尿激酶的制取和檢驗

1、尿激酶的制取和檢驗摘要：尿激酶是由人腎小管上皮細胞產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，是一種堿性蛋白，等電點在PH8.7左右。目前我國主要從男性尿液中提取尿激酶有三種方法：浸泡法、沉淀法、吸附法。生產(chǎn)上多采用吸附法，根據(jù)選用吸附劑的類型又分為樹脂吸附和硅藻土吸附兩種工藝。成品尿激酶為無色（或米色）澄清或白色凍干粉末，每毫克蛋白的活力不得低于120000IU。關(guān)鍵詞：尿激酶；性質(zhì)；工藝；檢驗方法；質(zhì)量標準；正文：尿激酶是從新鮮人尿里提取的一種溶血栓藥物。它能激活纖溶酶原轉(zhuǎn)化為有活性的纖溶酶，纖溶酶能使不溶性的纖維蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苄缘碾?，從而使血栓溶解。因此，臨床上多用于治療血栓形成、血栓栓塞等癥。尿激酶與抗癌

2、劑合用時，由于它能溶解癌細胞周圍的纖維蛋白，使得抗癌劑能更有效地穿入癌細胞，從而提高抗癌劑殺傷癌細胞的能力。所以，尿激酶也是一種很好的癌癥輔助治療劑，而且它是無抗原性問題，可長時間使用。一、產(chǎn)品性質(zhì)尿激酶是由人腎小管上皮細胞產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，是一種堿性蛋白，等電點在PH8.7左右。為白色非結(jié)晶狀粉末，易溶于水。稀溶液性X犬不穩(wěn)定，必須新鮮配用，且不得用酸性溶液稀釋。凍干狀態(tài)可穩(wěn)定數(shù)年。尿激酶是專一性很強的蛋白水解酶。對合成底物的活性與胰蛋白酶和纖溶酶近似，也有酯酶的活力。無抗原性，不使體內(nèi)產(chǎn)生抗體。體內(nèi)半衰期為（14±6）min。尿激酶主要有高分子尿激酶（H-UK）,分子量為5

3、4000和低分子尿激酶（L-UK）,分子量為34000兩種，前者為天然存在形式，后者為H-UK的降解產(chǎn)物。這兩種UK均有生物活性，但從體外進行的酶動力學試驗和臨床表明,H-UK比L-UK更有效，因此臨床使用上均要求以它為主的產(chǎn)品。二、尿激酶制法自20世紀70年代以來，尿激酶的制取方興未艾，精制方法多有報道，但回收率偏低。我國人口眾多，尿源十分豐富，因此以尿為提取尿激酶的原料，比較適合我國國情。由于尿激酶在尿中含量很低，從尿中提取尿激酶的關(guān)鍵是選擇恰當?shù)奈絼?。目前我國主要從男性尿液中提取尿激酶有三種方法：浸泡法、沉淀法、吸附法。生產(chǎn)上多采用吸附法，根據(jù)選用吸附劑的類型又分為樹脂吸附和硅藻土吸附

4、兩種工藝。主要儀器及試劑：752紫外光柵分光光度計（上海第三分析儀器廠生產(chǎn)）;SephadexG-50,CM-SephadexC-50,Bio-GelP-30（Pharmacia）;人纖維蛋白原（上海生物制品研究所生產(chǎn)）；尿激酶標準品，凝血酶，纖維酶原（中國藥品生物制品檢定所生產(chǎn)）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或化學純。UK粗品制備：吸附：用搪瓷缸收集新鮮男性尿，在攪拌下加尿量0.12%（W/V）HD-2樹脂，攪拌吸附50min。用尼龍布過濾，棄去尿液，收集樹脂裝柱；洗脫：將樹脂用少量水洗滌后用0.1%氨水（電導率為22.5mQ）洗脫，收集洗脫液，回收樹脂；鹽析：將洗脫液移入搪瓷桶中，在攪拌下加入固

5、體硫酸錢粉末至0.65飽和度,待全部溶解后，在0c放置68h,然后過濾，收集鹽析物，即得到粗品。SephadexG-50凝膠過濾除鹽：將UK粗品用預(yù)冷至05c的無熱原蒸儲水溶解，制成UK含量為（23）X104IU/mL的UK水溶液，立即用冷凍離心機分離，收集上清液，用2mol/L鹽酸或2mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH6.5。將此溶液上SphadexG-50凝膠柱（此柱預(yù)先用pH6.5,0.1mol/L的磷酸鈉緩沖液平衡），上樣體積控制在柱床體積的15%25%,C集流出液中含UK部分。GM-SephadexC-50離子交換層析：將上述收集到的UK溶上GM-SephadexC-50離子交換層析柱（此

6、柱預(yù)先用PH6.5,0.1mol/L的磷酸鈉緩沖液平衡），力口一個床體積的柱平衡液洗滌后，用0.6mol/L的氯化鈉溶液洗脫，收集UK活力部分。硫酸錢沉淀：在上一工序收集的UK溶液中緩緩加入固體硫酸錢（每升溶液加430克），邊加邊攪拌，直至加入的硫酸錢溶解，隨即用冷凍離心機分離，收集UK冗淀物。Bio-GelP-30凝膠過濾：將UK沉淀物用05c的無熱原蒸儲水溶解，制成UK含量為（510）x10-4IU/mL的溶液，上Bio-GelP-30凝膠柱（此柱預(yù)先用0.3mol/L的氯化鈉溶液平衡）,上樣量控制在柱床體積的8%12%隨時監(jiān)測流出液的UK活力，收集第一個流出峰部分，即H-UK部分。產(chǎn)品的

