懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)講義

1、懸浮細(xì)胞傳代及細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞傳代實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆諔腋〖?xì)胞傳代技術(shù)。進(jìn)一步掌握細(xì)胞培養(yǎng)的操作技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理：培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間后，需分離再培養(yǎng)，否則細(xì)胞因生存空間不夠，細(xì)胞密度過(guò)大，致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不足而引起細(xì)胞發(fā)老、停止生長(zhǎng)甚至死匚。為了維持細(xì)胞的存活和生長(zhǎng)，必須進(jìn)行再培養(yǎng)，即將原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞分離、稀釋、接種到新培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)用品：（一）儀器凈化工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱（4C、-20C、-70C）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱；（二）玻璃器皿吸管（彎頭、直頭）、培養(yǎng)瓶、廢液缸、（三）塑料器皿吸頭、槍頭、膠塞、移液管、15ml離心管、離心管架（四）其他物品微量加樣槍、計(jì)數(shù)板、記號(hào)筆、移液槍?zhuān)ㄎ?/p>

2、）試劑1640培養(yǎng)液、PBS操作步驟：1 .準(zhǔn)備：打開(kāi)培養(yǎng)液，PBS取出離心管，擰開(kāi)管蓋，管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管，裝上吸頭，插入離心管備用。2 .從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞，放在顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)、密度。3 .首先觀察培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)液量。用吸管分別吸出兩個(gè)孔中的細(xì)胞連同培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入離心管中。再另取一只吸管吸取PBS放入培養(yǎng)板孔中，輕輕吹打孔壁,吸出轉(zhuǎn)入離心管。4,離心，設(shè)置離心機(jī)1000轉(zhuǎn)/分，4-5分鐘。5,取出離心管，輕輕吸出上清，倒入廢液缸。吸取培養(yǎng)液約7ML放入離心管,輕輕吹打細(xì)胞，使之均勻懸浮。6,吸取1ML細(xì)胞懸液1ML轉(zhuǎn)入EP管中，備計(jì)數(shù)用。7.其余的細(xì)胞分別放入六個(gè)孔中，

3、每孔約1ML8,吸取培養(yǎng)液加入板孔中至1/3孔容量。9.鏡下觀察細(xì)胞是否分布均勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。二、細(xì)胞計(jì)數(shù)及生長(zhǎng)曲線測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程：潛伏期-指數(shù)增生期-停滯期潛伏期(latentphase)細(xì)胞接種后，先經(jīng)過(guò)一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期.此時(shí),細(xì)胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形,然后細(xì)胞貼附于載體表面，稱(chēng)貼壁,懸浮期結(jié)束,細(xì)胞貼壁速度與細(xì)胞種類(lèi)，培養(yǎng)基成分，載體的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。一般情況下，原代培養(yǎng)細(xì)胞貼壁速度慢，可達(dá)10-24小時(shí)或更多，而傳代細(xì)胞系貼壁速度快，通常10-30分鐘即可貼壁。細(xì)胞貼壁后還需經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期,原代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，約24-96小時(shí)或更長(zhǎng)

4、，連續(xù)細(xì)胞系和月中瘤細(xì)胞潛伏期短，僅需6-24小時(shí)。(2)指數(shù)增生期(logarithmicgrowthphase)這是細(xì)胞增殖最旺盛的階段，分裂相細(xì)胞增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)是否旺盛的一個(gè)重要標(biāo)志。通常以細(xì)胞分裂相指數(shù)(Mitoticindex,MI)表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%-0.5%,原代細(xì)胞分裂指數(shù)較低，而連續(xù)細(xì)胞和月中瘤細(xì)胞分裂相指數(shù)可高達(dá)3%-5%。指數(shù)增生期的細(xì)胞活力最好時(shí)期，是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)最佳時(shí)期，也是凍存細(xì)胞的最好時(shí)機(jī)。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3-5天后，隨著細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長(zhǎng)空間減

