族蛋白酶，使它們發(fā)生逐級活化。(四)其它caspase蛋白酶1.

27、 caspase-2Kumar等首先在小鼠胚腦中發(fā)現(xiàn)了一種稱為Nedd-2(neuronally-expressed, developmentally downregulated)的蛋白酶，這種蛋白酶隨著動物的成熟其表達水平逐步下降，在成年鼠腦中找不到Nedd-2的表達。Wang等利用鼠Nedd-2作為探針，篩選人胚腦cDNA文庫，獲得兩條與鼠Nedd-2高度同源的cDNA序列，并命名為ICH-1(ICE and CED-3 homolog 1)。由于不同剪接，ICH-1可以編碼兩個基因產(chǎn)物：ICH-1L長435aa，其中原結(jié)構(gòu)域長123aa，301305有以半胱氨酸為中心的活性位點QACRG

28、，含有與ICE和CED-2相似的序列，分別有28%和27%同源性，高表達可引起哺乳動物細胞凋亡；另一種基因產(chǎn)物ICH-1S長312aa，高表達則能抑制細胞凋亡。ICH-1L促凋亡的作用可以被BCL-2所阻斷，但不被CrmA所阻斷。Northern Blot和反轉(zhuǎn)錄-PCR證實，caspase-2的表達與組織的發(fā)育階段有關。ICH-1L和ICH-1S均表達于心臟、腎和腦，但ICH-1S在胚腦中表達最高，而ICH-1H在成年胸腺中表達最高。在細胞發(fā)生凋亡時，48kDa的caspase-2首先被一種caspase-3樣蛋白酶在Asp316剪切成p33和p14，然后再緩慢地在Asp152和Asp330

29、處剪切為p18和p12組成的活性蛋白酶，后一過程要在23h后才能完成。caspase-2可能參與CTL細胞的殺傷作用，但它并不能被顆粒酶B直接活化，必須被一種caspase-3樣蛋白酶活化。2. caspase-4caspase-4是1995年Kamens等在松馳雜交(low stringency hybridization)的條件下用人ICE基因探針篩選人胸腺細胞cDNA文庫，找到的一個與ICE和CED-3同源的基因，當時將它命名為ICH-2(ICE and CED-3 homolog 2)。同年另外兩組科學家也分別獨立地發(fā)現(xiàn)了這個基因，并分別命名為TX和ICErel-II。caspase-

30、4基因定位于人染色體11q22.2-22.3，所編碼的蛋白包含377aa，分子量約43kD，一級結(jié)構(gòu)與ICE有53%的同源性，在切除104aa的原結(jié)構(gòu)域后同源性更高達60%，所有與酶活性中心(QACRG)和與結(jié)合底物有關的氨基酸殘基都得到了保留。caspase-4分布較廣，除腦組織外在所有檢測的組織中都有表達。雖然caspase 4與ICE高度同源，但它并不能催化pro-IL-1b 為成熟分子，但可以活化ICE前體及其自身的前體。caspase 4不能剪切DNA-PK，ICE敏感的抑制劑YVAD-CHO可以阻斷caspase 4的活性，但其敏感性僅為ICE的1/20。caspase-4的活性形

31、式也是由P20和P10兩種亞基組成。將caspase-4基因轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細胞系可以引起典型的凋亡變化，提示caspase-4在細胞凋亡中起一定的作用。3. caspase-5caspase 5是Munday等發(fā)現(xiàn)caspase 4(ICErel-II)時同時發(fā)現(xiàn)的一種蛋白，當時命名為ICErel-III，另外一組研究者則命名為TY。caspase-5包含418aa，分子量47.7kD，與ICE有51%的同源性，并具有保守的活性中心QACRG。但caspase-5不能剪切pro-IL-1b ，在過量表達時可以誘導凋亡的發(fā)生。4. caspase-6caspase 6是通過搜索有保守的QACRG

32、活性中心和GSWFI保守的抑制劑結(jié)合位點的方法用PCR的手段找到的，命名為Mch2，與caspase-3有38%同源性，可以在昆蟲細胞中引起細胞凋亡。隨后的研究證明，caspase 6可以剪切層蛋白B，而且其活性對Zn2+敏感，這是唯一一個可以剪切層蛋白的caspase。caspase識別的序列也是VEID。它不能剪切U1-70K和DNA-PK，但可以部分剪切PARP，并可活化caspase 3。5. caspase-7caspase 7是通過PCR擴增caspase保守序列得到的，稱為Mch3(mammalian Ced homolog 3)，另外也被稱為ICE-LAP3(ICE like