7、除菌及冷凍干燥：將上工序收集的H-UK溶液添加1%5%）甘露醇做賦形劑（加量多少依產(chǎn)品效價要求和冷凍干燥情況而定），用0.22叱m的微孔濾膜過濾除菌后，立即進行冷凍干燥，冷凍干燥后的UK為粉狀產(chǎn)品，密封于容器內(nèi)置05c下保存。三、尿激酶檢驗3.1生物學活性測定采用溶圈法。稱取125mg瓊脂糖,加入23ml生理鹽水，煮沸溶解,60C水浴平衡，加凝血酶14叱l(100IU/ml),纖溶酶原280叱l(0.5mg/ml),邊加邊搖勻,加入人纖維蛋白原2.2ml(6mg/ml),搖勻，混濁后馬上倒平板(直徑9cm),水平放置，充分凝固后,4C冰箱放置至少0.5h待用(應(yīng)在2d內(nèi)使用)。將尿激酶標準品用

8、生理鹽水稀釋至200、100、50、25和12.5IU/ml待測樣品用生理鹽水稀釋至約50IU/ml(成品)或5g/ml(原液)。在制備好的纖維蛋白平板內(nèi)打孔(直徑2mm),每孔點樣6履每個樣品2孔,放置37c濕盒中16h后，縱橫兩次量取點樣板溶圈直徑，以標準品各個稀釋度活性的對數(shù)為橫坐標(x),溶圈直徑的平均數(shù)(4次量取的數(shù)值)的對數(shù)為縱坐標(y),采用生物統(tǒng)計軟件分析結(jié)果。利用統(tǒng)計學軟件中的回歸分析方法作標準曲線，并求得y=a+bx中的a和b及線性回歸系數(shù)r值，根據(jù)樣品的溶圈直徑，計算樣品活性。2單鏈比例測定采用發(fā)色底物法。將Thermolysin用pH7.5、0.1mol/LNaCl,0

9、.01%Tween-20,0.01mol/L氯化鈣，0.05mol/LTris緩沖液稀釋成3.0mg/L;S-2444用pH7.5、0.1mol/LNaCl,0.01%Tween-20,0.05mol/L,Tris緩沖液稀釋成1.5mg/ml；尿激酶標準品用pH7.5、0.1mol/LNaCl；0.01%Tween-20,0.05mol/L,Tris緩沖液稀釋成100、80、60、40和20IU/ml;u-PA樣品用pH7.5、0.1mol/LNaCl,0.01%Tween-20,0.01mol/L氯化鈣,0.05mol/LTris緩沖液稀釋成40IU/ml。樣品總活性的測定：在96孔酶標板上

10、，分別加入稀釋樣品100履Thermolysin20仙l,37c孵育1h,在激活的樣品中加入Aprotinin(5x105IU/ml)20l和S-2444(1.5mg/ml)60履37c孵育，1.5h內(nèi)每間隔20min,在405nmM測定A值。以反應(yīng)時間為橫坐標，A值為縱坐標，分別作各濃度UK標準品溶液和待檢品的生色速率曲線，線性回歸得出線性方程，得到不同濃度標準品和待檢品直線方程的斜率。以各濃度UK標準品溶液的余率為縱坐標，UK活性的濃度為橫坐標作圖，得到用顯色底物測定UK濃度的標準曲線，線性回歸得到標準方程。將待檢品的生色速率直線的斜率代入標準方程中，可計算出待檢品的活性，再乘以稀釋倍數(shù)，

11、即可得到待測樣品的總活性。樣品雙鏈活性的測定：在96孔酶標板中加入含tcu-PA(40IU/ml)的稀釋樣品100屋，pH7.5Tris緩沖液20履，Aprotinin(5x105IU/ml)20川和S-2444(1.5mg/ml)60履37c孵育，在1.5h內(nèi)每間隔20min,于405nm處測定A值。同4.1法計算出待測樣品中雙鏈活性。單鏈比例的計算：總活性與雙鏈活性之差即為單鏈的活性。單鏈的活性與樣品的總活性之比即為單鏈在樣品中的比例。純度分析采用SECOHPL彷，參照中國藥典三部(2005版)進行。洗脫液：pH7.0,0.1mol/LPB,400mmol/LNaCl,色譜條件：流速0.9ml/min;上樣量10小l(2.0mg/ml),柱溫25C,檢測波長280nm,樣品池溫度8C。用WATER2690HPLC系統(tǒng)對實驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)處理，用面積歸一化法算出其純度。相對分子質(zhì)量測定采用還原型SDSOPAGE。其他指標的檢測等電點、肽圖、蛋白質(zhì)含量、殘留DNA鑒別試驗等按文獻及中國藥典三部(2005版)進行。四、尿激酶質(zhì)量標準成品尿激酶為無色(或米色)澄清或白色凍干粉末，每毫克蛋白的活力不得低于120000IU。參考文獻：1張濟宇，梁堅.尿激酶的提取與應(yīng)用J.科技