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文檔簡介

1、懸浮細胞傳代及細胞計數(shù)細胞傳代實驗?zāi)康模赫莆諔腋〖毎麄鞔夹g(shù)。進一步掌握細胞培養(yǎng)的操作技術(shù)。實驗原理:培養(yǎng)細胞生長一定時間后,需分離再培養(yǎng),否則細胞因生存空間不夠,細胞密度過大,致營養(yǎng)不足而引起細胞發(fā)老、停止生長甚至死匚。為了維持細胞的存活和生長,必須進行再培養(yǎng),即將原培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞分離、稀釋、接種到新培養(yǎng)瓶內(nèi)繼續(xù)擴大培養(yǎng)。實驗用品:(一)儀器凈化工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱(4C、-20C、-70C)、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱;(二)玻璃器皿吸管(彎頭、直頭)、培養(yǎng)瓶、廢液缸、(三)塑料器皿吸頭、槍頭、膠塞、移液管、15ml離心管、離心管架(四)其他物品微量加樣槍、計數(shù)板、記號筆、移液槍(五

2、)試劑1640培養(yǎng)液、PBS操作步驟:1 .準備:打開培養(yǎng)液,PBS取出離心管,擰開管蓋,管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管,裝上吸頭,插入離心管備用。2 .從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞,放在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)、密度。3 .首先觀察培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)液量。用吸管分別吸出兩個孔中的細胞連同培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)入離心管中。再另取一只吸管吸取PBS放入培養(yǎng)板孔中,輕輕吹打孔壁,吸出轉(zhuǎn)入離心管。4,離心,設(shè)置離心機1000轉(zhuǎn)/分,4-5分鐘。5,取出離心管,輕輕吸出上清,倒入廢液缸。吸取培養(yǎng)液約7ML放入離心管,輕輕吹打細胞,使之均勻懸浮。6,吸取1ML細胞懸液1ML轉(zhuǎn)入EP管中,備計數(shù)用。7.其余的細胞分別放入六個孔中,

3、每孔約1ML8,吸取培養(yǎng)液加入板孔中至1/3孔容量。9.鏡下觀察細胞是否分布均勻,放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。二、細胞計數(shù)及生長曲線測定培養(yǎng)細胞生長過程:潛伏期-指數(shù)增生期-停滯期潛伏期(latentphase)細胞接種后,先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期.此時,細胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形,然后細胞貼附于載體表面,稱貼壁,懸浮期結(jié)束,細胞貼壁速度與細胞種類,培養(yǎng)基成分,載體的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。一般情況下,原代培養(yǎng)細胞貼壁速度慢,可達10-24小時或更多,而傳代細胞系貼壁速度快,通常10-30分鐘即可貼壁。細胞貼壁后還需經(jīng)過一個潛伏階段,才進入生長和增殖期,原代培養(yǎng)細胞潛伏期長,約24-96小時或更長

4、,連續(xù)細胞系和月中瘤細胞潛伏期短,僅需6-24小時。(2)指數(shù)增生期(logarithmicgrowthphase)這是細胞增殖最旺盛的階段,分裂相細胞增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長是否旺盛的一個重要標志。通常以細胞分裂相指數(shù)(Mitoticindex,MI)表示,即細胞群中每1000個細胞中的分裂相數(shù)。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1%-0.5%,原代細胞分裂指數(shù)較低,而連續(xù)細胞和月中瘤細胞分裂相指數(shù)可高達3%-5%。指數(shù)增生期的細胞活力最好時期,是進行各種實驗最佳時期,也是凍存細胞的最好時機。在接種細胞數(shù)量適宜情況下,指數(shù)增生期持續(xù)3-5天后,隨著細胞數(shù)量不斷增多、生長空間減

