畢業(yè)論文真菌發(fā)酵液對納塔爾鏈霉菌納他霉素產量的影響

1、安 徽 農 業(yè) 大 學畢 業(yè) 論 文（設計）論文題目 真菌發(fā)酵液對納塔爾鏈霉菌納他霉素產量的影響 姓 名學號院 系 _生命科學學院_ 專 業(yè) 生物技術_指導教師 職 稱 講師_中國·合肥二o 13 年 5 月目錄摘要1前言11實驗材料及方法21.1實驗材料 2實驗菌種2培養(yǎng)基21.2實驗方法2納塔爾鏈霉菌的培養(yǎng)2真菌發(fā)酵液的制備 2納他霉素產量的測定2真菌發(fā)酵液添加時間對納他霉素產量的影響2真菌發(fā)酵時間對納他霉素產量的影響2真菌發(fā)酵液添加量對納他霉素產量的影響32結果與分析32.1納他霉素標準曲線的制作32.2發(fā)酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響3產黃青霉發(fā)酵液加入時間對N5菌

2、株納他霉素產量的影響3黑曲霉發(fā)酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響4釀酒酵母發(fā)酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響52.3真菌培養(yǎng)時間對N5菌株納他霉素產量的影響5 產黃青霉培養(yǎng)時間對N5菌株納他霉素產量的影響5黑曲霉培養(yǎng)時間對N5菌株納他霉素產量的影響6釀酒酵母培養(yǎng)時間對N5菌株納他霉素產量的影響62.4真菌發(fā)酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響7產黃青霉發(fā)酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響7黑曲霉發(fā)酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響8釀酒酵母發(fā)酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響83討論與結論9參考文獻 9致謝10英文摘要10真菌發(fā)酵液對納塔爾鏈霉菌納他霉素產量的影響作

3、者：潘 指導教師：曹（安徽農業(yè)大學生命科學學院2009級生物技術1班，學號09121012）摘要：納他霉素是由納塔爾鏈霉菌（streptomyces natalensis）、褐黃孢鏈霉菌（streptomyces gilvosporeus）、恰塔努加鏈霉菌（streptomyces chattanoogensis）等菌株發(fā)酵而產生的一種廣譜抗真菌劑。因其低毒和極小改變食物本身味道可作為生物防腐劑。本實驗通過在納塔爾鏈霉菌N5菌株中添加真菌發(fā)酵液的方法提高菌株納他霉素的產量。實驗結果表明產黃青霉、黑曲霉、釀酒酵母三種菌的發(fā)酵液均對納塔爾鏈霉菌N5菌株的納他霉素產量有明顯的促進作用。產黃青霉和黑曲

4、霉培養(yǎng)1d時，其發(fā)酵液對N5菌株納他霉素的合成促進效果最佳，而釀酒酵母在3d時促進效果最好，此時菌株納他霉素產量較未加真菌發(fā)酵液處理樣品高出約1倍。關鍵詞：納塔爾鏈霉菌N5菌株 納他霉素 產黃青霉 黑曲霉 釀酒酵母前言1955年struyk等人首次從南非natal州土壤中分離得到納塔爾鏈霉菌（streptomyces natalensis），并發(fā)現該菌種可以產生一種內酯類抗生素，strnyk將其命名為匹馬菌素（pimaricin）1，后世界衛(wèi)生組織將其統一命名為納他霉素。該抗生素是一種二十六元多烯大環(huán)內酯類抗生素，主要由納塔爾鏈霉菌（streptomyces natalensis）、褐黃孢鏈霉

5、菌（streptomyces gilvosporeus）、恰塔努加鏈霉菌（streptomyces chattanoogensis）等菌發(fā)酵產生2。納他霉素是一種高效、廣譜的抗真菌劑，能有效抑制霉菌及酵母的生長，并能有效抑制絲狀真菌中黃曲霉素的形成，可廣泛應用于食品保鮮及治療真菌引起的疾病3。由于其分子上的疏水部分可以范德華力與細胞質膜上的甾醇分子結合，形成抗生素甾醇復合物，破壞細胞質膜滲透性，引起菌體細胞內電解質滲出，因而可導致菌體死亡，起到抑菌作用4。納他霉素在室溫下溶解度僅為30-100mg/L，微溶于甲醇，易溶于稀酸、冰醋酸和二甲基甲酰胺，不溶于非極性溶劑5。一般認為，由于納他霉素難溶