33、apoptotic protease 3)和CMH1(CPP32/Mch2 homolog 1)。caspase-7包含304aa，分子量35kD，caspase-7是與caspase-3同源性最高的成員，有58%的同源性，與其它caspase有35%的同源性。caspase-7與caspase-3的同源區(qū)主要在具有酶活性的亞單位區(qū)，它也保留了QACRG(184188)五肽活性中心，與底物結(jié)合的氨基酸殘基也都存在。caspase-7可以分別在Asp23Ala24、Asp198Ser199和Asp206Ala207之間被剪切，形成P20/P12形式的caspase-7。caspase-7分布很廣

34、泛，在腦中也有少量存在。用抗caspase-7的單抗發(fā)現(xiàn)caspase-7在Jurkat細胞中主要分布于胞漿和近膜結(jié)構(gòu)中，細胞核中未見分布。用caspase-7基因轉(zhuǎn)染乳腺癌細胞系發(fā)現(xiàn)全長蛋白不能引起細胞凋亡，但去除氨基端53aa (其中包括原結(jié)構(gòu)域)的caspase-7則可以引起細胞凋亡。進一步研究證明去除原結(jié)構(gòu)域的caspase-7具有自催化作用，可以自動催化成P10/P12形式。酶活性中心的半胱氨酸對caspase-7的這種作用十分重要，突變?yōu)锳la后就失去致凋亡作用。當Fas和TNF引起的細胞凋亡時細胞內(nèi)caspase-7也被活化，CrmA可以阻斷caspase-7引起的細胞凋亡。ca

35、spase 7不能剪切pro-IL-1b ，但它可以剪切PARP和固醇調(diào)節(jié)元件，caspase-7對PARP的剪切可以被DEVD-CHO所阻斷，但不能被ICE敏感的YVAD-CHO所阻斷。caspase- 7對DEVD-CHO抑制劑的敏感性只有caspase-3的1/3，對CrmA則很不敏感。6. caspase-9通過搜索人類基因組數(shù)據(jù)庫中與caspase-7同源的序列，Duan等找到一個命名為ICE-LAP6的基因序列，編碼414aa，分子量46kD。序列分析表明它也屬于ICE/CED-3家族，在相當于ICE活性部分的序列中，caspase-9與其它成員有30%左右的同源性，它的原結(jié)構(gòu)域很

36、長，與caspase-3相似。在caspase-9中與結(jié)合底物有關的6個氨基酸殘基都得到了保留，但它的酶活性中心的五肽序列與其它ICE/CED-3蛋白酶的QACRT不同，是QACGG，這是繼caspase-8的QACQG之后出現(xiàn)的另一種活性中心變異，這種變異也不影響蛋白酶的酶切活性。caspase-8的分布很廣泛，在許多胚胎和成人組織中都有分布。顆粒酶B可以活化caspase-8，活化后可以剪切PARP。乳腺癌細胞系MCF7轉(zhuǎn)染caspase-8基因后出現(xiàn)凋亡，這種作用可以被z-VAD fmk所阻斷。當活性中心的半胱氨酸被突變后，caspase-8失去促凋亡的作用。7. caspase-10A

37、lnemri等于1996年通過在GenBank中尋找caspase-3的表達序列標記，從人Jurkat T淋巴細胞cDNA文庫中同時克隆出caspase-8和caspase-10，分別命名為Mch5和Mch4。caspase-10含有497aa，分子量55kD，與其它成員有3050%的同源性。caspase-10分子結(jié)構(gòu)的顯著特點是其N端也有兩個FADD氨基端樣結(jié)構(gòu)域，所以它也可能與caspase-8一樣是將細胞膜事件轉(zhuǎn)化為細胞漿事件的一個環(huán)節(jié)。caspase-10的酶活性中心也與caspase-8一樣，是QACQG，而不是一般的QACRG五肽序列。caspase-10分布廣泛，基因定位于2p12，基因轉(zhuǎn)染昆蟲細胞系Sf9中可以引起細胞凋亡，其活性可以被DEVD-CHO所抑制。8. caspase-11Yuan等于1996年從小鼠胸腺細胞cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)，命名為ICH-3。373aa，42kDa，與ICE有46%同源性，活性中心為QACRG，ICE中與催化活性有關的氨基酸殘基得到了保留，包括His206、Gly207和Cys254，與P1結(jié)合有關的氨基酸殘基也保守，包括Arg148、Gln252、Arg310和Ser316。caspase-11表達于許多組織，與ICE表達模式相似，并可以被LPS所誘導。在Rat-1細胞中過量表達caspase-11可以引起細胞凋亡，C