5、少,最后細胞相互接觸匯合成片。正常細胞相互接觸后能抑制細胞運動,這種現(xiàn)象稱接觸抑制現(xiàn)象(contactinhibition)。而惡性月中瘤細胞無接觸抑制現(xiàn)象,能繼續(xù)移動和增殖,導(dǎo)致細胞向三維空間擴展,使細胞發(fā)生堆積(piledup)。細胞接觸匯合成片后,雖然發(fā)生接觸抑制,但只要營養(yǎng)充分,細胞仍能進行增殖分裂,因此細胞數(shù)仍然在增多。但是,當細胞密度進一步增大,培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少,代謝產(chǎn)物增多時,細胞因營養(yǎng)枯竭和代謝產(chǎn)物的影響,導(dǎo)致細胞分裂停止,這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象(DensityInhibition)。(3)停滯期(Stagnatephase)細胞數(shù)量達到飽和密度后,如不及時進行傳代,細胞就

6、會停止增殖,進入停止期。此時細胞數(shù)持平,故也稱平臺期(Plateauphase)。停滯期細胞雖不增殖,但仍有代謝活動。如不進行分離傳代,細胞會因培養(yǎng)液中營養(yǎng)耗盡、代謝產(chǎn)物積聚、pH下降等因素中毒,出現(xiàn)形態(tài)改變,貼壁細胞會脫落,嚴重的會發(fā)生死亡,因此,應(yīng)及時傳代。實驗?zāi)康模? .能獨立的進行細胞技術(shù),會繪制生長曲線,了解細胞生長的發(fā)育特性。2 .學(xué)習(xí)在科研中如何應(yīng)用生長曲線實驗原理:生長曲線的測定(計數(shù)法)是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法,也是判定細胞活力的重要指標,為培養(yǎng)細胞生物學(xué)特性的基本參數(shù)之一。一般細胞傳代之后,經(jīng)過長短不同的潛伏期,即進入大量分裂的指數(shù)生長期。在細胞達到飽和密度后,停止生

7、長,進入平頂期,然后退化衰亡。為了準確描述整個過程中的細胞數(shù)目的動態(tài)變化,需連續(xù)對細胞進行計數(shù),通常計數(shù)7天。為精確起見,一般每次計數(shù)三瓶細胞并取平均值。典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期,成平臺狀的平頂期及退化衰亡四個部分。以存活細胞數(shù)對培養(yǎng)時間做圖,即生長曲線。生長曲線常用于測定藥物等外來因素對細胞生長的影響。一般在對數(shù)期的1/3-1/2處加藥。細胞技術(shù)的時間和次數(shù)依實驗?zāi)康亩?。另外,測定生長曲線的常用方法還有MTTWo計數(shù)板原理:當待測細胞懸液中細胞均勻分布時,通過測定一定體積懸液中的細胞的數(shù)目,即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數(shù)目。操作步驟:1 .將計數(shù)板及蓋片擦拭干凈,并將蓋

8、片蓋在計數(shù)板,放在鏡下觀察。2 .制備細胞懸液:細胞從培養(yǎng)板孔轉(zhuǎn)移到離心管,離心1000轉(zhuǎn)4-5分鐘,棄去上清,加入PBS至一定體積(1MD。3 .將細胞懸液吸出少許,滴加在蓋片邊緣,使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間,靜置3min,注意蓋片下不要有氣泡,也不能讓懸液流入旁邊槽中。4 .計算板四大格細胞總數(shù),壓線細胞只計左側(cè)和上方的。然后按公式計算:細胞數(shù)/mL=0大格細胞總數(shù)/4X104說明:公式中除以4,因為計數(shù)了4個大格的細胞數(shù)。公式中乘以104因為計數(shù)板中每一個大格的體積為:1.0mm(長)x1.0mm(寬)x0.1mm(高)=0.1mm3而1ml=1000mm3(注意:鏡下偶見有兩個以上細胞