6、于水和油脂，所以很難被消化和吸收，因此人體攝入的納他霉素大部分會隨糞便排出6。因為納他霉素具有毒性低和不會對食品天然風味有較大改變的性質，美國食品及藥物管理局(FDA)和我國衛(wèi)生部已經先后于1982年與1997正式批準納他霉素作為食品添加劑。迄今為止納他霉素已經在食品工業(yè)中得到廣泛應用7。由于各種因素的制約，國內納他霉素的主要來源至今仍然是從國外進口。限制我國自主生產納他霉素的主要問題是菌株產量偏低，導致納他霉素的生產成本過高。這已成為急需解決的問題。提高納他霉素產量可以通過添加誘導子的方法。已有報道稱一些微生物的發(fā)酵代謝物可產生某種誘導子調節(jié)其它微生物的次級代謝，促進其次級代謝產物的生成8,

7、9,10。本實驗將產黃青霉、黑曲霉、釀酒酵母的發(fā)酵液分別添加入納塔爾鏈霉菌（streptomyces natalensis）發(fā)酵液中，研究不同真菌發(fā)酵液對該菌株納他霉素產量的影響，以期提高菌株納他霉素產量。1實驗材料與方法1.1實驗材料菌種納塔爾鏈霉菌N5菌株由中國科學院合肥物質科學研究院等離子所提供。黑曲霉、產黃青霉、釀酒酵母由安徽農業(yè)大學生命科學學院微生物學實驗室保藏。培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖20、酵母浸膏5、蛋白胨6、氯化鈉10，pH 7.2發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖10、酵母浸膏5、大豆蛋白胨20、淀粉40，pH7.21.2實驗方法納塔爾鏈霉菌的培養(yǎng)用接種環(huán)刮取斜面菌種

8、一環(huán)于裝有25mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28、 200r/min搖床培養(yǎng)，40h后以9%接種量接種于裝有30mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28、200r/min搖床培養(yǎng) 4d。真菌發(fā)酵液的制備將產黃青霉、黑曲霉、釀酒酵母分別接種于裝有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，28、150r/min搖床培養(yǎng)適當時間，用八層紗布過濾，再在10000r/min下離心15min，取上清液進行微孔濾膜過濾即可得到無菌的真菌發(fā)酵液。納他霉素產量的測定稱取納他霉素標準樣品，溶于5%冰乙酸的甲醇溶液中，使納他霉素濃度分別為1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、

9、7mg/L、8mg/L，用紫外分光光度計測其在303nm處的OD值，以納他霉素濃度為橫坐標，OD303值為縱坐標，繪制標準曲線。取N5菌株發(fā)酵液0.8mL于7.2mL 5%冰乙酸的甲醇溶液中。在震蕩器上震蕩5min后10000r/min離心15min。取上清液用紫外分光光度計測量303nm波長下的吸光度，根據標準曲線計算納他霉素產量。真菌發(fā)酵液添加時間對納他霉素產量的影響將產黃青霉、黑曲霉、釀酒酵母培養(yǎng)3d后分別以5%接種量接種于納塔爾鏈霉菌N5菌株發(fā)酵液中，接種時間分別為0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h，每個處理重復3次，并以不添加真菌發(fā)酵液的處理為對照。培養(yǎng)4d后測定菌

10、株納他霉素產量。確定真菌發(fā)酵液最適添加時間。真菌發(fā)酵時間對納他霉素產量的影響分別在產黃青霉、黑曲霉、釀酒酵母培養(yǎng)1d、2d、3d時取樣，制備無菌發(fā)酵液。將培養(yǎng)不同時間的真菌發(fā)酵液以5%接種量加入培養(yǎng)12h的納塔爾鏈霉菌N5菌株發(fā)酵培養(yǎng)液中，每個處理重復3次，并以不添加真菌發(fā)酵液的處理為對照。繼續(xù)培養(yǎng)84h后測定菌株納他霉素產量。確定3種真菌的最佳發(fā)酵時間。真菌發(fā)酵液添加量對納他霉素產量的影響將產黃青霉、黑曲霉培養(yǎng)1d，釀酒酵母培養(yǎng)3d，制備無菌發(fā)酵液，并分別以1% 、2% 、5% 、8% 、10% 、15% 、20%的添加量加入到培養(yǎng)12h的納塔爾鏈霉菌N5菌株發(fā)酵培養(yǎng)液中，每個處理重復3次并

11、以不添加真菌發(fā)酵液的處理為對照。培繼續(xù)培養(yǎng)84h后測定菌株納他霉素產量。確定3種真菌的最佳發(fā)酵時間。2結果及分析2.1 納他霉素標準曲線的制作以納他霉素濃度為橫坐標，OD303值為縱坐標繪制納他霉素標準曲線，見圖1。由圖1可看出納他霉素濃度與OD303值呈線性相關，且R2=0.9988線性較好。因此可通過此標準曲線方程x=（y0.0065)/0.1489計算納他霉素產量。圖1 納他霉素標準溶液曲線Fig1 The standard curve ofnatamyctn2.2 發(fā)酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響產黃青霉發(fā)酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響將產黃青霉發(fā)酵培養(yǎng)基進行適當處