5、少，最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。正常細(xì)胞相互接觸后能抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱(chēng)接觸抑制現(xiàn)象(contactinhibition)。而惡性月中瘤細(xì)胞無(wú)接觸抑制現(xiàn)象，能繼續(xù)移動(dòng)和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積(piledup)。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖然發(fā)生接觸抑制，但只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍能進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)仍然在增多。但是，當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)枯竭和代謝產(chǎn)物的影響，導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止，這種現(xiàn)象稱(chēng)密度抑制現(xiàn)象(DensityInhibition)。(3)停滯期(Stagnatephase)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后，如不及時(shí)進(jìn)行傳代，細(xì)胞就

6、會(huì)停止增殖，進(jìn)入停止期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)持平，故也稱(chēng)平臺(tái)期(Plateauphase)。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)。如不進(jìn)行分離傳代，細(xì)胞會(huì)因培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物積聚、pH下降等因素中毒，出現(xiàn)形態(tài)改變，貼壁細(xì)胞會(huì)脫落，嚴(yán)重的會(huì)發(fā)生死亡，因此，應(yīng)及時(shí)傳代。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模? .能獨(dú)立的進(jìn)行細(xì)胞技術(shù)，會(huì)繪制生長(zhǎng)曲線，了解細(xì)胞生長(zhǎng)的發(fā)育特性。2 .學(xué)習(xí)在科研中如何應(yīng)用生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)原理：生長(zhǎng)曲線的測(cè)定(計(jì)數(shù)法)是測(cè)定細(xì)胞絕對(duì)生長(zhǎng)數(shù)的常用方法，也是判定細(xì)胞活力的重要指標(biāo)，為培養(yǎng)細(xì)胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一般細(xì)胞傳代之后，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)短不同的潛伏期，即進(jìn)入大量分裂的指數(shù)生長(zhǎng)期。在細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，停止生

7、長(zhǎng)，進(jìn)入平頂期，然后退化衰亡。為了準(zhǔn)確描述整個(gè)過(guò)程中的細(xì)胞數(shù)目的動(dòng)態(tài)變化，需連續(xù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，通常計(jì)數(shù)7天。為精確起見(jiàn)，一般每次計(jì)數(shù)三瓶細(xì)胞并取平均值。典型的生長(zhǎng)曲線可分為生長(zhǎng)緩慢的潛伏期，成平臺(tái)狀的平頂期及退化衰亡四個(gè)部分。以存活細(xì)胞數(shù)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間做圖，即生長(zhǎng)曲線。生長(zhǎng)曲線常用于測(cè)定藥物等外來(lái)因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。一般在對(duì)數(shù)期的1/3-1/2處加藥。細(xì)胞技術(shù)的時(shí)間和次數(shù)依實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。另外，測(cè)定生長(zhǎng)曲線的常用方法還有MTTWo計(jì)數(shù)板原理：當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過(guò)測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。操作步驟：1 .將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋

8、片蓋在計(jì)數(shù)板，放在鏡下觀察。2 .制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞從培養(yǎng)板孔轉(zhuǎn)移到離心管，離心1000轉(zhuǎn)4-5分鐘，棄去上清，加入PBS至一定體積(1MD。3 .將細(xì)胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，靜置3min,注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑小? .計(jì)算板四大格細(xì)胞總數(shù)，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的。然后按公式計(jì)算：細(xì)胞數(shù)/mL=0大格細(xì)胞總數(shù)/4X104說(shuō)明：公式中除以4,因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。公式中乘以104因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：1.0mm(長(zhǎng))x1.0mm(寬)x0.1mm(高)=0.1mm3而1ml=1000mm3(注意：鏡下偶見(jiàn)有兩個(gè)以上細(xì)胞