9、組成的細胞團,應(yīng)按單個細胞計算,若細胞團10%Z上,說明分散不好,需重新稀釋制備細胞懸液)臺盼蘭染色操作步驟:1、制備細胞懸液,放入EP管中。2、以1:1的比例加入0.4%臺盼蘭染7取,染色23分鐘。3、吸取少許懸液涂于載玻片上,加上蓋片。4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù),計算細胞活力。凍存與復(fù)蘇一、哺乳動物細胞冷凍保存實驗?zāi)康模?1)保存種子細胞,以便隨時取用。這是保存細胞的最主要目的。(2)減少細胞被微生物污染的危險性。(3)減少細胞之間交叉污染的危險性。(4)減少細胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。(5)避免有限細胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉(zhuǎn)化。實驗原理:細胞凍存及復(fù)蘇的基本原

10、則是慢凍快融,實驗證明這樣可以最大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞碉作保護劑,這兩種物質(zhì)能提高細胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外,減少細胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復(fù)蘇細胞應(yīng)采用快速融化的方法,這樣可以保證細胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷。實驗用品:(一)儀器凈化工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱(4C、-20C、-70C)、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。(二)玻璃器皿吸管(彎頭、直頭)、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶(250ml、100ml)、廢液缸;(三)塑料器皿吸頭、槍頭、膠

11、塞、移液管(10ml)、15ml離心管、凍存管(12ml)(四)其他物品微量加樣槍、紅血球計數(shù)板、記號筆、移液槍。(五)試劑1640培養(yǎng)液、DMSO(分析純)K562細胞,慢性粒細胞白血病細胞系中的一種。操作步驟:1 .準備:打開培養(yǎng)液,PBS取出離心管,擰開管蓋,管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管,裝上吸頭,插入離心管備用。2 .配制凍存液:吸取9ML培養(yǎng)液放入離心管,用移液槍吸取1MLDMS潞液,逐滴緩慢加入離心管中。最好把離心管插在冰中。3 .從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞,放在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)、密度。4 .吸出1個孔中的細胞連同培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)入離心管中。再另取一只吸管吸取PBS放入培養(yǎng)板孔中,輕輕

12、吹打孔壁,吸出轉(zhuǎn)入離心管。5 .離心,設(shè)置離心機1000轉(zhuǎn)4-5分鐘。取出離心管,輕輕吸出上清,倒入廢液缸。輕輕吸出余下的培養(yǎng)液,注意勿吸出細胞沉淀。6 .吸取1ML配制好的凍存液加入離心管,與細胞混勻后,轉(zhuǎn)入凍存管。7 .標注:標明細胞種類、凍存日期,凍存人。8 .在4c冰箱中放置30分鐘;然后轉(zhuǎn)入-20C,放置30分鐘;然后再轉(zhuǎn)入-80C放置16-18小時(或過夜);最后放入液氮中長期保存。有條件的地方,可用凍存盒。注意事項:(1)凍存過程需緩慢(2)凍存細胞必須處在對數(shù)生長期,活力大于90%,無微生物污染。(3)細胞濃度控制在:1X1075X107/ml。(4)使用合適的細胞冷凍保護劑,

13、以保護細胞在冷凍過程中免受冰晶破壞。目前,最常用的冷凍保護劑是DMSO:甲基亞碉),使用終濃度為510%。但是,有些細胞系不能用DMSO為冷凍保護劑,如人白血病細胞系HL-60。因為,DMSOTg誘導(dǎo)HL-60細胞分化。在這種情況下,可選用其它冷凍保護劑,如甘油(glycele),羥乙基淀粉等。(5)DMSO釋時會釋放大量熱量。因此,DMSO能直接加到細胞液中,必須事先配制。細胞復(fù)蘇操作步驟:(一)準備工作1、37c水浴2、準備一個內(nèi)裝5-10ml細胞完全培養(yǎng)液離心管。(二)復(fù)蘇1、帶手套,用銀子將細胞冷凍管從液氮中取出,迅速放入37c水浴中,手持凍存管不斷搖動。觀察完全解凍后移入超凈臺。冷凍管在水浴中解凍時,液面不

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