12、理后接種于培養(yǎng)不同時間的納塔爾鏈霉菌N5菌株發(fā)酵液中，繼續(xù)培養(yǎng)，當菌株培養(yǎng)4d時用紫外分光光度法測定納他霉素產量，結果如圖2所示。由圖2可看出產黃青霉發(fā)酵液對N5菌株納他霉素產量有明顯的促進作用，當在發(fā)酵培養(yǎng)12h時添加效果最佳，此時菌株納他霉素產量達1.42g/L，較對照提高65.96。圖2 產黃青霉發(fā)酵液添加時間對納他霉素產量的影響Fig 2 Effects of addition time of fermentation broth ofPenicillium chrysogenumon the natamycin production of N5 strain黑曲霉發(fā)酵液加入時間對N5

13、菌株納他霉素產量的影響將培養(yǎng)3d的黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)液適當處理后于不同時間添加入N5菌株發(fā)酵培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)，當菌株培養(yǎng)4d時測定納他霉素產量，結果見圖3。從圖3中可以看出黑曲霉發(fā)酵液對N5菌株納他霉素產量的提高有顯著的促進作用。當在發(fā)酵培養(yǎng)12h時添加效果最佳，此時菌株納他霉素產量達1.44g/L，較對照提高67.44。圖3黑曲霉發(fā)酵液添加時間對納他霉素產量的影響Fig 3 Effects of addition time of fermentation broth ofAspergillus Nigeron the natamycin production of N5 strain釀酒酵母發(fā)

14、酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響釀酒酵母發(fā)酵液加入時間對N5菌株納他霉素產量的影響見圖4。由圖可見，釀酒酵母發(fā)酵液也可明顯促進N5菌株納他霉素的合成，最適接入時間也是菌株培養(yǎng)的12h。圖4 釀酒酵母發(fā)酵液添加時間對納他霉素產量的影響Fig 4 Effects of addition time of fermentation broth ofSaccharomyces cerevisiaeon the natamycin production of N5 strain2.3 真菌培養(yǎng)時間對N5菌株納他霉素產量的影響產黃青霉培養(yǎng)時間對N5菌株納他霉素產量的影響將分別培養(yǎng)1d、2d、3d的產

15、黃青霉發(fā)酵液進行適當處理，添加至培養(yǎng)12h的N5菌株發(fā)酵培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)84h后測定菌株納他霉素產量，結果如圖5所示。由圖5可以看出培養(yǎng)1d的產黃青霉發(fā)酵液對N5菌株納他霉素產量的促進作用最顯著。隨著產黃青霉培養(yǎng)時間的延長，發(fā)酵液對N5納他霉素產量的促進作用呈下降趨勢。因此，產黃青霉的最佳培養(yǎng)時間為1d。圖5產黃青霉培養(yǎng)時間對納他霉素產量的影響Fig 5 Effects of culture time of Penicillium chrysogenumon the natamycin production of N5 strain黑曲霉培養(yǎng)時間對N5菌株納他霉素產量的影響 將培養(yǎng)不同時間的

16、黑曲霉發(fā)酵液添加入N5菌株發(fā)酵液中，培養(yǎng)后測定納他霉素產量，結果見圖6。由圖6可以看出當在N5菌株發(fā)酵液中添加培養(yǎng)1d的黑曲霉發(fā)酵液時，納他霉素產量最高，因此，黑曲霉的最佳培養(yǎng)時間確定為1d。圖6黑曲霉培養(yǎng)時間對納他霉素產量的影響Fig 6 Effects of culture time of Aspergillus Nigeron the natamycin production of N5 strain釀酒酵母培養(yǎng)時間對N5菌株納他霉素產量的影響釀酒酵母培養(yǎng)時間對N5菌株納他霉素產量的影響如圖7所示。由圖7可見，當在N5菌株發(fā)酵液中添加培養(yǎng)3d的釀酒酵母發(fā)酵液時，納他霉素產量最高，因此，釀