9、組成的細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)算，若細(xì)胞團(tuán)10%Z上，說(shuō)明分散不好，需重新稀釋制備細(xì)胞懸液)臺(tái)盼蘭染色操作步驟：1、制備細(xì)胞懸液，放入EP管中。2、以1:1的比例加入0.4%臺(tái)盼蘭染7取,染色23分鐘。3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。4、鏡下取幾個(gè)任意視野分別計(jì)死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活力。凍存與復(fù)蘇一、哺乳動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1)保存種子細(xì)胞，以便隨時(shí)取用。這是保存細(xì)胞的最主要目的。(2)減少細(xì)胞被微生物污染的危險(xiǎn)性。(3)減少細(xì)胞之間交叉污染的危險(xiǎn)性。(4)減少細(xì)胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。(5)避免有限細(xì)胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。實(shí)驗(yàn)原理：細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原

10、則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞碉作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。實(shí)驗(yàn)用品：（一）儀器凈化工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫水浴箱、冰箱（4C、-20C、-70C）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。（二）玻璃器皿吸管（彎頭、直頭）、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸；（三）塑料器皿吸頭、槍頭、膠

11、塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（12ml）（四）其他物品微量加樣槍、紅血球計(jì)數(shù)板、記號(hào)筆、移液槍。（五）試劑1640培養(yǎng)液、DMSO（分析純）K562細(xì)胞，慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系中的一種。操作步驟：1 .準(zhǔn)備：打開(kāi)培養(yǎng)液，PBS取出離心管，擰開(kāi)管蓋，管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管，裝上吸頭，插入離心管備用。2 .配制凍存液：吸取9ML培養(yǎng)液放入離心管，用移液槍吸取1MLDMS潞液，逐滴緩慢加入離心管中。最好把離心管插在冰中。3 .從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細(xì)胞，放在顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)、密度。4 .吸出1個(gè)孔中的細(xì)胞連同培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)入離心管中。再另取一只吸管吸取PBS放入培養(yǎng)板孔中，輕輕

12、吹打孔壁，吸出轉(zhuǎn)入離心管。5 .離心，設(shè)置離心機(jī)1000轉(zhuǎn)4-5分鐘。取出離心管，輕輕吸出上清，倒入廢液缸。輕輕吸出余下的培養(yǎng)液，注意勿吸出細(xì)胞沉淀。6 .吸取1ML配制好的凍存液加入離心管，與細(xì)胞混勻后，轉(zhuǎn)入凍存管。7 .標(biāo)注：標(biāo)明細(xì)胞種類(lèi)、凍存日期，凍存人。8 .在4c冰箱中放置30分鐘；然后轉(zhuǎn)入-20C,放置30分鐘；然后再轉(zhuǎn)入-80C放置16-18小時(shí)(或過(guò)夜)；最后放入液氮中長(zhǎng)期保存。有條件的地方，可用凍存盒。注意事項(xiàng)：(1)凍存過(guò)程需緩慢(2)凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力大于90%,無(wú)微生物污染。(3)細(xì)胞濃度控制在：1X1075X107/ml。(4)使用合適的細(xì)胞冷凍保護(hù)劑，

13、以保護(hù)細(xì)胞在冷凍過(guò)程中免受冰晶破壞。目前，最常用的冷凍保護(hù)劑是DMSO：甲基亞碉)，使用終濃度為510%。但是，有些細(xì)胞系不能用DMSO為冷凍保護(hù)劑，如人白血病細(xì)胞系HL-60。因?yàn)?，DMSOTg誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化。在這種情況下，可選用其它冷凍保護(hù)劑，如甘油(glycele),羥乙基淀粉等。(5)DMSO釋時(shí)會(huì)釋放大量熱量。因此，DMSO能直接加到細(xì)胞液中，必須事先配制。細(xì)胞復(fù)蘇操作步驟：(一)準(zhǔn)備工作1、37c水浴2、準(zhǔn)備一個(gè)內(nèi)裝5-10ml細(xì)胞完全培養(yǎng)液離心管。(二)復(fù)蘇1、帶手套，用銀子將細(xì)胞冷凍管從液氮中取出，迅速放入37c水浴中，手持凍存管不斷搖動(dòng)。觀察完全解凍后移入超凈臺(tái)。冷凍管在水浴中解凍時(shí)，液面不