小鼠精子畸形試驗(yàn)

1、小鼠精子畸形試驗(yàn)一、目的與要求1,熟悉精子畸形的概念及類型、精子畸形試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、試驗(yàn)檢測(cè)的遺傳學(xué)終點(diǎn)。2 .學(xué)習(xí)和掌握小鼠精子畸形試驗(yàn)的基本方法步驟，正常精子及畸形精子的鏡下觀察。3 ,了解精子畸形試驗(yàn)數(shù)據(jù)整理、分析方法及結(jié)果的評(píng)價(jià)。二、實(shí)驗(yàn)原理精子的畸形主要是指精子形態(tài)的異常改變，大、小鼠精子畸形受基因控制，具有高度遺傳性，許多常染色體及X、Y性染色體基因直接或間接地決定精子形態(tài)。因此精子形態(tài)的改變提示有關(guān)基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的改變。大、小鼠精子畸形試驗(yàn)可檢測(cè)受試物對(duì)于精子生成、發(fā)育的影響，而且對(duì)已知的生殖細(xì)胞致突變物有高度敏感性，故精子畸形試驗(yàn)可用作檢測(cè)受試物在體內(nèi)對(duì)生殖細(xì)胞的致突變作用

2、。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1 .動(dòng)物選擇：一般采用小鼠，因?yàn)樾∈蟊容^經(jīng)濟(jì)，且有大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)小鼠在該實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中對(duì)受試物最為敏感。68周齡（體重2535g）,雄性。每組應(yīng)保證至少有5只存活小鼠。2 .染毒途徑：多用腹腔注射，也可采用與人體實(shí)際接觸化學(xué)毒物相同的途徑，如經(jīng)口、吸入及皮膚接觸等。3,染毒次數(shù)及取樣時(shí)間：可采用1次或每天1次連續(xù)5天的方法進(jìn)行染毒。各種化學(xué)毒物作用于精子的不同發(fā)育階段，可在接觸某種化學(xué)毒物后不同時(shí)間出現(xiàn)精子畸形，故有條件時(shí)，可于給受試物后第1、4、10周處死動(dòng)物，檢查精子形態(tài)。因?yàn)榇蟛糠只瘜W(xué)毒物對(duì)精原細(xì)胞后期或初級(jí)精母細(xì)胞早期的生殖細(xì)胞較為敏感，故一般均是于首次給受試物后的第3

3、5天處死。4,劑量選擇：至少設(shè)置3個(gè)劑量組。最高劑量組5天總劑量應(yīng)能使部分動(dòng)物死亡，一般可取1/2LD50為高劑量組，然后以1/21/4遞減作為中、低劑量組。另設(shè)溶劑對(duì)照組（陰性對(duì)照組）和陽(yáng)性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照組可用環(huán)磷酰胺（20mg/kg）或甲基磺酸甲酯（75mg/kg）或甲基磺酸乙酯（60mg/kg）進(jìn)行腹腔注射，每天1次，連續(xù)5天。四、操作步驟1 .制片頸椎脫臼處死小鼠，取出雙側(cè)附睪，將附睪放入1ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水中。用眼科剪將附睪縱向剪12下，靜止35min,輕輕搖動(dòng)。用4層擦鏡紙或合成纖維血網(wǎng)袋濾除組織碎片，吸取此精子懸液滴于清潔載玻片一端，均勻推片，待玻片晾干后用甲醇固定5m

4、in以上，自然晾干。用1%2%伊紅染色1小時(shí)，用水輕沖，干燥。2 .閱片在低倍鏡下找到背景清晰、精子重疊較少的區(qū)域，然后用油鏡計(jì)數(shù)。每只小鼠為一觀察單位，計(jì)數(shù)1000條完整的精子中畸形精子數(shù)，計(jì)算各組小鼠精子畸變率。其中有頭無(wú)尾（輪廓不清）、頭部與其他精子或碎片重疊及人為剪碎的精子均不計(jì)算。精子畸形主要表現(xiàn)在頭部，其次為尾部，可分為無(wú)鉤、香蕉形、胖頭、無(wú)定形、尾折疊、雙頭、雙尾等。異常精子均應(yīng)記錄顯微鏡的坐標(biāo)數(shù)，以備復(fù)查。并分別記錄異常類型，以便統(tǒng)計(jì)精子畸形率及精子類型的構(gòu)成比。判斷雙頭、雙尾畸形時(shí)，要注意與兩條精子的部分重疊相鑒別，判斷無(wú)定形時(shí)要與人為剪碎及折疊相鑒別。五、結(jié)果分析及評(píng)價(jià)每只

5、動(dòng)物應(yīng)按精子畸形類型分別記錄，以便計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組的精子畸形發(fā)生率（百分率）和精子畸形類型的構(gòu)成比。利用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)法和其他適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)方法。將受試物各劑量組精子畸形發(fā)生率分別與陰性對(duì)照組進(jìn)行比較。在結(jié)果判斷時(shí)，首先要注意假陽(yáng)性結(jié)果的排除。某些因素可導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)精子畸形率的增高，如變態(tài)反應(yīng)、感染、缺血和體溫升高等。不同品系的小鼠的精子畸形率本底差異值較大，而且影響的因素比較多，故在結(jié)果分析時(shí)，應(yīng)該首先觀察陽(yáng)性和陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照組精子畸形率的增高應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)室的歷史記錄或文獻(xiàn)報(bào)道的范圍之內(nèi)，并與陰性對(duì)照組的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義；陰性對(duì)照組的精子畸形率也應(yīng)與自己實(shí)驗(yàn)室的歷史記錄或文獻(xiàn)報(bào)道相接近，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果可信性較差，需重復(fù)試驗(yàn)。一般正常小鼠的精子畸形率為0.8%3.4%,但每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有自己穩(wěn)定的精子自發(fā)畸形率。精子畸形試驗(yàn)的陽(yáng)性的判斷標(biāo)準(zhǔn)是精子畸形發(fā)生率至少為陰性對(duì)照組的兩倍或經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理有顯著性差異，并存在劑量-反應(yīng)關(guān)系者。或者至少應(yīng)該有兩個(gè)相鄰劑量組的精子畸形率達(dá)到陰性對(duì)照組的兩倍或經(jīng)檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