17、酒酵母的最佳培養(yǎng)時間確定為3d。圖7釀酒酵母培養(yǎng)時間對納他霉素產量的影響Fig 7 Effects of culture time of Saccharomyces cerevisiaeon the natamycin production of N5 strain2.4真菌發(fā)酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響產黃青霉發(fā)酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響將培養(yǎng)1d的產黃青霉發(fā)酵液處理后以不同添加量添加于培養(yǎng)12h的納塔爾鏈霉菌N5菌株發(fā)酵培養(yǎng)液中，于28、200r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)84h，測定納他霉素產量。以產黃青霉發(fā)酵液添加量為橫坐標，納他霉素產量為縱坐標做圖，見圖8。從圖8中可

18、以添加5的產黃青霉發(fā)酵液對N5菌株納他霉素的積累效果最顯著，此時納他霉素產量達1.69g/L，較對照提高94.25%。圖8產黃青霉發(fā)酵液添加量對納他霉素產量的影響的影響Fig 8 Effects of addition amount of Penicillium chrysogenumfermentation brothon the natamycin production of N5 strain黑曲霉發(fā)酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響將培養(yǎng)1d的黑曲霉發(fā)酵液處理后以不同添加量添加于培養(yǎng)12h的納塔爾鏈霉菌N5菌株發(fā)酵培養(yǎng)液中，于28、200r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)84h，測定納他霉素

19、產量結果如圖8所示。由圖可看出5的黑曲霉發(fā)酵液對N5菌株納他霉素的積累效果最佳，因此，黑曲霉發(fā)酵液的最適添加量確定為5。圖9黑曲霉發(fā)酵液添加量對納他霉素產量的影響的影響Fig 9 Effects of addition amount of Aspergillus Nigerfermentation brothonthe natamycin production of N5 strain釀酒酵母發(fā)酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響釀酒酵母發(fā)酵液添加量對N5菌株納他霉素產量的影響見圖10。從圖10中可以看出5的釀酒酵母發(fā)酵液對N5菌株納他霉素的積累效果最佳，因此，黑曲霉發(fā)酵液的最適添加量確定為

20、5。圖10釀酒酵母發(fā)酵液添加量對納他霉素產量的影響的影響Fig 10 Effects of addition amount of Saccharomyces cerevisiae fermentation brothonthe natamycin production of N5 strain3討論與結論 隨著人們對健康、安全問題的日益關注，食品安全問題越來越受到人們的重視，化學防腐劑的缺點逐漸暴露，納他霉素受到人們的青睞。納他霉素是和乳酸鏈球菌素并列的僅有的兩種生物防腐劑，其具有毒性低且不會造成食品風味巨大改變的特性，是一種極具有使用、生產價值的抗生素。但納他霉素產生菌株產量不高一直是我國納

21、他霉素自主生產的瓶頸，過低的單株產量會使生產成本過高而不利于工廠生產。本實驗將產黃青霉、黑曲霉、釀酒酵母發(fā)酵液添加入納塔爾鏈霉菌N5菌株發(fā)酵液中，研究這3種真菌培養(yǎng)時間、發(fā)酵液添加時間及添加量對N5菌株納他霉素產量的影響，以促進菌株納他霉素的合成。實驗結果表明這三種真菌的發(fā)酵液均對納塔爾鏈霉菌N5菌株的納他霉素產量有明顯促進作用。產黃青霉和黑曲霉培養(yǎng)1d時，其發(fā)酵液對N5菌株納他霉素的合成促進效果最佳，而釀酒酵母在3d時促進效果最好。三種真菌最佳發(fā)酵液添加時間及添加量均為12h和5。具體這些真菌發(fā)酵液中何種因素對N5菌株納他霉素生產起到促進作用還不清楚，有待于進一步實驗研究。參考文獻1 Mar

22、ta V Mendes ，sedef Tunca ，Nuria Anton et al The two-component phoR-phoP system of streptomyces natalensis ;inactivation or deletion of phoP reduces the negative phosphate regulation of pimaricin biosynthesis metabolic engineering 2007 ,9 (2)：217227；2 PEDERSEN J C Natamycin as a fungicide imager medi

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25、敏銳洞察力，對學術思想的重視，對選題和研究內容的嚴格要求，以及對論文工作中遇到的關鍵問題和疑難問題的指導使我受益匪淺。她對試驗的研究態(tài)度和嚴謹的工作作風給予我今后的學習和工作很深的啟示。同時我還要感謝一起做實驗的同學，他們在我的實驗過程中給了我很大的幫助。The effect of fungusfermentedliquidontheoutputof Streptomyces natalensisnatamycinAuthor: instructor: (2009 College of life science of Anhui agricultural University-level biotechnology class 1, 09121012,)Abstract:Natamycin is a broad-spectrum antifungal agent generated by the fermentation of the streptomyces natalensis,streptomyces gilvosporeus,streptomyces chattanoogensis and other strains.It can be used